CN115252778B - 一种基于预激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种基于预激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于预激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物及其制备方法和应用，所述仿生囊泡复合物是膜包核结构，其核为聚集发光光敏剂复合物，其膜是预激活巨噬细胞膜。其制备步骤包括：特定病原体刺激巨噬细胞，提取表达特定病原体特异性受体的预激活巨噬细胞膜；制备聚集发光光敏剂复合物；提取得到的巨噬细胞膜、聚集发光光敏剂复合物进行水浴超声处理，得到仿生囊泡复合物。仿生囊泡复合物可在制备杀伤特定病原体药物、光动力治疗特定病原体相关疾病药物中应用。本发明优点包括：可实现病灶特定病原体肉芽肿和肉芽肿内病原体的双重靶向，然后在近红外光照射下实现靶向PDT，增加疗效、减少疗程，降低药物的毒副作用，实现综合精准治疗，达到多模态综合治疗的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种杀伤体内病原体的医药技术领域，尤其涉及用于光动力治疗的医药技术。
背景技术
结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)感染引起的一种致死性传染病，严重危害全人类生命健康。结核分枝杆菌俗称结核杆菌。《2021年全球结核报告》显示，全世界已有四分之一人口(约19亿)感染了M.tb，2020全年全球新发TB患者987万，年死亡人数达150余万，给全球公共卫生和社会经济造成了严重负担。TB的常规治疗方案主要以多种抗生素联合为主，用药须遵循“早期、适量、联合、规律、全程”原则。然而，传统抗生素疗效差、毒性强，长期服用导致患者依从性下降。抗生素的长期选择压力和用药不规律极易引起耐药性M.tb，尤其是多耐药(MDR)和泛耐药(XDR)M.tb的出现，给抗生素疗法带来了巨大挑战。对于耐药性TB，需使用毒性更大的二三线药物治疗更长时间，且完整疗程后患者死亡率仍然＞50％。因此，亟需研发疗效佳，毒性低，且能有效杀灭耐药菌的新型治疗方案，以缓解严峻的TB疫情。
据此，研究人员研发了多种新型抗结核化学药物，如TMC-207，OPC-67683，PA-824等，旨在提高疗效、缩短疗程、增强对耐药性M.tb的杀伤等【1-7】。然而，这些化学药物的分子结构不具有对结核病灶和M.tb菌体的靶向性原理，因此仍存在对正常组织的潜在毒性。同时，研究人员还开发了一系列新型抗生素载药系统，如PLGA纳米粒子、脂质体等，旨在降低抗生素用药频率、降低全身毒副作用等【8-10】。但是，这些载药系统仍无法实现对耐药性M.tb的有效杀伤。光动力治疗(PDT)可以通过光敏剂释放的大量活性氧氧自由基(ROS)实现对耐药性细菌的有效杀伤【11-13】。由于ROS可以通过氧化作用直接损伤细菌的脂质、蛋白、核酸等分子，因此不会出现耐药现象[14-16]，PDT有潜力作为耐药性TB的有效治疗策略【17】。然而，PDT对正常细胞同样存在光动力杀伤作用，因此开发M.tb精准靶向平台对于降低光敏剂对正常组织的副作用有重要意义。目前尚没有M.tb病原体的特异性靶向策略。
结核肉芽肿(granuloma)是人体和M.tb之间强烈的相互作用产生的TB特征性病灶，主要由分化成熟的巨噬细胞紧密排列而成，核心含有大量M.tb，外层的T、B、NK等免疫细胞通过分泌细胞因子以维持其结构的稳定性。结核肉芽肿对人体是“双刃剑”，优点包括：1)成熟肉芽肿的致密结构可以阻隔感染的扩散；2)这种阻隔作用可能持续一辈子不发病。缺点包括：1)只有阻隔作用，无法根除感染；2)肉芽肿的致密结构严重限制了抗生素渗透到肉芽肿内部；3)肉芽肿核心处于静息状态的M.tb本身对抗生素表型耐药。因此，结核肉芽肿的致密结构和肉芽肿内M.tb的表型耐药可能是抗生素疗效不佳的重要原因之一。开发针对结核肉芽肿和肉芽肿内M.tb的新型治疗方案有望提高抗结核的疗效。文献报道，结核肉芽肿与肿瘤组织类似，会促进病灶局部异常血管增生，这些血管呈现高度异质性且内皮间隙明显增大。因此，粒径为100-200nm的多种纳米粒子(如脂质体、胶束、PEG化纳米粒子等)可通过体内长循环特性和增强的渗透和滞留(EPR)样效应实现对结核肉芽肿的靶向【18】。然而，上述纳米粒子并未实现对肉芽肿内M.tb的特异性靶向【18】。
