CN114642628A - M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用，M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法为：1)将M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成溶液；2)将EDC和交联剂溶液混合，振荡，离心，静置；放在冰浴中，加入NHS，振荡，离心；3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再振荡，离心，倒入模具中，在‑16～‑23℃放置，得到M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶；本发明的水凝胶富含多种杀伤分子、促炎因子，本发明的方法简单，M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶能缓慢释放多种杀伤分子，细胞因子促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，具有抗肿瘤作用。
Description
技术领域
本发明属于材料技术领域，具体设计一种具有微米多孔结构的M1巨噬细胞裂解液基水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
水凝胶是一种三维聚合物具有亲水网络，广泛用于蛋白质、肽、药物和核酸的包裹和控制释放。同时水凝胶具有良好的仿生性，它的含水量高使其表面张力降低，可以减少细胞和蛋白在其表面的粘附，其次水凝胶柔软且具有孔隙，可以降低它与周围组织的力学摩擦，如果将其应用于人体内，可以减少或避免发生炎症反应，因而在生物医药领域中具有广泛的应用。
肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞，是肿瘤微环境中最多的免疫细胞，可以分泌多种细胞因子，在肿瘤发生的初期，能够识别并清除肿瘤细胞，但随着肿瘤的发生发展，又对肿瘤的生长、侵袭、转移起着关键作用。M1型巨噬细胞高表达白介素-12(IL-12)、一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)等杀伤分子、多种促炎细胞因子(IL-1、IL-6、IL-13和TNF-α等)及趋化因子(CCL2、CCL3、CXCL-10等)[van Dalen FJ,van StevendaalMHME,Fennemann FL,Verdoes M,Ilina O.Molecular repolarisation of tumour-associated macrophages.Molecules.(2018)24:E9.10.3390/molecules24010009]。M1型巨噬细胞通过释放促炎因子、免疫激活因子、趋化因子引起急性促炎反应、免疫活化反应以及细胞吞噬功能，发挥抗肿瘤的作用。但直接注射M1型巨噬细胞会产生急性炎症[YeungWHO,Lo CM,Ling CC,et al.Alternatively activated(M2)macrophages promote tumorgrowth and invasiveness in hepatocellular carcinoma.J Hepatol.2015；62:607-16.]，因此亟需一种副作用小的M1型巨噬细胞裂解液的制剂。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶。
本发明的第二个目的是提供一种M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶在制备抗癌药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
1)将M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成质量浓度为10％～20％的M1型巨噬细胞裂解液溶液；
2)将EDC和交联剂溶液混合，在室温下振荡10～20s，离心5～10s，静置10-30分钟；放在冰浴中，加入NHS，再在室温下振荡10～20s，离心5～10s；
3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再在室温下振荡10～20s，离心5～10s，倒入模具中，在-16～-23℃放置24小时～48小时，得到M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶；
所述EDC、交联剂与NHS的质量比为5-25:100-500:3-20；
所述交联剂与M1型巨噬细胞裂解液溶液的质量比为1～5：1～3；
所述EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写；
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。
M1型巨噬细胞裂解液冻干粉用下述方法制成：
将LPS加入到M0型巨噬细胞的培养液中，使终浓度为80～120ng/mL；放置24～48小时，诱导分化得到M1型巨噬细胞，用pH＝7.2±0.5PBS清洗2～3次，用pH＝7.2±0.5PBS将M1型巨噬细胞吹打下来，加入离心管中计数，在1000rpm转速下离心3～5分钟，弃上清，每2.0×107个细胞用100ul的无菌水吹匀，通过液氮冷冻，再在37℃水浴中融解，反复冻融3～5次，在400rpm转速下离心10～15分钟，收集上清液，冷冻干燥获得M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，在-80℃中保存。
所述交联剂溶液的溶剂为pH＝7.2±0.5的磷酸缓冲液，交联剂溶液的质量浓度为2％。
交联剂为粘均分子量≥2000cps的海藻酸钠、数均分子量100000～200000透明质酸或数均分子量100000的聚丙烯酸。
