CN115261345A - 一种原核表达hi0854蛋白的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种原核表达HI0854蛋白的纯化方法，包括：获取流感嗜血杆菌的菌液，利用超声法破菌得到菌体内的可溶性蛋白液，低温离心，提取上清液；以0.5‑1ml/min的流速上样于预先平衡的纯化柱，低温静置，用Lysis buffer B洗柱直至紫外吸收读数下降至稳定，用10倍柱体积Wash buffer将柱子内非特异性结合的蛋白洗去，使用Elution buffer洗脱HI0854蛋白，上完一个柱体积后静置，以流速1‑2ml/min洗脱HI0854蛋白，收集洗脱液得到初步纯化的蛋白；通过离子交换柱Hitrap Q HP除去DNA干扰，利用浓缩管浓缩后上分子筛预装柱Hiload 16/60Superdex 200柱均一蛋白后得到蛋白纯度为99％，DNA污染低于水平的HI0854蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白纯化技术，具体为一种原核表达HI0854蛋白的纯化方法。
背景技术
流感嗜血杆菌是一种只侵犯人类的，定植于呼吸道的条件致病菌。该菌可侵入血液导致多种感染性疾病，所致呼吸道感染已成为全球普遍关注的问题。近年来由于抗菌药物的广泛使用，流感嗜血杆菌作为条件致病菌引起的感染率持续增加，特别容易发生在儿童和老年人中，有病毒感染、使用免疫抑制剂、外界侵入性操作等造成机体免疫力低下后引起严重感染，如脑膜炎、菌血症、急性鼻窦炎、社区获得性肺炎、急性中耳炎等。在社区获得性肺炎中流感嗜血杆菌是仅次于肺炎链球菌的常见病原菌。氨苄西林和环丙沙星是呼吸道感染的最常用的经验药物。世界各地对流感嗜血杆菌的耐药监测中，氨苄西林和复方新诺明耐药率不断上升。β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药流感嗜血杆菌的检出率也在上升。找到新的药物靶点成为亟待解决的目标。
文献调研发现，预测为流感嗜血杆菌血红素氧化酶的HI0854与我们研究发现的幽门螺杆菌血红素氧化酶hugz,空肠弯曲菌chuz分别有46％和49％的同源性，且hugZ与Chuz在幽门螺杆菌和空肠弯曲菌的定植，生长都有着至关重要的作用。能否高效获取血红素铁是细菌能否在宿主体内定植感染的前提条件之一。
HI0854蛋白可以引起机体产生细胞免疫，从而达到抗原保护作用，但是，现有技术中蛋白尚未有已知纯化方法，传统使用的蛋白纯度低、核酸含量高、稳定性不好，不便于后续工作的顺利进行。
发明内容
本发明为了解决现有HI0854蛋白制备技术中存在的蛋白获得纯度低，核酸含量高、稳定性不好的这些问题，提供了一种原核表达HI0854蛋白的纯化方法，包括：
获取流感嗜血杆菌的菌液，利用超声法破菌得到菌体内的可溶性蛋白液，低温离心，提取上清液；
以0.5-1ml/min的流速上样于预先平衡的纯化柱，低温静置，用Lysis buffer B洗柱直至紫外吸收读数下降至稳定，用10倍柱体积Wash buffer将柱子内非特异性结合的蛋白洗去，使用Elution buffer洗脱HI0854蛋白，上完一个柱体积后静置，以流速1-2ml/min洗脱HI0854蛋白，收集洗脱液得到初步纯化的蛋白；
通过离子交换柱Hitrap Q HP除去DNA干扰，利用浓缩管浓缩后上分子筛预装柱Hiload 16/60Superdex 200柱均一蛋白后得到蛋白纯度为99％的HI0854蛋白。
利用超声法破菌得到菌体内的可溶性蛋白液，低温离心，提取上清液，包括：
将流感嗜血杆菌的菌液在4～6℃离心，收集菌体表达HI0854蛋白的细菌培养物，取菌体沉淀于预冷的Lysis buffer A重悬，利用涡旋振荡器振动和移液器反复吸吹悬浮菌体，加入溶菌酶，冰上搅拌，表面得到粘稠状的细菌细胞壁分解产物；
加入蛋白酶抑制剂PMSF，使用超声波细胞破碎机裂解细胞，得到包含可溶性蛋白的细菌裂解液，离心，提取上清液。
进一步，通过离子交换柱Hitrap Q HP 5ml除去DNA干扰之前，还包括：
将HI0854蛋白溶液进行浓缩，脱盐，上样进入柱子，用Tris pH8.0，150ml NaCl洗脱，收集HI0854蛋白。
进一步，通过离子交换柱Hitrap Q HP 5ml除去DNA干扰，包括：
用交换柱Hitrap Q HP 5ml，流速4ml/min，buffer A:20mM Tris pH8.0；B:20mMTris pH8.0；1M NaCl；梯度：在前30个CV内B液浓度比例0％→50％，后10CV，B 50％→100％；收集洗脱体积在10ml至30ml内的蛋白组分，除掉黏附的DNA。