细胞膜仿生囊泡(BVs)由于其原料来源于天然细胞膜，相比于人工制备的纳米粒子具有逃逸免疫清除、体循环时间长、病灶靶向性高等优点，有巨大的临床应用前景。更重要的是，BVs自带来源细胞本身的多种表面分子(如蛋白受体、多肽、糖链残基等)，具有靶向识别、毒物中和、免疫阻断和激活等功能。目前，已有多种细胞膜来源的BVs(如红细胞、肿瘤细胞和血小板等)被报道用于肿瘤、炎症、细菌和病毒感染等疾病的诊疗。然而，BVs在结核病诊疗方面的应用没有任何报道。
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发明内容
本发明的目的在于提供一种基于预激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物及其制备方法与应用，以解决现有技术中M.tb耐药，缺乏特异性靶向结核肉芽肿、结核肉芽肿内M.tb的药物等问题。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种基于预激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物，所述仿生囊泡复合物是膜包核结构，其核为聚集发光光敏剂复合物，其膜是表达特定病原体特异性受体的预激活巨噬细胞膜。所述仿生囊泡复合物ROS产率高、生物相容性高。
进一步地，所述仿生囊泡复合物直径为90-130nm。
进一步地，所述聚集发光光敏剂复合物是光敏剂ASTP与载体PLGA复合形成的纳米粒子；
所述预激活巨噬细胞膜来自被特定病原体激活的巨噬细胞的细胞膜，其表达特定病原体特异性受体。以该细胞膜为原料制备的BVs有望实现该特定病原体的特异性靶向。
进一步地，所述特定病原体选自结核杆菌、海分枝杆菌。
仿生囊泡复合物外层采用结核杆菌/海分枝杆菌预激活的巨噬细胞膜，通过血液长循环特性和EPR效应能靶向肉芽肿；且因其表达多种结核杆菌/海分枝杆菌的特异性受体，能靶向肉芽肿内结核杆菌/海分枝杆菌，实现肉芽肿以及结核杆菌/海分枝杆菌双重靶向。在病原靶向前提下，实现对结核杆菌/海分枝杆菌的靶向光动力杀伤，在增加抗结核疗效、抗海分枝杆菌相关疾病疗效、减少疗程的同时，降低药物毒副作用，实现TB及耐药性TB、海分枝杆菌相关疾病及耐药性海分枝杆菌相关疾病的综合精准治疗，解决临床常规抗生素疗法疗效差、疗程长、副作用大、对耐药菌无效等实际问题。
本发明还提供一种基于预激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物制备方法，步骤包括：
(1)特定病原体刺激巨噬细胞，提取表达特定病原体特异性受体的预激活巨噬细胞膜；
(2)聚集发光光敏剂ASTP与载体复合制备得到聚集发光光敏剂复合物；
(3)将步骤(1)提取得到的预激活巨噬细胞膜、步骤(2)制备得到的聚集发光光敏剂复合物进行水浴超声处理，得到仿生囊泡复合物。
进一步地，所述步骤(1)的过程包括：制备特定病原体单个菌悬液，将所述特定病原体单个菌悬液加入巨噬细胞中进行刺激，预激活巨噬细胞的细胞膜表达特定病原体特异性受体；使用低渗裂解液低温裂解预激活巨噬细胞，得到细胞膜破裂的细胞悬液，反复冻融所述细胞悬液破碎巨噬细胞膜，然后往细胞悬液中加入PMSF蛋白酶抑制剂，进行机械破碎，接着梯度离心得到预激活巨噬细胞膜。
进一步地，所述步骤(2)的过程包括：将聚乳酸-羟基乙酸单体溶液与聚集发光光敏剂ASTP混匀，然后快速打入PBS缓冲液中，室温搅拌过夜，去除溶剂和游离聚乳酸-羟基乙酸单体，得到ASTP@PLGA纳米粒子。
进一步地，所述步骤(3)的过程包括：将预激活巨噬细胞膜和ASTP@PLGA纳米粒子水浴超声处理，然后挤压得到仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs。
进一步地，所述步骤(1)的详细过程包括：特定病原体和巨噬细胞混匀刺激时的数量比例为10：1，刺激时间为18h，将预激活的巨噬细胞通过400g，5min离心去上清，获得预激活巨噬细胞，加入低渗裂解液，并放置到4℃冰箱静置24h，得到细胞膜破裂的细胞悬液，将上述细胞悬液直接放入到-30℃冰箱2h冷冻结冰，室温解冻，如此反复冻融3-5次破碎细胞膜，细胞悬液中加入PMSF蛋白酶抑制剂，然后冰浴环境下机械破碎巨噬细胞，然后进行梯度离心：首先在4℃，3000g离心30min，收集上清，然后进行超速离心：4℃，200000g离心1.5-2h，收集到的沉淀就是预激活巨噬细胞膜，加入4℃预冷的PBS洗涤一次，洗涤后4℃，200000g离心1.5-2h，得到的沉淀就是预激活巨噬细胞膜；
