CN115261307A - 一种骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其是涉及一种骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶及其制备方法和应用。本发明提供了一种能够用于肿瘤微环境中修复骨损伤的骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶及其制备方法和应用，该方法可以获得大量具有调节促成骨活性的骨细胞；且能够有效固定和保存骨细胞中具有调节功能的细胞活性成分。本发明通过振荡培养的方式对骨细胞施加一个稳定的振荡流体剪切力，控制二氧化碳振荡培养箱的振荡频率，振幅，流体体积及流体加载负荷时间获得激活骨细胞中骨合成代谢信号通路的最佳刺激条件，可以获得大量具有调节促成骨活性的骨细胞，进而使得骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶能够在肿瘤微环境中稳定长效的发挥促骨生成的作用。

Description

一种骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其是涉及一种骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
骨细胞不仅是一种机械敏感性细胞，还是一种腺体细胞。它能够将细胞感知到的机械作用力转化为生物信号来激活细胞内的骨合成代谢信号通路，然后以旁分泌和内分泌的方式释放促骨生长因子如骨形态发生蛋白2(BMP2)，骨基质蛋白(DMP1)和破骨细胞活化抑制因子如骨保护素(OPG)来调节成骨细胞和破骨细胞的活性，从而促进骨组织的再生。但由于骨细胞是一个高度动态的细胞，当外界机械力消失，骨细胞促进骨生成的调节功能就会很快消失，并且当骨细胞长期处于静止状态下不仅不会促进骨生成还会不断释放破骨细胞活化因子如硬骨蛋白(SOST)和白细胞介素-6(IL-6)等来诱导破骨细胞的生成与活化，从而导致骨溶解的发生。特别是在肿瘤微环境下，骨细胞常会受到肿瘤细胞直接的攻击或是受到肿瘤细胞释放的细胞因子的刺激而发生细胞凋亡。凋亡的骨细胞不但失去了调节骨平衡的功能，其所释放的细胞活性分子还会增强破骨细胞的活性从而加剧了骨溶解发生。由此可见，要想利用骨细胞的促骨生成调节功能来修复骨损伤，必须找到合适的方法来激活骨细胞内的骨合成代谢信号通路，并且能够使骨细胞的调节功能长期稳定的发挥作用而不受自身细胞状态和肿瘤细胞的影响。
目前，有研究者对骨组织直接施加机械拉力来激活骨组织内部的骨细胞促使其发挥骨重建的功能。但该方法对已经损伤的骨组织来说并不适用，很容易对损伤部位造成二次伤害。也有学者提出在体外构建能够激活骨细胞的处理系统，例如对体外培养的骨细胞施加一定强度的脉冲流体刺激细胞以激活内部调节骨生成的相关信号通路。虽然取得了一定的成功，但是因为所用仪器专业度较高，细胞处理体量小，并且在停止流体刺激后也无法使骨细胞长期发挥促骨生成的调节功能，使得骨细胞依然无法被应用于临床上的骨修复治疗。因此，制备出能在肿瘤微环境下长效发挥促骨生成功能的骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶具有重要的应用价值，并且迄今为止尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能够用于肿瘤微环境中修复骨损伤的骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶及其制备方法和应用，本发明通过振荡培养的方式对骨细胞施加一个稳定的振荡流体剪切力，控制二氧化碳振荡培养箱的振荡频率，振幅，流体体积及流体加载负荷时间获得激活骨细胞中骨合成代谢信号通路的最佳刺激条件，可以获得大量具有调节促成骨活性的骨细胞。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明提供了一种骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)取骨细胞置于二氧化碳振荡条件中培养，控制振荡流体流速为0.2～0.6m/s，对骨细胞进行加载负荷刺激；
