JP2013519396A - 複雑なマトリックスからの核酸抽出 - Google Patents
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Abstract
本開示は、大便サンプル及び水サンプルのような複雑なマトリックスからＤＮＡやＲＮＡのような核酸を抽出するための、吸着剤及び模範的な手順を記載する。前記吸着剤は、ポリビニルピロリドン、デキストラン、又はココナッツ小麦のような材料で被覆された活性炭である。前記吸着剤はマイクロ遠心分離スピンカラム中で使用され、保存液中にスラリーとして存在してもよい。前記サンプルは、バッファー溶液中でボルテックスし、遠心分離し、上清にタンパク質分解酵素を添加し、被覆活性炭を含むマイクロ遠心分離スピンカラムに前記上清を通すことによって調整されてもよい。バッファー、タンパク質分解酵素、及びスピンカラムを含む主要な構成要素をキットに詰めてもよい。
【選択図】図１
【選択図】図１
Description
（合衆国の利益）
米国政府は米国特許第 1 U01 AI075396-01号に準拠して本発明における権利を認め得る。
米国政府は米国特許第 1 U01 AI075396-01号に準拠して本発明における権利を認め得る。
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年２月１６日に出願された米国仮出願第61/304,913号に基づく優先権を35 U.S.C. §119(e)規定に基づいて主張し、その開示は参照によりその全体が本出願に明白に組み込まれる。
本出願は、２０１０年２月１６日に出願された米国仮出願第61/304,913号に基づく優先権を35 U.S.C. §119(e)規定に基づいて主張し、その開示は参照によりその全体が本出願に明白に組み込まれる。
本発明は、例えばヒト試料及び環境サンプルのような試料からDNA及びRNAを含む核酸全体を精製する方法に広く向けられている。ヒト試料の例は、例示目的のみとして、大便、組織、尿、及び他の試料を含む。環境サンプルの例は、例示目的のみとして、水、土壌（soil）、及び他のサンプルを含む。本発明はまた、農学試料、獣医学試料、食物試料及び核酸サンプルを抽出し得るいかなる他のサンプルにも適用できる。本発明は、より具体的には、新規な一群の素材（collection of material）及びその使用手順に向けられている。
ヒト大便試料は一般に臨床検査において用いられ、結腸直腸癌並びにウイルス、細菌及び原虫感染を含む多くの病気が診断される。米国においては毎年、全体で、６１０万超のインビトロ診断（IVD）試験が大便で行われていると見積もられている。これらの試験のほとんどが直接顕微鏡検査、培養、又は免疫検査のような成熟した技術を用いている。しかしながら、アデノウイルス（adenovirus）、エンテロウイルス（enterovirus）、ノロウイルス（norovirus）、ロタウイルス（rotavirus）、大腸菌（E. coli）、及びクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）を含むより多くの病原菌が分子法を用いて現在確認されている。
大便は、多数のタンパク質、多糖、及びほとんどの分子アッセイの中心でPCRアッセイを阻害する小分子を含む、複雑なマトリックスである。そのため、研究室スタッフは分子分析に先だって大便試料のDNA及び／又はRNA含有物を分離しなければならない。大便からのDNA抽出のためのいくつかの商品が存在する。そのうち最もよく知られているのは、Qiagen社が製造しているQuiamp Stool DNAミニキットである。この製品は、細胞溶解、阻害物質吸着、及びタンパク質消化のいくつかの段階を通して大便を処理してから、遠心分離スピンカラムを用いる最終ＤＮＡ分離物の回収及び洗浄をすることを利用者に求めている。結果として得られるＤＮＡはほとんどの応用に適応する。しかしながら、抽出過程が長く、複雑であり、かつサンプルの交差汚染の危険が増大する。別の手段は、Roche Applied Science社が製造しているMagNA Pureライン装置（MagNA Pure line of instrument）のような自動DNA抽出装置の使用である。しかしながら、これらの装置は相当な資本投資及び大便の使用のための追加の前処理工程を必要とする。