所述步骤(2)的详细过程是将10.0mg聚乳酸-羟基乙酸单体溶解到1ml四氢呋喃溶液中，然后向其中加入1.0mg聚集发光光敏剂ASTP，将其混合均匀后，利用1ml移液器快速打入到9mL的PBS缓冲液中；之后将混合液进行1000rpm室温、避光搅拌过夜，除去混合液中的THF溶剂，利用300KDa超滤管超滤并洗涤多次，洗去所有未组装的游离PLGA单体，得到ASTP@PLGA纳米粒子；
所述步骤(3)的详细过程是：将5.0mg/ml蛋白浓度的预激活巨噬细胞膜和5.0mg/ml PLGA质量浓度ASTP@PLGA纳米粒子共混后采用功率100W、20-40kHz常温水浴超声处理5-10min，通过脂质体挤出器挤压，依次通过孔径为800nm，400nm和200nm的聚碳酸酯膜，每种孔径均挤出15-20次，最终获得仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs。
制备所得的仿生囊泡复合物BVs其原料来源于天然细胞膜，相比于人工制备的纳米粒子具有逃逸免疫清除、体循环时间长、病灶靶向性高、生物相容性高等优点，有巨大的临床应用前景。更重要的是，BVs自带来源细胞本身的多种表面分子(如蛋白受体、多肽、糖链残基等)，具有靶向识别、毒物中和、免疫阻断和激活等功能。
本发明还提供所述的仿生囊泡复合物在制备杀伤结核菌药物、光动力治疗结核病药物、杀伤海分枝杆菌药物、光动力治疗海分枝杆菌相关疾病药物中的应用。
仿生囊泡复合物在病原靶向前提下，利用其核心的聚集发光敏剂实现精准光动力治疗，在增加PDT疗效的同时，降低对正常细胞的副作用，并可有效杀灭耐药菌。
本发明的优点包括：巨噬细胞被特定病原体刺激后，其细胞膜表面会高表达相应的病原体特异性受体。以预先被结核杆菌/海分枝杆菌激活的巨噬细胞膜(PM膜)为原料合成BVs，并在核心包裹负载有聚集发光光敏剂ASTP的PLGA纳米粒子，最终制备多功能仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs。将ASTP@PLGA@PM BVs静脉注射到体内后，可实现病灶结核肉芽肿/海分枝杆菌肉芽肿(利用血液长循环特性、仿生囊泡复合物90-130nm粒径大小，通过EPR效应)和肉芽肿内病原体M.tb(通过M.tb特异性受体)/海分枝杆菌(通过海分枝杆菌特异性受体)的双重靶向，然后在近红外光照射下实现靶向PDT，在增加抗结核疗效、抗海分枝杆菌相关疾病疗效和减少疗程的同时，降低药物的毒副作用，最终实现TB及耐药性TB、海分枝杆菌相关疾病及耐药性海分枝杆菌相关疾病的综合精准治疗，达到一种多模态综合治疗的目的。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1为基于预激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs的结核病病原靶向和精准光动力治疗原理图；
图2为巨噬细胞被海分枝杆菌激活后细胞膜表面病原相关受体(TLR2,TLR4,TLR6)表达量上升图；
图3为聚集发光光敏剂ASTP的化学合成路线图；
图4为预激活巨噬细胞膜提取及仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs制备原理图；
图5A为仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs的水合粒径图；
图5B为仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs的zeta电位图；
图5C为仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs的粒径稳定性图；
图5D为仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs的透射电镜图像；
图6为聚集发光光敏剂ASTP和仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs的紫外-可见吸收光谱曲线图；
图7A为仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs的蛋白组分图；