2)收集步骤1)处理后的骨细胞，加入预冷的去离子水对骨细胞低温溶胀裂解，获得细胞溶液；利用液氮和37℃水浴对细胞溶液进行反复冻融处理，离心，过滤(去除细胞膜和细胞碎片)，收集骨细胞裂解液提取物，向骨细胞裂解液提取物中加入磷酸盐缓冲液，配制成骨细胞混合液；或者，
收集步骤1)处理后的骨细胞，用磷酸盐缓冲液重悬骨细胞，经过膜过滤器，获得细胞悬液，离心去上清，再次加入磷酸盐缓冲液重悬细胞悬液，离心，获得含有骨细胞衍生的细胞囊泡水溶液；
3)将骨细胞混合液/细胞囊泡水溶液和水凝胶溶液混匀，获得骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶。
在本发明的技术方案中，将骨细胞置于二氧化碳振荡条件中培养，施加一个稳定的振荡流体剪切力，控制振荡流体流速为0.2～0.6m/s，使得能够有效激活骨细胞内骨合成代谢信号通路，增强促骨生长因子的合成。
本发明的方法能够简单方便的获得大量具有促进骨生成功能的活化态骨细胞。本发明的步骤2)中，骨细胞裂解液提取物能够固定骨细胞的调控功能，保存骨细胞中活性成分，以此克服骨细胞功能不稳定且易受肿瘤细胞攻击的缺点，因此制备的裂解液基/囊泡基水凝胶的方法解决了骨细胞调节功能不稳定易受肿瘤细胞攻击的问题。
作为本发明所述骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶的制备方法的优选实施方式，所述振荡流体流速通过设置振荡振幅和振荡频率进行控制；所述振荡振幅为30-50mm，所述振荡频率为55-128rpm；优选地，所述振荡振幅为50mm，所述振荡频率为55rpm。
本发明通过控制二氧化碳振荡培养箱的振荡频率，振荡振幅，流体体积及流体加载负荷时间获得激活骨细胞中骨合成代谢信号通路的刺激条件。
优选地，骨细胞置于二氧化碳振荡条件中培养之前，还包括骨细胞预处理步骤：取细胞数为3×106的骨细胞置于底面积为65cm2培养瓶中静置培养，待细胞融合率趋于70％左右更换新鲜培养基。
作为本发明所述骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶的制备方法的优选实施方式，因为在体内只有流体所产生的流体剪切力在一定范围内才能诱导骨细胞发挥促进骨量增加的调节功能。当流体流速过低(<0.2m/s)产生的流体剪切力较小时，骨细胞因无法感受到有效的流体刺激进而无法激活细胞内骨合成代谢通路；但是流体流速过大(>0.6m/s)产生的流体剪切力过高时又会损伤骨细胞的活性导致骨细胞发生凋亡并释放促进骨溶解的信号分子。因此本发明欲将振荡流体的流速设置在0.3～0.4m/s范围内，以此来保证骨细胞能够发挥最佳促骨生成的功能。
作为本发明所述骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶的制备方法的优选实施方式，所述加载负荷刺激的时间为所述加载负荷刺激的时间为24～48h，优选地，所述加载负荷刺激的时间为24h。
本发明通过控制二氧化碳振荡培养箱的振荡频率，振荡振幅，流体体积及流体加载负荷时间，使得可以有效固定和保存骨细胞中具有调节功能的细胞活性成分，使得能够在肿瘤微环境中稳定且长期有效的促进骨组织的修复及保护骨骼的健康。
作为本发明所述骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶的制备方法的优选实施方式，所述步骤2)中，每2×107个骨细胞添加100微升去离子水对骨细胞进行低温溶胀预裂解。
作为本发明所述骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶的制备方法的优选实施方式，所述水凝胶溶液包括甲基纤维素水凝胶溶液或海藻酸钠水凝胶溶液；
所述甲基纤维素水凝胶溶液的制备方法包括：使用磷酸盐缓冲液溶解甲基纤维素配成质量浓度为10％的甲基纤维素水凝胶溶液；
所述海藻酸钠水凝胶溶液的制备方法包括：使用磷酸盐缓冲液溶解海藻酸钠，制成质量浓度为3％的海藻酸钠溶液，加入1-乙基-3-3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合，所述1-乙基-3-3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺与海藻酸钠的摩尔比为3：1：1，获得海藻酸钠水凝胶溶液。
优选地，步骤2)中，所述骨细胞混合液的蛋白浓度为20μg/μL；