従って、より早い、より複雑でない、の少なくともどちらかであり、資本投資を減らし、かつより少ない前処理を要する、資料からのDNA及び／又はRNAの精製の差し迫った必要が存在する。
本発明は前記の必要を満たし、速さ、感度、再現性及びここでの議論から明白な他の利点の著しい改善を生じる分子法を用いてクリプトスポリジウム（Cryptosporidium）及びジアルジア（Giardia）種などの検出を可能にする。
本発明は、ヒト試料からDNA及びRNAを含む核酸全体を精製する方法を含む。例えば、土壌サンプル、水サンプル、獣医学サンプル、農学サンプル、及び食物サンプルを含む他のタイプの試料も検討される。本発明は新規な素材集及び使用手順を含む。核酸抽出手順は二つの工程（part）を含んでよい。
第一工程の間に、サンプルをバッファー中で均質化し、短い遠心分離によって透明にする。次に、タンパク質分解酵素を用いて、懸濁された細胞の溶解及びサンプル中に存在するあらゆるＰＣＲ阻害タンパク質の分解を行う。
第二工程の間に、消化されたサンプルを新規な吸着剤を含むマイクロ遠心分離カラムに通す。この吸着剤は、サンプルから小分子PCR阻害物質を除去するポリビニルピロリドンに被覆された活性炭を含み、精製されたDNAがカラムを通って収集チューブへ流れるようにする。
本発明の一つの特徴によると、サンプルからの核酸抽出方法は、バッファー中でサンプルの一部を均質化し、前記均質化されたサンプルを遠心分離してペレット（pellet）及び上清を産生し、前記上清をペレットから分離し、前記上清にタンパク質分解酵素を添加し、前記上清を被覆活性炭を含む吸着剤に通すことを含む。
前記サンプルは大便サンプル、組織サンプル、尿サンプル、血液サンプル、水サンプル、土壌サンプル、農学サンプル、獣医学サンプル、又は食物サンプルの一つであってよい。前記サンプルは０．２ｇの質量又は０．２μＬの体積を有してもよい。前期上清を含んでもよい。前期活性炭は、ポリビニルピロリドン、デキストラン、又はココナッツ小麦（flour）で被覆されてよい。前期被覆活性炭は、活性炭のスラリーとして存在してもよい。前記スラリーの質量／体積比は約５％〜約２０％であってよく、前記スラリーは約１％〜約１０％質量／体積の被覆材料を含んでよく、前記被覆材料はポリビニルピロリドン、デキストラン、又はココナッツ小麦の一つであってよい。
本発明の更なる特徴によると、サンプルから核酸を抽出するためのキットは、バッファー溶液の容器、タンパク質分解酵素の容器、及び一つ以上のスピンカラムを含む。前記スピンカラムは被覆活性炭を含む。
被覆活性炭は、活性炭のスラリーを含んでもよい。前記活性炭はポリビニルピロリドン、デキストラン、又はココナッツ小麦で被覆されてよい。前期スラリーの質量／体積比は約５％〜約２０％でよく、前記スラリーは約１％〜約１０％質量／体積の、ポリビニルピロリドン、デキストラン、又はココナッツ小麦の一つであってよい被覆材料を含んでよい。前記バッファー溶液を用いて、バッファー中にサンプルの一部を入れてボルテックス（vortex）するときにサンプルを均質化してもよい。被覆活性炭を用いて汚染物質を結合し、核酸を結合せずにいてよい。
本発明の更なる特徴によると、吸着剤は被覆材料で被覆された活性炭のスラリーを含む。前記スラリーの質量／体積比は約５％〜約２０％であってよく、前記スラリーは約１％〜約１０％質量／体積の、ポリビニルピロリドン、デキストラン、又はココナッツ小麦の一つであってよい被覆材料を含んでよい。マイクロ遠心分離カラムは、保存液中に吸着剤を含んでよい。前記保存液は約０．１％〜約１０％の質量／体積比の被覆材料を含んでよい。
本発明の更なる特徴、利点、及び態様は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲に述べられており、又はそこから明白である。更に、上記本発明の概要及び下記詳細な説明は共に模範であり、主張する本発明の範囲を制限することなく更なる説明を提供することが意図されている。