进一步，利用浓缩管浓缩后上分子筛预装柱Hiload 16/60Superdex 200柱均一蛋白后得到蛋白纯度为99％，DNA污染低于水平的HI0854蛋白，包括：
用buffer稀释20倍，记录230nm-800nm的吸收光谱，测量260nm、280nm波长的光吸收，溶液经离心超滤浓缩管离心浓缩后过过分子筛Hiload 16/60Superdex200 prepgrade，buffer 20mM Tris pH8.0，以流速1ml/min上样洗脱，收集位置在75ml的蛋白峰组分，得到纯化后的HI0854蛋白。
本发明实施例的有益效果是：本发明为超声法破菌获得可溶性蛋白，低温离心后获得上清。以0.5-1ml/min的流速上样于预先用4度lysis buffer A平衡好的5ML Ni2+-NTA纯化柱，低温静置30min，然后用2倍柱体积的Lysis buffer B洗柱，保持流速在0.5-1ml/min，将纯化柱上的未结合样品洗去，用10倍柱体积Wash buffer洗杂，洗涤过程中保持流速在0.5-1ml/min，用流速在0.5-1ml/min上样1倍柱体积的Elution buffer静置20min然后用流速1-2ml/min洗脱，收集洗脱液得到初步纯化的蛋白后，过离子交换柱Hitrap Q HP 5ml以除去DNA干扰后，后浓缩管浓缩后上分子筛预装柱Hiload 16/60Superdex 200柱均一蛋白后得到蛋白纯度为99％，DNA污染低于水平的目标蛋白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的实施例提供的一种HI0854蛋白纯化后的示意图；
图2为本发明的实施例提供的另一种HI0854蛋白纯化后的示意图；
图3为本发明的实施例提供的纯化好的HI0854-hemin进行了吸收光谱的测定图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例使用Ni2+-NTA亲和柱，采用、咪唑梯度洗除杂蛋白，洗脱目的蛋白，脱盐以及离子交换层析、分子筛层析的方法探究原核表达HI0854蛋白适宜的纯化条件。
主要试剂：Ni2+-NTA(Novagen，5ml)，BCA蛋白定量试剂盒为博士德产品。丙烯酰胺、N、N′-甲叉双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)为Sigma公司产品，蛋白上样缓冲液、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相对低分子质量标准蛋白质为碧云天产品。
实验中使用试剂及缓冲液的配制：
(1)Lysis buffer A：(pH8，每L)
PBS：5mM imidazole
(2)Lysis buffer B：(pH8，每L)
PBS：10mM imidazole
(3)Wash buffer A：(pH8，每L)
PBS：20mM imidazoleElution buffer A2：(pH8，每L)
PBS：100mM imidazole
实验方法
1、样品准备
(1)菌液于4℃4000rpm离心30min(Hitachi,himac CRT,rotor R5S2)收集菌体表达HI0854蛋白的细菌培养物(OD600＝1.5-3.0)。
(2)倒去上层培养基后，菌体沉淀用30ML冰预冷的Lysis buffer A重悬菌体，利用涡旋振荡器振动和移液器反复吸吹充分悬浮菌体，加入溶菌酶lysozyme(BBI)15mg，使其终浓度在0.5mg/ml，冰上搅拌约30min，此时溶液表面出现粘稠状的细菌细胞壁分解产物。
(3)向溶液中加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度1mM，使用超声波细胞破碎机裂解细胞(宁波新芝，JY92-IIN)，工作参数设为功率200W，工作时间4s，间隔时间10s，重复次数99次。
(4)把细菌裂解液转移至离心管中，在4℃以24000g RCF高速离心30min，保留上清可溶性部分。
(5)以0.5-1ml/min的流速上样于预先平衡好的纯化柱(10倍柱体积Lysis bufferA平衡)室温静置30min
(6)Lysis buffer B走柱子直到紫外吸收读数下降至稳定。