在一实施例中，步骤3)中，还加入有质量浓度为1％的甲苯胺蓝溶液，骨细胞混合液、甲基纤维素水凝胶溶液和甲苯胺蓝溶液一起混匀，所述骨细胞混合液、甲基纤维素水凝胶溶液和甲苯胺蓝溶液的体积比为1：0.95：0.05。
在一实施例中，步骤3)中，骨细胞混合液和海藻酸钠水凝胶溶液的体积比为1:1。
本发明还提供了上述骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶的制备方法制备的骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶。
本发明最终获得的骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶能够在肿瘤微环境中稳定长效的发挥促骨生成的作用。
本发明还提供了上述骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶在制备肿瘤微环境下修复骨损伤药物中的应用。所述肿瘤包括骨髓瘤。
将骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶涂抹在细胞迁移培养板的上室中，并置于37℃的细胞培养基中孵育15分钟使胶体成膜后，将5×104个小鼠骨髓瘤细胞接种在骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶表面再与细胞迁移培养板下室中的前成骨细胞共孵育；共孵育5天后检测成骨细胞中与成骨分化相关基因的表达量；将骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶注射入骨髓瘤小鼠模型中，21天后利用CT扫描分析小鼠胫骨的损伤程度。
另外，本发明还提供了上述骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶在激活骨细胞内骨合成代谢信号通路和增强促骨生长因子的合成中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种能够用于肿瘤微环境中修复骨损伤的骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶及其制备方法和应用，该方法可以获得大量具有调节促成骨活性的骨细胞；且能够有效固定和保存骨细胞中具有调节功能的细胞活性成分。本发明通过振荡培养的方式对骨细胞施加一个稳定的振荡流体剪切力，控制二氧化碳振荡培养箱的振荡频率，振幅，流体体积及流体加载负荷时间获得激活骨细胞中骨合成代谢信号通路的最佳刺激条件，可以获得大量具有调节促成骨活性的骨细胞，进而使得骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶能够在肿瘤微环境中稳定长效的发挥促骨生成的作用。
附图说明
图1为实施例1的骨细胞裂解液基水凝胶促进骨细胞中促进骨生成调节因子的表达图；
图2为实施例1的骨细胞裂解液基水凝胶的光学照片；
图3为实施例1、3制备的骨细胞裂解液基水凝胶的扫描电子显微镜图(图3-A为实施例1制备的骨细胞裂解液基水凝胶、图3-B为实施例3制备的骨细胞裂解液基水凝胶)；
图4为实施例1的骨细胞裂解液基水凝胶对前成骨细胞中代表成骨分化基因的表达量的检测图(第一个柱状为空白对照组，代表成骨细胞与骨髓瘤细胞共孵育，第二个柱状代表成骨细胞和骨细胞裂解液基水凝胶共孵育，第三个柱状代表成骨细胞与骨髓瘤细胞和骨细胞裂解液基水凝胶三者共孵育)；
图5为实施例1制备的骨细胞裂解液基水凝胶在小鼠体内对因骨髓瘤细胞造成的骨损伤的修复效果图；
图6为实施例2制备的骨细胞囊泡基水凝胶对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响结果图(图6-A图代表未经实施例2制备的骨细胞囊泡基水凝胶处理的成骨细胞；图6-B代表经实施例2制备的骨细胞囊泡基水凝胶处理的成骨细胞)；
图7为实施例3制备的骨细胞裂解液基水凝胶的光学照片；
图8为实施例3制备的骨细胞裂解液基水凝胶对成骨细胞中钙沉积的影响检测结果图(图8-A为空白对照组；图8-B为实施例3制备的骨细胞裂解液基水凝胶与成骨细胞共孵育)；
图9为不同振荡流体流速、加载负荷刺激时间对促骨生成因子表达量和破骨因子的表达水平的结果图；
图10为实施例1制备的骨细胞裂解液基水凝胶测定成胶温度的结果图；