本発明の更なる理解を与えるために含まれる添付図面は、本願明細書に組み込まれ、又は本願明細書の一部を構成し、本発明の態様を図解し、詳細な説明と共に本発明の原理を説明する役目をする。本発明及び本発明を実施し得る様々な方法の基本的な理解のために必要とされるであろうよりも詳細に本発明の構造的な詳細を示すための試みはなされない。
本発明の態様、様々な特徴及び有利な詳細は、以下の記載において記述され、詳述される非限定的な態様及び例への言及によってより十分に説明される。一つの態様の特徴は、たとえこの中で明白に述べていなくても、熟練工が認識するであろうように他の態様に採用されてもよい。本発明の態様を不必要にわかりにくくしないために、周知の成分及び処理技術の記載は省略されてもよい。この中で使用されている例は単に、本発明が実施される方法の理解を容易にすること及び当業者が本発明の態様をさらに実施可能とすることを意図されている。従って、この中の例及び態様は本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及び適用される法律によってのみ定義される。
核酸抽出手順は以下の工程を含んでもよい。
サンプルをバッファー中で均質化し、短い遠心分離によって透明にしてもよい。次にタンパク質分解酵素を使用して懸濁された細胞を溶解し、サンプル中に存在するあらゆるPCR阻害物質を分解してもよい。しかしながら、本発明における使用のために他の酵素が検討される。
消化されたサンプルを、新規な吸着剤を含む遠心分離カラムに通してもよい。この吸着剤は、小分子PCR阻害物質をサンプルから除去して精製された核酸がカラムを通って回収チューブへ流れるようにする、ポリビニルピロリドンで被覆された活性炭を含んでもよい。他の吸着剤が検討され、それらは本発明の精神及び範囲内にある。
以下の構成要素を含む関連する抽出製品が売り出されてもよい。
・２５〜５０ｍＬのバッファーを含む１つの６０ｍｌボトル
・１００〜２６０μＬの酵素を含む１つのマイクロ遠心分離チューブ
・５０個のマイクロ遠心分離スピンカラムを含む、１つの再シール可能なプラスチック袋。
・２５〜５０ｍＬのバッファーを含む１つの６０ｍｌボトル
・１００〜２６０μＬの酵素を含む１つのマイクロ遠心分離チューブ
・５０個のマイクロ遠心分離スピンカラムを含む、１つの再シール可能なプラスチック袋。
これらの構成要素を以下の例示的な手順において使用して、複数の０．２ｇ又は０．２μＬのヒト大便試料からDNAを抽出してもよい。
１．０．２ｇ又は０．２μＬの大便試料を遠心分離チューブへ入れる。
２．０．５ｍｌのバッファーをチューブに加える。２分間又はサンプルが完全に均質化されるまでチューブをボルテックスする。
３．チューブを２００×ｇで３０秒間遠心分離して、固形物をペレット化する。
４．それぞれのサンプル上清の４５μＬをきれいなマイクロ遠心分離チューブに移す。
５．５μＬの酵素をそれぞれのサンプルに加える。簡単に混合する。
６．サンプルを７５℃で１５分間インキュベートして細胞を溶解し、タンパク質阻害剤（protein inhibitor）を消化する。
７．サンプルのインキュベーションの間、適切な数のスピンカラムを新しいマイクロ遠心分離チューブにセットする。カラムを８０００×ｇで３分間遠心分離し、保存液を除去する。カラムを新しいマイクロ遠心分離チューブにセットする。
８．インキュベーションの後、消化されたサンプルを準備したスピンカラムの上部に移す。
９．スピンカラムを８０００×ｇで１分間遠心分離し、DNA抽出物をマイクロ遠心分離チューブの底に流し出す。
１．０．２ｇ又は０．２μＬの大便試料を遠心分離チューブへ入れる。
２．０．５ｍｌのバッファーをチューブに加える。２分間又はサンプルが完全に均質化されるまでチューブをボルテックスする。
３．チューブを２００×ｇで３０秒間遠心分離して、固形物をペレット化する。
４．それぞれのサンプル上清の４５μＬをきれいなマイクロ遠心分離チューブに移す。
５．５μＬの酵素をそれぞれのサンプルに加える。簡単に混合する。
６．サンプルを７５℃で１５分間インキュベートして細胞を溶解し、タンパク質阻害剤（protein inhibitor）を消化する。