上述制备方法制备的M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶。
上述M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶在制备抗癌药物中的应用。
本发明的优点：
本发明的一种具有微米多孔结构的M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶所用主要原料是M1型巨噬细胞，富含多种杀伤分子、促炎因子(IL-12、ROS、TNF-α、IFN-γ等)。
本发明的方法简单易操作，低温环境易于M1型巨噬细胞中活性组分的保存。M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶能缓慢释放多种杀伤分子，细胞因子促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，具有抗肿瘤作用。
本发明以含羧基的水溶性高分子(如天然多糖透明质酸、海藻酸钠等或合成聚合物聚丙烯酸等)为交联剂，通过M1巨噬细胞裂解液中氨基与交联剂羧基之间的酰胺反应，在低温下制备具有微米多孔结构的M1巨噬细胞裂解液基水凝胶。
附图说明
图1为实施例5制备的水凝胶的照片。
图2为M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的共聚焦显微镜照片，其中(A)为实施例4制备；(B)为实施例5制备。
图3为M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的扫描电镜照片，其中(A)为实施例4制备；(B)为实施例5制备。
图4中的(A)为实施例4、实施例5制备的水凝胶的模量表征。(B)实施例4、实施例5制备的水凝胶的降解。
图5实施例5制备的水凝胶和对照组凝胶的溶胀率(A)；实施例5制备的水凝胶和对照组凝胶的孔隙率(B)。
图6实施例5制备的水凝胶生物活性分子释放曲线，(A)IFN-γ、(B)TNF-α、(C)IL-12。
图7为空白对照组、实施例5制备的水凝胶与对照组(甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠基多孔凝胶)通过流式细胞术检测对M2型巨噬细胞表型的改变。
图8空白对照组、实施例5制备的水凝胶与对照组(甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠基多孔凝胶)通过酶联免疫吸附法和聚合酶链式反应检测对M2型巨噬细胞表型的改变，(A)聚合酶链式反应检测TNF-α(B)酶联免疫吸附法检测IFN-γ(C)酶联免疫吸附法检测IL-12。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述各实施例中涉及的LPS为脂多糖(市售)；
M0型巨噬细胞(市售)，M0型巨噬细胞是小鼠来源的巨噬细胞系。
EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写；
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。
实施例1
M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，用下述方法制成：
将LPS加入到M0型巨噬细胞的培养液(RPMI-1640培养液)中，使终浓度为100ng/mL；放置36小时，诱导分化为M1型巨噬细胞，用pH＝7.2PBS清洗3次，用pH＝7.2PBS将M1型巨噬细胞(从培养细胞的容器壁上)吹打下来，加入离心管中计数，在1000rpm转速下离心4分钟，弃上清，每2.0×107个细胞用100ul的无菌水吹匀，通过液氮快速冷冻，再在37℃水浴中融解，反复冻融4次，在400rpm转速下离心13分钟，收集上清液，冷冻干燥获得M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，在-80℃中保存。
实施例2
M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，用下述方法制成：
将LPS加入到M0型巨噬细胞的培养液中，使终浓度为80ng/mL；放置24小时，诱导分化为M1型巨噬细胞，用pH＝7.7PBS清洗2次，用pH＝7.7PBS将M1型巨噬细胞(从培养细胞的容器壁上)吹打下来，加入离心管中计数，在1000rpm转速下离心3分钟，弃上清，每2.0×107个细胞用100ul的无菌水吹匀，通过液氮快速冷冻，再在37℃水浴中融解，反复冻融3次，在400rpm转速下离心10分钟，收集上清液，冷冻干燥获得M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，在-80℃中保存。
实施例3
M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，用下述方法制成：
将LPS加入到M0型巨噬细胞的培养液中，使终浓度为120ng/mL；放置48小时，诱导分化为M1型巨噬细胞，用pH＝6.7PBS清洗3次，用pH＝6.7PBS将M1型巨噬细胞(从培养细胞的容器壁上)吹打下来，加入离心管中计数，在1000rpm转速下离心5分钟，弃上清，每2.0×107个细胞用100ul的无菌水吹匀，通过液氮快速冷冻，再在37℃水浴中融解，反复冻融5次，在400rpm转速下离心15分钟，收集上清液，冷冻干燥获得M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，在-80℃中保存。
实施例4
M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
1)将实施例1制备的M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成质量浓度为15％的M1型巨噬细胞裂解液溶液；