图11为实施例1制备的骨细胞裂解液基水凝胶中总蛋白和特定活性分子OPG的释放速率的结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、一种骨细胞裂解液基可注射水凝胶及其制备方法
本实施例提供了一种骨细胞裂解液基水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)将细胞数为3×106的骨细胞置于底面积为65cm2培养瓶中静置培养，待细胞融合率达到70％更换8mL新鲜培养基；
2)将上述培养瓶放置在二氧化碳振荡培养箱中，设定培养箱振幅50mm，振荡频率55rpm，流速为0.3～0.4m/s对骨细胞进行24小时振荡流体剪切力刺激；
3)收集步骤2)处理的骨细胞并按照每2×107个细胞添加100微升预冷的去离子水的比例4℃条件下对骨细胞进行溶胀裂解10分钟，获得细胞溶液，随后利用液氮快速冷冻细胞溶液，再在37℃水浴中快速溶解，反复操作4次，随后在1000g转速和4℃条件下将细胞裂解液进行离心，收集上清并用孔径为0.22μm的过滤器对骨细胞裂解液进行过滤以去除细胞膜和细胞碎片，收集到的过滤液即为骨细胞裂解液提取物，最后使用磷酸盐缓冲液配置成蛋白浓度为20μg/μL的骨细胞混合液；
4)向甲基纤维素粉末中加入磷酸盐缓冲液配成质量浓度为10％的甲基纤维素水凝胶溶液保存，然后甲基纤维素水凝胶溶液、骨细胞裂解液和质量分数为1％的甲苯胺蓝溶液按照体积比为1：0.95：0.05的比例充分混匀并离心去除气泡，最终获得骨细胞裂解液基水凝胶。
5)将骨细胞裂解液基水凝胶溶液注射在37℃水中观察胶体生成情况。
将上述获得的骨细胞裂解液基水凝胶涂抹在细胞迁移培养板的上室中，随后浸入含10％胎牛血清的α-MEM细胞培养基中37℃静置15分钟，待胶体成膜后将5×104个小鼠骨髓瘤细胞接种在凝胶表面再与细胞迁移培养板下室中的前成骨细胞共孵育(2×104个/孔)；孵育5天后检测成骨细胞中与成骨分化相关的基因表达量，将不含骨细胞裂解液基水凝胶的设为空白组，将不含骨髓瘤细胞的设为实验对照组；将静止培养组(将上述培养瓶静置放置24小时，替代实施例1中的步骤2))作为对比例。如图1所示，本实施例的骨细胞裂解液基水凝胶能够有效刺激骨细胞的骨合成代谢反应，骨细胞经过振荡流体刺激后(OFFloading)，与静止培养组(static culture)相比细胞内促骨生成因子OPG，DMP1和COX2的分子表达量都有所升高。
将上述骨细胞裂解液基水凝胶注射入骨髓瘤小鼠模型中[Sylva.F,Joséphine.M,et al.Blood Cancer Journal,2018,8,105]，21天后利用CT扫描分析小鼠胫骨的损伤程度，以未经治疗的小鼠作为空白对照组。
实施例1所制备的具有促成骨活性的骨细胞裂解液基水凝胶的成胶情况如图2所示。参考图3，扫描电镜结果显示实施例1的胶体内部为互相贯穿的多孔结构(如图3-A所示)。本实施例制备的骨细胞裂解液基水凝胶能够在肿瘤微环境中有效的促进前成骨细胞的分化(如图4所示)，参考图5，并且体内实验中也证实了与空白对照组(空白对照组代表小鼠接种骨髓瘤细胞后会导致骨质破坏的产生)相比(图5-A)，实施例1获得的骨细胞裂解液基水凝胶能够有效抑制肿瘤细胞对骨质的侵蚀破坏，保证了骨骼的健康(如图5-B所示)。小鼠接种骨髓瘤细胞后经骨细胞裂解液基水凝胶的治疗后抑制了骨溶解的产生，促进了骨再生。
实施例2、一种骨细胞囊泡基水凝胶及其制备方法
本实施例提供了一种骨细胞囊泡基水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)将细胞数为3×106的骨细胞置于底面积为65cm2培养瓶中静置培养，待细胞融合率达到70％更换8mL新鲜培养基；
2)将上述培养瓶放置在二氧化碳振荡培养箱中，设定培养箱振幅50mm，振荡频率55rpm，对骨细胞进行24小时振荡流体剪切力刺激；
3)收集步骤2)处理的骨细胞用磷酸盐缓冲液重悬细胞并将细胞浓度调整为1×106个/毫升，随后将细胞溶液依次从0.45μm和0.22μm的聚碳酸酯膜过滤器中挤出；
4)将经过膜过滤器挤出的细胞悬液在10000g转速条件下离心15分钟，去除上清。再次加入磷酸盐缓冲液重悬沉淀，并将溶液置于分子量为100KDa的超速离心管中在1000g转速下离心15分钟以获得含有骨细胞衍生的细胞囊泡水溶液；
5)向甲基纤维素粉末中加入磷酸盐缓冲液配成质量浓度为10％的甲基纤维素水凝胶溶液保存，然后将甲基纤维素水凝胶溶液和细胞囊泡水溶液充分混匀，获得骨细胞囊泡基水凝胶；