７．サンプルのインキュベーションの間、適切な数のスピンカラムを新しいマイクロ遠心分離チューブにセットする。カラムを８０００×ｇで３分間遠心分離し、保存液を除去する。カラムを新しいマイクロ遠心分離チューブにセットする。
８．インキュベーションの後、消化されたサンプルを準備したスピンカラムの上部に移す。
９．スピンカラムを８０００×ｇで１分間遠心分離し、DNA抽出物をマイクロ遠心分離チューブの底に流し出す。
上記の時間及び量は例示的なものである。本発明によって検討されるように、より多い又はより少ない上記工程と共に、別の時間及び量が用いられてもよい。
バッファー及びタンパク質分解酵素を使用して懸濁された細胞を溶解し、サンプル中に存在するあらゆるPCR阻害物質を分解してもよい。空のマイクロ遠心分離カラム及びキャップが第三者である供給メーカーから提供されてもよい。
マイクロ遠心分離カラム内に含まれる吸着剤は、５〜２０％質量／体積（ｗ／ｖ）の保存液中の活性炭（１００〜４００メッシュ）のスラリーを含んでもよい。スラリーは、０．１〜１０％ｗ／ｖのHEPES及び／又は被覆材料を含む蒸留水中に調製されてもよい。適切な被覆材料は、ポリビニルピロリドン、デキストラン、ココナッツ小麦などを含む。
ポリビニルピロリドンを使用して１〜１０％（ｖ／ｖ）で活性炭を被覆し、７．０〜８．０の範囲の適切なｐHに調製した。被覆活性炭は汚染物質及び他のPCR阻害物質に効果的に結合し、核酸をそのままにして結合しない。図２に示されるように、非被覆炭のDNA及びフミン酸吸着量は炭の量の増加につれて増加する。しかしながら、ポリビニルピロリドンで活性炭を被覆したときは、フミン酸吸着量は非被覆炭と同様のままであるが、DNA吸着量は減少する。
本発明は、製造メーカー推奨の微生物DNA抽出用の手順を用いて、QIAamp Stool DNAミニキットを対照として評価した。６つの０．２ｇのヒト大便サンプルを約１×１０5のクリプトスポリジウム・パルバム及びランブル鞭毛虫（Giardia oamblia）と共にスパイク（spike）した。サンプルを−２０℃で５ヶ月保存した。３サンプルを本発明を用いて処理し、残り３サンプルをQIAamp方法を用いて処理した。精製DNA抽出をクリプトスポリジウム又はジアルジアのゲノムDNAに特異的なインハウスＰＣＲ分析（in-house PCR assay）を使用して分析した。以下の結果が得られた。
本発明及びQIAampの再現性は、６つのCt値間で１０％未満の%CVで比較できた。本発明及びQIAamp抽出物の抽出物安定性は、２週間−２０℃で保存した後に得られるΔCtによって試験した。いずれの方法を用いて得られた抽出物にも大きな差はなかった。
本発明及びQIAampの再現性は、６つのCt値間で１０％未満の%CVで比較できた。本発明及びQIAamp抽出物の抽出物安定性は、２週間−２０℃で保存した後に得られるΔCtによって試験した。いずれの方法を用いて得られた抽出物にも大きな差はなかった。
DNA収量は、蛍光シグナルが基準線より上に上がる反応サイクルの推定値を示すPCRサイクル閾値（Ct)によって提供されることに留意する。より低いCt値はサンプル中により多くの標的DNAが存在することを示す。
本発明は、QIAamp方法と同等又はより良いDNAの質及び量を提供し、かつ、QIAamp方法よりもより少ない工程及び少ない時間を要した。
本発明はまた、Kingfisher自動装置（platform）でのAmbion MagMax-96 Viral RNAキットを対照として試験された。両方のプロトコル（protocol）を用いて、１０個の臨床の大便試料においてノロウイルスＲＮＡを抽出し、抽出物をLightCycler装置でＰＣＲ増幅により分析した。
以下の結果が得られた。
本発明は、高いＲＮＡの質及び量を実現する。いくつかの場合では、本発明は自動Kingfisher抽出方法よりも優れている。
本発明は、MoBio Laboratories社が製造するUltraClean（著作権）土壌DNA単離キットを対照として、地上水及び下水で試験された。１０Ｌ及び１Ｌの水をEnvirocheck及び遠心分離技術によって濃縮した。本発明及びMoBio製品の両方をそれぞれ用いて、ＤＮＡ抽出をそれぞれのサンプルについて繰り返し行った。iCycler (Biorad社)装置でSYBR Greenを用いて三重増幅（triplicate amplification）をＤＮＡ抽出物ごとに行った。