图7B为仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs的病原相关受体表达图；
图8为仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs的体外近红外激光照射下氧自由基(ROS)产生效率图；
图9为仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs对海分枝杆菌感染斑马鱼胚胎局部结核结节模型中结节的靶向成像图；
图10为仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs对H37Ra感染小鼠肺部结节模型中结节的靶向成像图；
图11为仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs对结核菌的特异性靶向成像图；
图12A为仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs对结核菌的体外杀伤CFU涂板图；
图12B为仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs CFU计数统计图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
需要注意的是：海分枝杆菌是研究结核分枝杆菌的一种优良模型，其与结核分枝杆菌的基因相似性高达95％以上。本说明书中以海分枝杆菌作为结核杆菌替代菌开展实验，各实验结论同样适用于结核分枝杆菌。
实施例1.海分枝杆菌刺激巨噬细胞表面表达多种M.tb相关受体
将海分枝杆菌(M.m)通过三区划线法接种到7H10(含有OADC，这是M.m生长的必须营养成分混合物)固体培养基上，32℃避光培养14-21天(使得M.m处于对数生长期)。挑取一定量M.m菌落放入到1ml DMEM细胞培养液中，随后用带有29G针头的1ml注射器反复抽吸上述含有M.m菌的DMEM细胞培养液20-30次，使聚团在一起的菌体充分分散，得到M.m悬液；随后将上述M.m悬液通过5μm孔径的针式过滤器，收集过滤后的M.m悬液为M.m单个菌悬液，进行OD600吸光度检测，通过稀释使得M.m悬液OD600吸光度在0.2左右，通过计算，此时的悬液中M.m的菌浓度为4.6×107个/ml左右。随后，将上述M.m悬液加入到已经生长到80％左右细胞密度的小鼠巨噬细胞系RAW264.7进行刺激，细菌和细胞的数量比例(感染复数MOI)为10：1，刺激时间为18h。随后，收集刺激后以及未经过M.m刺激(对照组)的巨噬细胞进行流式表面染色，检测TLR2,TLR4,TLR6三种病原相关受体的表达水平。结果参考图2，流式结果显示，经过M.m的预先刺激后，巨噬细胞RAW264.7细胞表面的病原相关受体TLR2,TLR4,TLR6的表达水平都显著上升，证明M.m可以成功激活巨噬细胞表达多种M.tb相关受体。
实施例2.聚集发光光敏剂ASTP的合成
聚集发光光敏剂ASTP的合成步骤参考现有技术《Fabrics Attached with HighlyEfficient Aggregation-Induced Emission Photosensitizer:Toward Self-AntiviralPersonal Protective Equipment》，具体合成路线如图3所示。
实施例3.预激活巨噬细胞膜(PM膜)提取和仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs的制备
PM膜提取：将预激活的巨噬细胞RAW264.7通过400g，5min离心去上清，获得细胞，加入低渗裂解液(1份PBS缓冲液和4份Milli-Q超纯水配置而成)，并放置到4℃冰箱静置24h，使得细胞在低渗溶液作用下，细胞膜破裂，得到细胞悬液。随后，将上述细胞悬液直接放入到-30℃冰箱2h左右，彻底冷冻结冰，然后拿出来放置室温解冻，如此反复冻融3-5次，冻融过程中的冰晶刺破细胞使得细胞膜破碎。随后，将细胞悬液转移到玻璃组织研磨器中，通过玻璃组织研磨器上的磨砂，在冰浴环境下充分研磨30-50次使得细胞充分机械破碎；在研磨前，细胞悬液中加入1/100体积的PMSF蛋白酶抑制剂(原浓度为100mM，美国sigma公司)，抑制细胞损伤过程中释放的蛋白酶活性，从而防止细胞膜蛋白被这些蛋白酶降解。随后，将充分研磨后的细胞悬液进行梯度离心，首先在4℃，3000g离心30min，收集上清，然后进行超速离心：4℃，200000g离心1.5-2h，收集到的沉淀就是PM膜，加入4℃预冷的PBS洗涤一次，洗涤后4℃，200000g离心1.5-2h，得到的沉淀就是PM膜，直接冻-80℃冰箱长期保存。