6)将上述骨细胞囊泡基水凝胶涂抹在细胞迁移培养板的上室中，随后浸入细胞培养基中37℃孵育15分钟，待胶体成膜后将5×104个小鼠骨髓瘤细胞接种在骨细胞囊泡基水凝胶的表面再与细胞迁移培养板下室中的前成骨细胞共孵育(2×104个/孔)；孵育8天后检测成骨细胞中碱性磷酸酶的表达；将不含凝胶材料的设为空白对照组，将不含骨髓瘤细胞的设为实验对照组。
碱性磷酸酶染色结果显示，经过实施例2所制得的骨细胞囊泡基水凝胶能够促进成骨细胞中碱性磷酸酶的表达(如图6所示)。
实施例3、一种骨细胞裂解液基水凝胶支架及其制备方法
本实施例提供了一种骨细胞裂解液基水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)将细胞数为3×106的骨细胞置于底面积为65cm2培养瓶中静置培养，待细胞融合率达到70％更换8mL新鲜培养基；
2)将上述培养瓶放置在二氧化碳振荡培养箱中，设定培养箱振幅50mm，振荡频率55rpm，对骨细胞进行24小时振荡流体剪切力刺激；
3)收集步骤2)处理的骨细胞并按照每2×107个细胞添加100微升预冷的去离子水的比例对骨细胞进行低温溶胀裂解10分钟，获得细胞溶液，随后利用液氮快速冷冻细胞溶液，再在37℃水浴中快速溶解，反复操作4次，随后在1000g转速下将裂解液进行低温离心，收集上清并用孔径为0.22μm的过滤器对骨细胞裂解液进行过滤以去除细胞膜和细胞碎片，收集到的过滤液即为骨细胞裂解液提取物，最后使用磷酸盐缓冲液配置成蛋白浓度为20μg/μL的骨细胞混合液；
4)将海藻酸钠(粘均分子量≥2000cps)粉末置于紫外灯下灭菌15分钟，随后用磷酸盐缓冲液将其溶解稀释成质量浓度为3％的海藻酸钠溶液，加入1-乙基-3-3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)剧烈振荡反应45分钟，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)振荡混匀，获得海藻酸钠水凝胶溶液。所述EDC、NHS与海藻酸钠的摩尔比为3：1：1。
5)将步骤3)所得骨细胞混合液与步骤4)所得海藻酸钠水凝胶溶液按体积比1：1的比例充分混合后，倒入预冷的聚乙烯模具中，置于-20℃条件下反应36小时，获得骨细胞裂解液基水凝胶。
6)用预冷的磷酸盐缓冲液漂洗步骤5)所得凝胶支架30分钟，随后将其与前成骨细胞共孵育15天。
本实施例所得产物为直径3毫米，高度1毫米的圆片状结构如图7所示。扫描电镜结果显示凝胶支架内部为无规则多孔结构，孔径大小为100微米左右(如图3-B所示)。将100微升茜素红染液与步骤6)所得成骨细胞室温共孵育4小时后，去离子水洗去染液室温晾干15-20分钟后，使用正置光学显微镜观察矿化结节的产生。参考图8，实验结果表明与空白对照组(预先未经任何处理的成骨细胞)(如图8-A所示)相比，本实施例2制备的骨细胞裂解液基水凝胶能够有效增强骨沉积和矿化结节的产生进而促进成骨的分化(如图8-B所示)。
实施例4
与实施例1相比，区别仅在于，设定培养箱振荡频率128rpm，对骨细胞进行24小时振荡流体剪切力刺激，控制振荡流体流速为0.6m/s，其余条件及参数与实施例1相同。与实施例1相比，骨细胞在实施例4的实验条件下所产生的促骨生成因子表达量较低(如图9所示)，而破骨因子的表达水平反而升高。
实施例5
与实施例1相比，区别仅在于，设定培养箱振荡频率30rpm，对骨细胞进行24小时振荡流体剪切力刺激，控制振荡流体流速为0.2m/s，其余条件及参数与实施例1相同。与实施例1相比，骨细胞在实施例5的实验条件下所产生的促骨生成因子表达量较低(如图9-A，9-B所示)，而破骨因子的表达水平反而升高。
实施例6
与实施例相比，区别仅在于，对骨细胞进行12小时振荡流体剪切力刺激，其余条件与实施例相同。与实施例1相比，骨细胞在实施例6的实验条件下所产生的促骨生成因子表达量较低(如图9-C，9-D所示)，而破骨因子的表达水平反而升高。
实施例7
与实施例相比，区别仅在于，对骨细胞进行48小时振荡流体剪切力刺激，其余条件与实施例相同。与实施例1相比，骨细胞在实施例7的实验条件下所产生的促骨生成因子表达量较低(如图9-C，9-D所示)，而破骨因子的表达水平反而升高。
试验例、骨细胞裂解液基水凝胶的性能测试