以下の結果が得られた。
本発明はＤＮＡの質及び量の両方においてMoBio社製品よりも優れている。
本発明は例示的な態様の観点から記載されてきたが、当業者は本発明が添付された特許請求の範囲の精神及び範囲において変更して実施され得ることを認識するであろう。これらの上記の例は単に説明のためのものであり、本発明の全ての可能な設計、リスト、態様、適用又は変更の完全なリストを意味するものではない。
Claims (22)
- サンプルから核酸を抽出する方法であって、
バッファー中においてサンプルの少なくとも一部を均質化する工程、
前記均質化されたサンプルを遠心分離して、前記遠心分離によりペレット及び上清を生じる工程、
前記上清を前記ペレットから分離する工程、
前記上清にタンパク質分解酵素を添加する工程、及び
前記上清を吸着剤上に通し、前記吸着剤が被覆活性炭を含む工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記サンプルが、大便サンプル、組織サンプル、尿サンプル、血液サンプル、水サンプル、土壌サンプル、農学サンプル、獣医学サンプル、及び食物サンプルからなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
- 前記サンプルの一部が、少なくとも質量０．２ｇ又は体積０．２μＬを有する、請求項１に記載の方法。
- 更に前記上清をインキュベーションすることを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記活性炭が、ポリビニルピロリドン、デキストラン、及びココナッツ小麦からなる群から選ばれる材料で被覆されている、請求項１に記載の方法。
- 前記被覆活性炭が、活性炭のスラリーを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記スラリーの質量／体積比が約５％〜約２０％である、請求項６に記載の方法。
- 前記スラリーが約１％〜約１０％質量／体積比の被覆材料を含む、請求項６に記載の方法。
- 前記被覆材料が、ポリビニルピロリドン、デキストラン、及びココナッツ小麦からなる群から選ばれる、請求項８に記載の方法。
- サンプルから核酸を抽出するためのキットであって、
バッファー溶液の容器：
タンパク質分解酵素の容器：及び、
被覆活性炭を含む少なくとも一つのスピンカラム、
を含むことを特徴とするキット。 - 前記被覆活性炭が、活性炭のスラリーを含む、請求項１０に記載のキット。
- 前記スラリーの質量／体積比が約５％〜約２０％である、請求項１１に記載のキット。
- 前記スラリーが約１％〜約１０％質量／体積比の被覆材料を含む、請求項１１に記載のキット。
- 前記被覆材料が、ポリビニルピロリドン、デキストラン、及びココナッツ小麦からなる群から選ばれる、請求項１３に記載のキット。
- 前記活性炭が、ポリビニルピロリドン、デキストラン、及びココナッツ小麦からなる群から選ばれる材料で被覆されている、請求項１０に記載のキット。
- 前記バッファー溶液が、前記サンプルの一部をバッファー中に入れてボルテッックスするときにサンプルを均質化するように構成される、請求項１０に記載のキット。
- 前記被覆活性炭が、汚染物質と結合し、核酸を未結合とする、請求項１０に記載のキット。
- 被覆材料で被覆された活性炭のスラリーを含む吸着剤。
- 前記スラリーの質量／体積比が約５％〜約２０％である、請求項１８に記載の吸着剤。
- 前記被覆材料が、ポリビニルピロリドン、デキストラン、及びココナッツ小麦からなる群から選ばれる、請求項１８に記載の吸着剤。
- 保存液中に請求項１８に記載の吸着剤を含むマイクロ遠心分離カラム。
- 前記保存液が約０．１％〜約１０％質量／体積比の被覆材料を含む、請求項２１に記載のマイクロ遠心分離カラム。
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