ASTP@PLGA纳米粒子制备：将10.0mg聚乳酸-羟基乙酸单体(PLGA，美国sigma公司)溶解到1ml四氢呋喃(THF)溶液中，然后向其中加入1.0mg聚集发光光敏剂ASTP，将其混合均匀后，利用1ml移液器快速打入到9mL的PBS缓冲液中。之后将混合液倒入30ml的圆底烧瓶中，加入磁子进行1000rpm室温、避光搅拌过夜，除去混合液中的THF溶剂。利用300KDa超滤管超滤并洗涤多次，洗去所有未组装的游离PLGA单体，得到ASTP@PLGA纳米粒子。
仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs制备：将5.0mg/ml蛋白浓度的PM膜和5.0mg/mlPLGA质量浓度ASTP@PLGA纳米粒子共混后采用功率100W、20-40kHz常温水浴超声处理5-10min，通过脂质体挤出器挤压，依次通过孔径为800nm，400nm和200nm的聚碳酸酯膜，每种孔径均挤出15-20次。最终获得仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs。当然，本领域技术人员也可以根据粒径需要调整脂质体挤出器聚碳酸酯膜孔径大小来制备所需大小的仿生囊泡复合物。
PM膜提取和ASTP@PLGA@PM BVs制备的具体制备流程见图4。
基于预激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs的结核病病原靶向和精准光动力治疗原理如图1所示。
将制备得到的ASTP@PLGA@PM BVs进行以下表征：
(1)使用ZetasizerNano纳米粒度/zeta电位检测仪：ZetasizerNano纳米粒度/zeta电位检测仪图显示了ASTP@PLGA@PM BVs的水合粒径分布及zeta电位值，纳米粒度结果如图5A表示，仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs的水合粒径约为90-130nm；Zeta电位结果如图5B表示，其表面带负电，为-25mV左右；水合粒径监测结果如图5C显示，其在PBS缓冲液和健康小鼠血清中可较长时间保持粒径基本不变，证实了其稳定性。
(2)使用透射电子显微镜(TEM)：透射电镜图像表示ASTP@PLGA@PM BVs的形貌和纳米尺寸，结果参照图5D，在100nm的标尺下，ASTP@PLGA@PM BVs尺寸为100nm左右，与水合粒径结果相似；其结构为典型的膜包核球型结构，证实了PM膜成功包覆到ASTP@PLGA纳米粒子表面，形成完整的ASTP@PLGA@PM BVs结构。
(3)使用紫外-可见分光光度计(UV-Vis)：设置空白组，ASTP@PLGA@PM BVs组，ASTP(THF中)组，空白组为水，紫外-可见吸收光谱表示ASTP@PLGA@PM BVs的特征性吸收光谱。结果参照图6，ASTP@PLGA@PM BVs的特征性吸收峰和聚集发光光敏剂ASTP的特征性吸收峰相似，求峰值都在780nm左右，证明其可被近红外808nm激光器激发，具有穿透到深部组织，用于深部结核菌感染光动力治疗的潜力。
(4)使用聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE及western蛋白印迹方法：SDS-PAGE用于检测ASTP@PLGA@PM BVs的总蛋白组分，设置PLGA纳米粒子组、巨噬细胞裂解物组、ASTP@PLGA@PM BVs组，进行SDS-PAGE，结果参照图7A，相比于PLGA纳米粒子，ASTP@PLGA@PM BVs具有明显的蛋白成分；此外，相比于巨噬细胞全细胞裂解液蛋白组分，ASTP@PLGA@PM BVs存在明显差异，表明其蛋白只来源于巨噬细胞膜，而非全细胞，证明ASTP@PLGA@PM BVs是有PM包覆到PLGA纳米粒子制备而成。