(7)用10倍柱体积Wash buffer，将柱子内非特异性结合的蛋白充分洗去，洗涤过程中保持流速在1-2ml/min
(8)接着使用Elution buffer洗脱HI0854，上完一个柱体积(5ml)后放置20min,保持流速在1-2ml/min洗脱目标蛋白。密切注意紫外吸收上升过程，及时收集流出的蛋白组分，最后能收集大约15ml的蛋白溶液。
2、脱盐纯化
(1)蛋白溶液转入离心超滤浓缩管(Millipore,Amicon Ultra-15,10K NMWL)，2100g RCF离心浓缩至2ml。
(2)用50mM Tris pH8.0,150mM NaCl平衡脱盐柱Hitrap Desalting 5ml×4(GEHealthcare)，
(3)浓缩样品以流速1ml/min上样进入柱子，用50mM Tris pH8.0,150mM NaCl洗脱，收集蛋白约有6ml，，实现除去imidazole，更换缓冲液的目的。因为Imidazole会干扰HI0854与hemin的结合，使hemin沉淀，所以需要除去
(4)使用Hitrap Q 5ml，流速4ml/min，buffer A:20mM Tris pH8.0；B:20mM TrispH8.0,1M NaCl，梯度：在前30个CV(柱体积，5ml)内B液浓度比例0％→50％，后10CV，B 50％→100％。收集洗脱体积在10ml至30ml内的蛋白组分，其主要成分就是HI0854。通过着个方法能除掉黏附的DNA。
(5)收集到约5ml蛋白溶液，取50μl用buffer稀释20倍，记录230nm-800nm的吸收光谱，测量260nm、280nm波长的光吸收，溶液经离心超滤浓缩管(Millipore,Amicon Ultra-15,10K NMWL)，2100g RCF离心浓缩后过分子筛Hiload 16/60Superdex200 prep grade，buffer 20mM Tris pH8.0，以流速1ml/min上样洗脱，收集位置在75ml的蛋白峰组分。
(6)按照BCA蛋白定量试剂盒说明方法检测蛋白浓度，并行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析：
①安装玻璃板，按照表中的数值配制一定体积的分离胶溶液和积层胶溶液，并分别灌注：
SDS-PAGE凝胶配方
②上样：取20μl样品与5μl 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀，煮沸10min。上样于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。③80V恒压电泳约30min，待溴酚蓝前沿进入分离胶后将电压提高至120V，恒压电泳约1.5h，直至溴酚蓝到达分离胶底部停止电泳。④凝胶进行考马斯亮蓝染色2h，脱色8h，于凝胶成像系统上进行观察分析。实验结果如下：
(1)蛋白浓度检测：经紫外分光法检测，Elution buffer洗脱后所得总蛋白浓度分别为15mg/ml。
(2)蛋白纯度检测经SDS-PAGE凝胶电泳分析，Elution buffer洗脱后，基本无目的蛋白洗脱。Elution buffer洗脱后得到纯度约89％的目的蛋白。
(3)Hitrap Desalting纯化后损失约10％，再用Hitrap Q纯化后用紫外分光光度计记录280nm/245nm的紫外吸收光度值，若280nm/245nm〉则认为除去了DNA的干扰。
为获得能够结晶的蛋白，需要将其与血红素进行结合，观察与血红素结合才能完整地反映其结构特征，由此将纯化后的蛋白按摩尔比HI0854：hemin＝1:2混合。用50mMTris pH8.0,100mMNaCl将5mM hemin储液稀释至0.1mM，然后加入HI0854溶液至终浓度0.05mM，低温避光过夜轻微旋转混合。经过24000g RCF高速离心，上清部分用浓缩管浓缩至1ml。
上样至20mM Tris pH8.0平衡好的分子筛Hiload 16/60Superdex200 prepgrade，监视吸光度波长410nm和280nm，流速1ml/min，收集出峰体积为77ml附近的蛋白峰组分，当A410/A280>3时可以认为hemin已将ChuZ饱和。使用超滤管浓HI0854-hemin至300，取5μl稀释200倍至1ml，测量250nm-800nm的吸收光谱和A412处值。如图1和图2所示。
为检测是否有生物学活性，即作为血红素氧化酶对血红素的降解能力，做了ChuZ酶活检测：