2)将EDC和质量浓度为2％的交联剂溶液(溶剂：pH＝7.2的磷酸缓冲液)混合，在室温下振荡15s，离心8s，静置20分钟；放在冰浴中，加入NHS，再在室温下振荡15s，离心8s；
3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再在室温下振荡15s，离心8s，倒入模具中，在-20℃放置36小时，得到M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶；
所述EDC、交联剂与NHS的质量比为15:240:9；
所述交联剂与M1型巨噬细胞裂解液溶液的质量比为3:2；
交联剂为粘均分子量≥2000cps的海藻酸钠。
共聚焦显微镜与扫描电镜显示凝胶内部为无规微孔，孔径大小为40～50微米(如图2A，3A所示)。
实施例5
M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
1)将实施例2制备的M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成质量浓度为10％的M1型巨噬细胞裂解液溶液；
2)将EDC和质量浓度为2％的交联剂溶液(溶剂：pH＝7.7磷酸缓冲液)混合，在室温下振荡10s，离心5s，静置10分钟；放在冰浴中，加入NHS，再在室温下振荡10s，离心5s；
3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再在室温下振荡10s，离心5s，倒入模具中，在-16℃放置48小时，得到M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶；
所述EDC、交联剂与NHS的质量比为5:100:3；
所述交联剂与M1型巨噬细胞裂解液溶液的质量比为1:1；
所述EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写；
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。
交联剂为数均分子量100000～200000透明质酸。
M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶，如图1所示。
本实施例得到的产物共聚焦显微镜与扫描电镜显示凝胶内部为无规微孔，孔径大小为100～120微米(如图2B，3B所示)。
实施例6
M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
1)将实施例3制备的M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成质量浓度为20％的M1型巨噬细胞裂解液溶液；
2)将EDC和质量浓度为2％的交联剂溶液(溶剂：pH＝6.7磷酸缓冲液)混合，在室温下振荡20s，离心10s，静置30分钟；放在冰浴中，加入NHS，再在室温下振荡20s，离心10s；
3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再在室温下振荡20s，离心10s，倒入模具中，在-23℃放置24小时，得到M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶；
所述EDC、交联剂与NHS的质量比为25:500:20；
所述交联剂与M1型巨噬细胞裂解液溶液的质量比为5:3；
所述EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写；
NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。
交联剂为数均分子量100000的聚丙烯酸。
本实施例得到的产物共聚焦显微镜与扫描电镜显示凝胶内部为无规微孔，孔径大小为微米级。
实施例7
对照组(甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠多孔凝胶)，用下述方法制备：
取18微升甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠溶液[浓度为25％(w/v)]加入离心管中，加入28微升PBS(pH＝7.2PBS)充分震荡混匀，再加入2微升过硫酸钠(APS)充分震荡混匀，再加入2微升N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)充分震荡混匀，混匀后迅速倒入模具中。在-16℃冰箱中放置24小时，得到甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠多孔凝胶。
实验例1
实施例4、5制备的水凝胶的性能测试
将实施例4、实施例5制备的水凝胶通过杨氏模量仪测不同频率下水凝胶的模量变化，结果如图4A所示，实施例4、实施例5的水凝胶有较好力学性能。
实验例2
实施例4、5制备的水凝胶降解率实验
将实施例4、实施例5的水凝胶放入冷冻干燥机内进行冻干，24h后取出，取出后称其重量，并做好记录，记为M1，然后放入装满去离子水的2mlEP管中浸泡，再将所有放入37℃恒温、100转每分钟的摇床中，模拟人体的内部环境。在1、3、5、7、9、12、15天取出凝胶，将凝胶先放入-40℃冰箱中进行冷冻，24h后再将其放入冷冻干燥机中进行冻干，24h后取出，进行称重，称重后分别进行记录，记为M2，由公式可得M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的降解率。降解率＝【(M1-M2)/M1】*100％见图4B。
实验证明，实施例6制备的水凝胶力学性能、降解率与实施例5制备的水凝胶相似。
实验例3
水凝胶溶胀率与孔隙率
将实施例5的水凝胶和实施例7的对照组(甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠多孔凝胶)冷冻干燥后称重为W1，再用去离子水浸泡过夜后称重为W2，然后用滤纸将浸泡凝胶中的水吸干再称重为W3。