western蛋白印迹用于检测ASTP@PLGA@PM BVs是否带有M.tb病原相关受体，参照ASTP@PLGA@PM BVs的制备方法，采用未预先激活的巨噬细胞膜包覆到ASTP@PLGA纳米粒子表面得到仿生囊泡ASTP@PLGA@M BVs，设置巨噬细胞裂解物组、ASTP@PLGA@PM BVs组、ASTP@PLGA@M BVs组，进行western蛋白印迹实验，结果参照图7B，相比于巨噬细胞，ASTP@PLGA@PMBVs具有明显TLR2,TLR4等病原相关受体的表达；另外，相比于未预先激活的巨噬细胞膜来源的仿生囊泡ASTP@PLGA@M BVs，ASTP@PLGA@PM BVs的TLR2,TLR4等病原相关受体的表达量更高。
(5)ABDA试剂盒检测ROS产率：ABDA(美国sigma公司)拥有3个特征性吸收峰，其峰值与浓度呈正比。当溶液中存在活性氧ROS时，ABDA会被迅速降解，其3个吸收峰会下降。用0.2mW/cm2功率的808nm激光器照射含有ASTP@PLGA@PM BVs的ABDA水溶液后，结果参照图8，ABDA的3个特征性吸收峰会随照射时间而梯度下降，证明ASTP@PLGA@PM BVs在近红外光照下能产生大量的活性氧ROS。
(6)结核结节体内靶向成像能力：将ASTP@PLGA@PM BVs的PBS缓冲液通过静脉注射到已构建了海分枝杆菌(Mycobacterium marinum，M.m)感染所致的斑马鱼局部结节模型和结核分枝杆菌减毒株H37Ra感染所致的小鼠肺部结节模型的动物体内后，经过一段时间的体内循环，用荧光显微镜和小动物荧光成像系统观察ASTP@PLGA@PM BVs对结节的靶向成像效果。结果参照图9，在成功构建局部结节的斑马鱼胚胎体内，静脉注射ASTP@PLGA@PM BVs后循环12h，通过倒置荧光显微镜观察，发现仿生囊泡能够成功与结节共定位，表明其体内的病灶靶向成像能力。结果参照图10，在成功构建肺部结节的小鼠体内，静脉注射ASTP@PLGA@PM BVs仿生囊泡复合物后循环18h，通过小动物荧光成像系统观察，发现纳米胶束能够成功与肺部单个结节共定位，表明其体内的结节病灶靶向成像能力。
(7)结核菌特异性靶向能力：将基于未激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@M BVs、仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs在体外与带有绿色荧光蛋白(GFP)的海分枝杆菌共孵育10min后，用共聚焦显微镜观察仿生囊泡特异性靶向并结合到海分枝杆菌表面的能力。结果参照图11，相比于仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@M BVs，仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs靶向并结合到海分枝杆菌表面的能力显著增强，证实了其特异性受体配体结合效果。
(8)光动力杀菌能力：利用PBS缓冲液、基于未激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@M BVs、仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs在体外与海分枝杆菌共孵育30min后，随后用0.2mW/cm2功率的808nm激光器照射10min后，利用CFU涂板计数判断其杀菌和抑菌能力，同时设立未光照组作为对照。结果参照图12，未光照下，PBS缓冲液、ASTP@PLGA@MBVs、ASTP@PLGA@PM BVs对结核菌都没有明显杀伤作用，证明ASTP@PLGA@PM BVs本身基本没有暗毒性。在808nm激光器照射下，与PBS缓冲液相比，ASTP@PLGA@M BVs和ASTP@PLGA@PMBVs都可以使得结核菌的CFU明显下降，说明ASTP@PLGA@M BVs和ASTP@PLGA@PM BVs对结核菌有光动力杀伤作用依赖于核心装载的聚集发光光敏剂ASTP。并且，ASTP@PLGA@PM BVs对结核菌的光动力杀伤效果更加显著，这是由于PM膜对结核菌的特异性靶向，拉近了仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs和细菌之间的距离，增加了光动力疗效导致的。上述结果证明，仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs能够通过光动力更为有效的杀死结核杆菌，并利用其对结核菌的特异性靶向显著增强光动力效果。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (6)