为了确保用于结晶的蛋白拥有足够的酶活力，对纯化好的HI0854-hemin进行了吸收光谱的测定，这样检查用于结晶实验的ChuZ的质量。如图3所示，波峰处的吸光度随时间降低，并且峰顶的位置发生蓝移，从412nm过渡到400nm，同时α和β峰下降至消失，在660nm形成了较宽的峰形。从吸收光谱图3看，在412nm处有一尖锐的Soret峰，在575nm的峰对应αband，540nm处有个较小的峰对应βband。表明在pH8.0条件下，HI0854-hemin呈现典型的HO结合底物后的光谱特征，HI0854-hemin中的血红素铁处于六配位的低自旋状态。采用了如下反应体系检查ChuZ的血红素氧合酶活性：在1ml的比色皿中将HI0854-hemin用20mM TrispH8.0稀释至10μM，为了避免由于偶联氧化造成的非酶催化的血红素降解，加入了500U过氧化氢酶(bovine liver)，从图3可以看出，在加入抗坏血酸后，在Soret peak处的吸光度随时间降低，并且峰顶的位置发生蓝移，从412nm过渡到400nm，同时α和β峰下降至消失，在660nm形成了较宽的峰形。hemin逐渐被转化成biliverdin。以上的实验充分的验证了用于结晶的HI0854是有酶活性的HO，最终解析的结构能真实的反映HI0854和hemin结合的状态。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种原核表达HI0854蛋白的纯化方法，其特征在于，包括：
获取流感嗜血杆菌的菌液，利用超声法破菌得到菌体内的可溶性蛋白液，低温离心，提取上清液；
以0.5-1ml/min的流速上样于预先平衡的纯化柱，低温静置，用Lysis buffer B洗柱直至紫外吸收读数下降至稳定，用10倍柱体积Wash buffer将柱子内非特异性结合的蛋白洗去，使用Elution buffer洗脱HI0854蛋白，上完一个柱体积后静置，以流速1-2ml/min洗脱HI0854蛋白，收集洗脱液得到初步纯化的蛋白；
通过离子交换柱Hitrap Q HP除去DNA干扰，利用浓缩管浓缩后上分子筛预装柱Hiload16/60Superdex 200柱均一蛋白后得到蛋白纯度为99％的HI0854蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，利用超声法破菌得到菌体内的可溶性蛋白液，低温离心，提取上清液，包括：
将流感嗜血杆菌的菌液在4～6℃离心，收集菌体表达HI0854蛋白的细菌培养物，取菌体沉淀于预冷的Lysis buffer A重悬，利用涡旋振荡器振动和移液器反复吸吹悬浮菌体，加入溶菌酶，冰上搅拌，表面得到粘稠状的细菌细胞壁分解产物；
加入蛋白酶抑制剂PMSF，使用超声波细胞破碎机裂解细胞，得到包含可溶性蛋白的细菌裂解液，离心，提取上清液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，通过离子交换柱Hitrap Q HP 5ml除去DNA干扰之前，还包括：
将HI0854蛋白溶液进行浓缩，脱盐，上样进入柱子，用Tris pH8.0，150ml NaCl洗脱，收集HI0854蛋白。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，通过离子交换柱Hitrap Q HP 5ml除去DNA干扰，包括：
用交换柱Hitrap Q HP 5ml，流速4ml/min，buffer A:20mM Tris pH8.0；B:20mM TrispH8.0；1M NaCl；梯度：在前30个CV内B液浓度比例0％→50％，后10CV，B 50％→100％；收集洗脱体积在10ml至30ml内的蛋白组分，除掉黏附的DNA。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，利用浓缩管浓缩后上分子筛预装柱Hiload 16/60Superdex 200柱均一蛋白后得到蛋白纯度为99％，DNA污染低于水平的HI0854蛋白，包括：
用buffer稀释20倍，记录230nm-800nm的吸收光谱，测量260nm、280nm波长的光吸收，溶液经离心超滤浓缩管离心浓缩后过过分子筛Hiload 16/60Superdex200 prep grade，buffer 20mM Tris pH8.0，以流速1ml/min上样洗脱，收集位置在75ml的蛋白峰组分，得到纯化后的HI0854蛋白。
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