按照公式：溶胀率＝W2/W1，孔隙率＝W2/W3×100％，分别计算凝胶的溶胀率及孔隙率，结果如图5所示。
实验例4
实施例5制备的水凝胶的生长因子的释放检测
检测步骤如下：实施例5制备的水凝胶置于磷酸缓冲液(pH＝7.2)中，37℃下在不同时间点收集释放液同时补充新鲜磷酸缓冲液，利用酶联免疫吸附法测定释放液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)的含量。如图6所示，在前两天凝胶快速释放TNF-α、IFN-γ及IL-12，然后缓慢释放直到第6天。
实验例5
实施例5制备的水凝胶对M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化的应用
M2型巨噬细胞在M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶下的极化
在无菌操作台中将M2型巨噬细胞以1×105个/孔铺于24孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。然后在24孔板中分别加入实施例5制备的水凝胶与实施例7的对照组(甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠多孔凝胶)平放于24孔板中。置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h。
空白对照组不加入凝胶，只有培养基与M2型巨噬细胞。
实施例5制备的水凝胶组、实施例7的对照组和空白对照组12个平行，在第2天后进行流式细胞术，计算M2型巨噬细胞减少数目。如图7所示，加M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶使M2型巨噬细胞减少到18.45％，实施例7的对照组50.93％，空白对照组64.94％，实施例5制备的水凝胶组极大的减少了M2型巨噬细胞的数目。
在无菌操作台中将M2型巨噬细胞以1×105个/孔铺于24孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。然后在24孔板中加入实施例5制备的凝胶与实施例7的对照组的凝胶平放于24孔板中。置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h。空白对照组不含凝胶材料只有培养基与M2型巨噬细胞，实施例5制备的水凝胶组、实施例7的对照组和空白对照组12个平行，在2天后进行聚合酶链式反应测TNF-α含量(图8A)。酶联吸附反应检测IFN-γ(图8B)和IL-12(图8C)释放量。通过图8所示M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶使M2型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞。
实验证明，实施例4、6制备的水凝胶的溶胀率、孔隙率、生长因子的释放和对M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化与实施例5制备的水凝胶相似。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将M1型巨噬细胞裂解液冻干粉加入无菌水中配成质量浓度为10％～20％的M1型巨噬细胞裂解液溶液；
2)将EDC和交联剂溶液混合，在室温下振荡10～20s，离心5～10s，静置10-30分钟；放在冰浴中，加入NHS，再在室温下振荡10～20s，离心5～10s；
3)在冰浴中，将步骤1)获得的溶液与步骤2)获得的液体混合，再在室温下振荡10～20s，离心5～10s，倒入模具中，在-16～-23℃放置24小时～48小时，得到M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶；
所述EDC、交联剂与NHS的质量比为5-25:100-500:3-20；
所述交联剂与M1型巨噬细胞裂解液溶液的质量比为1～5：1～3；
所述EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写；
所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述M1型巨噬细胞裂解液冻干粉用下述方法制成：
将LPS加入到M0型巨噬细胞的培养液中，使终浓度为80～120ng/mL；放置24～48小时，诱导分化得到M1型巨噬细胞，用pH＝7.2±0.5PBS清洗2～3次，用pH＝7.2±0.5PBS将M1型巨噬细胞吹打下来，加入离心管中计数，在1000rpm转速下离心3～5分钟，弃上清，每2.0×107个细胞用100ul的无菌水吹匀，通过液氮冷冻，再在37℃水浴中融解，反复冻融3～5次，在400rpm转速下离心10～15分钟，收集上清液，冷冻干燥获得M1型巨噬细胞裂解液冻干粉，在-80℃中保存。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述交联剂溶液的溶剂为pH＝7.2±0.5的磷酸缓冲液，交联剂溶液的质量浓度为2％。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征是所述交联剂为粘均分子量≥2000cps的海藻酸钠、数均分子量100000～200000透明质酸或数均分子量100000的聚丙烯酸。
5.权利要求1-4之一的制备方法制备的M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶。
6.权利要求5的M1型巨噬细胞裂解液基水凝胶在制备抗癌药物中的应用。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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