1.一种基于预激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物，其特征在于：
所述仿生囊泡复合物是膜包核结构，其核为聚集发光光敏剂复合物，所述聚集发光光敏剂复合物是聚集发光光敏剂ASTP与载体PLGA复合形成的纳米粒子；所述聚集发光光敏剂ASTP的化学结构为：
；
其膜是表达特定病原体特异性受体的预激活巨噬细胞膜，所述预激活巨噬细胞膜的制备过程包括：制备特定病原体单个菌悬液，将所述特定病原体单个菌悬液加入巨噬细胞中进行刺激，预激活巨噬细胞的细胞膜表达特定病原体特异性受体；使用低渗裂解液低温裂解预激活巨噬细胞，得到细胞膜破裂的细胞悬液，反复冻融所述细胞悬液破碎巨噬细胞膜，然后往细胞悬液中加入PMSF蛋白酶抑制剂，进行机械破碎，接着梯度离心得到预激活巨噬细胞膜，所述特定病原体选自结核杆菌、海分枝杆菌；
所述仿生囊泡复合物直径为90-130 nm。
2.一种如权利要求1所述的基于预激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物制备方法，其特征在于：
步骤包括：
（1）特定病原体刺激巨噬细胞，提取表达特定病原体特异性受体的预激活巨噬细胞膜；
（2）聚集发光光敏剂ASTP与载体复合制备得到聚集发光光敏剂复合物；
（3）将步骤（1）提取得到的预激活巨噬细胞膜、步骤（2）制备得到的聚集发光光敏剂复合物进行水浴超声处理，得到仿生囊泡复合物。
3.根据权利要求2所述的一种基于预激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物制备方法，其特征在于：
所述步骤（2）的过程包括：将PLGA单体溶液与聚集发光光敏剂ASTP混匀，然后快速打入PBS缓冲液中，室温搅拌过夜，去除溶剂和游离PLGA单体，得到ASTP@PLGA纳米粒子。
4.根据权利要求3所述的一种基于预激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物制备方法，其特征在于：
所述步骤（3）的过程包括：将预激活巨噬细胞膜和ASTP@PLGA纳米粒子水浴超声处理，然后挤压得到仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs。
5.根据权利要求2-4任一所述的一种基于预激活巨噬细胞膜的仿生囊泡复合物制备方法，其特征在于：
所述步骤（1）的详细过程包括：特定病原体和巨噬细胞混匀刺激时的数量比例为10：1，刺激时间为18 h，将预激活的巨噬细胞通过400g，5min离心去上清，获得预激活巨噬细胞，加入低渗裂解液，并放置到4℃冰箱静置24 h，得到细胞膜破裂的细胞悬液，将上述细胞悬液直接放入到-30℃冰箱2 h冷冻结冰，室温解冻，如此反复冻融3-5次破碎细胞膜，细胞悬液中加入PMSF蛋白酶抑制剂，然后冰浴环境下机械破碎巨噬细胞，然后进行梯度离心：首先在4℃，3000 g 离心30min，收集上清，然后进行超速离心：4℃，200000g 离心1.5-2h，收集到的沉淀就是预激活巨噬细胞膜，加入4℃预冷的PBS洗涤一次，洗涤后4℃，200000g离心1.5-2h，得到的沉淀就是预激活巨噬细胞膜；
所述步骤（2）的详细过程是将10.0mg PLGA单体溶解到1ml四氢呋喃溶液中，然后向其中加入1.0mg 聚集发光光敏剂ASTP，将其混合均匀后，利用1ml移液器快速打入到9mL的PBS缓冲液中；之后将混合液进行1000rpm室温、避光搅拌过夜，除去混合液中的四氢呋喃溶剂，利用300KDa超滤管超滤并洗涤多次，洗去所有未组装的游离PLGA单体，得到ASTP@PLGA纳米粒子；
所述步骤（3）的详细过程是：将5.0 mg/ml蛋白浓度的预激活巨噬细胞膜和5.0 mg/mlPLGA质量浓度ASTP@PLGA纳米粒子共混后采用功率100W、20-40 kHz常温水浴超声处理5-10min，通过脂质体挤出器挤压，依次通过孔径为800 nm，400 nm和200 nm的聚碳酸酯膜，每种孔径均挤出15-20次，最终获得仿生囊泡复合物ASTP@PLGA@PM BVs。
6.如权利要求1所述的仿生囊泡复合物在制备杀伤结核菌药物、光动力治疗结核病药物、杀伤海分枝杆菌药物、光动力治疗海分枝杆菌相关疾病药物中的应用。
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