本实验通过流变仪检测将实施例1制备的骨细胞裂解液基水凝胶的凝胶温度，结果如图10所示，当温度达33℃时，凝胶的储存模量等于损耗模量。此时体系开始从液体向半固体转变。当温度高于33℃时储存模量将高于损耗模量，此时体系失去流动性成为固相凝胶状态。说明，实施例1制备的骨细胞裂解液基水凝胶的成胶温度大于33℃。
生物活性分子释放速率的检测：
将实施例1制备的骨细胞裂解液基水凝胶置于磷酸盐缓冲液中，经37℃摇床中孵育后在不同时间点收集释放液，同时补充相同体积的磷酸盐缓冲液。再利用BCA蛋白浓度测定法和酶联免疫吸附法分别测定释放液中蛋白质的含量及骨保护素OPG的含量。
如图11所示，前24小时实施例1中的骨细胞裂解液基水凝胶所释放的总蛋白(图11-A)和骨保护素OPG(图11-B)速率较慢，随后逐步升高释放速率。实验证明，实施例1做制备的骨细胞裂解液基水凝胶含有大量的骨细胞活性分子物质，能够在肿瘤微环境中稳定且长期有效的促进骨组织的修复及保护骨骼的健康，同理，实施例3制备的骨细胞裂解液基水凝胶也获得相似的技术效果。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取骨细胞置于二氧化碳振荡条件中培养，控制振荡流体流速为0.2～0.6m/s，对骨细胞进行加载负荷刺激；
2)收集步骤1)处理后的骨细胞，加入预冷的去离子水对骨细胞低温溶胀裂解，获得细胞溶液；利用液氮和水浴对细胞溶液进行反复冻融处理，离心，过滤，收集骨细胞裂解液提取物，向骨细胞裂解液提取物中加入磷酸盐缓冲液，配制成骨细胞混合液；或者，
收集步骤1)处理后的骨细胞，用磷酸盐缓冲液重悬骨细胞，经过膜过滤器，获得细胞悬液，离心去上清，再次加入磷酸盐缓冲液重悬细胞悬液，离心，获得含有骨细胞衍生的细胞囊泡水溶液；
3)将骨细胞混合液/细胞囊泡水溶液和水凝胶溶液混匀，获得骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述振荡流体流速通过设置振荡振幅和振荡频率进行控制；所述振荡振幅为30-50mm，所述振荡频率为55-128rpm。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，控制振荡流体流速为0.3～0.4m/s。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述加载负荷刺激的时间为24～48h，优选地，所述加载负荷刺激的时间为24h。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，还加入有质量浓度为1％的甲苯胺蓝溶液，骨细胞混合液、水凝胶溶液和甲苯胺蓝溶液混匀，所述骨细胞混合液、水凝胶溶液和甲苯胺蓝溶液的体积比为1：0.95：0.05。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水凝胶溶液包括甲基纤维素水凝胶溶液或海藻酸钠水凝胶溶液；
所述甲基纤维素水凝胶溶液的制备方法包括：使用磷酸盐缓冲液溶解甲基纤维素配成质量浓度为10％的甲基纤维素水凝胶溶液；
所述海藻酸钠水凝胶溶液的制备方法包括：使用磷酸盐缓冲液溶解海藻酸钠，制成质量浓度为3％的海藻酸钠溶液，加入1-乙基-3-3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合，所述1-乙基-3-3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和海藻酸钠的摩尔比为3：1：1，获得海藻酸钠水凝胶溶液。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的制备方法制备的骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶。
8.如权利要求7所述的骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶在制备肿瘤微环境下修复骨损伤药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括骨髓瘤。
10.如权利要求7所述的的骨细胞裂解液基/囊泡基水凝胶在激活骨细胞内骨合成代谢信号通路和增强促骨生长因子的合成中的应用。
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