CN115247131A - 深绿木霉及代谢产物和应用 - Google Patents

深绿木霉及代谢产物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域,具体地说是一株海藻内生真菌深绿木霉RR‑dl‑3‑9及其粗提物抑菌方面的应用和一种内酯类化合物的制备方法及其抑菌方面的应用。其具体结构式如(Ⅰ)所示,制备方法为将松节藻内生真菌深绿木霉(Trichoderma atroviride)RR‑dl‑3‑9真菌培养基中发酵培养,发酵产物经过分离纯化,得到式(Ⅰ)所示的内酯类化合物。本发明获得的内酯类化合物对细菌具有一定的抑菌活性。

Description

深绿木霉及代谢产物和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,具体地说是一株深绿木霉RR-dl-3-9及代谢产物(内酯类化合物)和菌株、代谢产物的抑菌应用。
背景技术
木霉是世界范围广泛分布的真菌,目前已知的木霉有300多种,其在土壤、水体、植物、植物残体和根际中普遍存在。木霉对多种病原菌具有防治作用可以有效防治多种植物病害。近年来研究表明深绿木霉在农业生防方面有显著作用,作为生防菌株具有巨大的应用潜力,对人类生产、生活和生态良好可持续发展具有重要意义。
随着海水养殖集约化的快速发展,致病性细菌引起的病害已被认为是海水鱼类和贝类养殖产业的"灾祸之源",该病发生范围广、致死率高,且能够引起人畜共患,是水产养殖病害防治领域的主要难题之一,严重阻碍了渔业养殖和海洋经济发展,因此找到高效遏制致病性细菌同时又对环境友好的解决方法成为人们日益迫切的需要。
与水产养殖业中使用的传统抗生素和化学合成药物相比,海洋生物源天然药物具有安全性高、针对性强、活性显著、对环境友好且能够解决目前大部分水产病害细菌对传统抗生素的耐药性问题,为解决目前水产养殖过程中的细菌性病害防治问题提供了新的思路。
发明内容
本发明的目的是提供一株深绿木霉RR-dl-3-9及代谢产物(内酯类化合物)和菌株、代谢产物的抑菌应用。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一株深绿木霉菌株,深绿木霉菌株RR-dl-3-9,于2021年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号CCTCC M 2021425,地址:湖北省武汉市武昌区八一路299号。
一株深绿木霉的应用,所述深绿木霉在作为抑菌制剂中的应用。
所述菌为细菌。
所述细菌为柠檬假交替单胞菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌。
一种抗菌制剂,抗菌制剂中所述菌株。
所述抗菌制剂含所述深绿木霉、该菌株粗提物、该菌株代谢产物中的一种或几种。
所述粗提物为:
1)将深绿孢木霉(Trichoderma atroviride)RR-dl-3-9菌株接种于PDA固体培养基中,在25℃活化5-7d,制得活化菌株;
2)将步骤1)制得的活化菌株接种至大米固体培养基、菊糖液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基中,在25℃的条件下发酵培养10-60天;
3)用适量的乙酸乙酯灭菌48h,菌丝晾干后粉碎,用二氯甲烷:甲醇(1-0:1,v/v)提取,40℃减压蒸馏得到粗提物。
一株深绿木霉的应用,所述菌株在制备内酯类化合物的应用。
一株内酯类化合物结构式如式(Ⅰ)所示。
Figure BDA0003043470660000021
一种内酯类化合物的制备方法,将松节藻的内生真菌深绿木霉(Trichodermaatroviride)RR-dl-3-9接种于真菌培养基中发酵培养,发酵产物经纯化后,即为式(I)所示的内酯类化合物;
具体制备步骤:
1)将深绿木霉(Trichoderma atroviride)RR-dl-3-9接种于真菌培养基中,发酵10-60天,之后经有机溶剂提取并浓缩,得到其粗提物;
2)取步骤1)中获取的粗提物进行硅胶柱层析,有机溶剂进行梯度洗脱,收集洗脱液,洗脱液经薄层层析检测;
3)收集步骤2)中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析、凝胶柱层析、硅胶柱层析、制备薄层层析,即得如式(I)所示的内酯类化合物。
步骤1)中真菌培养基为大米固体培养基、菊糖液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基;
有机溶剂提取液为乙酸乙酯、石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中一种或几种。
步骤2)中洗脱液为体积比50-0:1的石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙醇、石油醚-丙醇、石油醚-异丙醇、二氯甲烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、二氯甲烷-丙醇、二氯甲烷-异丙醇中的一组或几组。
步骤3)所述反相硅胶柱层析洗脱液为体积比13:7-9:1的甲醇-水或乙醇-水;凝胶柱层析洗脱液为体积比2-0:1的二氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-乙醇;硅胶柱层析洗脱液为体积比6-0:1的石油醚-乙酸乙酯或二氯甲烷-乙酸乙酯;制备薄层层析展开剂为体积比20-0:1的石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙醇、石油醚-丙醇、石油醚-异丙醇、二氯甲烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、二氯甲烷-丙醇、二氯甲烷-异丙醇中的一组或几组。
一种内酯类化合物的应用,所述的内酯类化合物抑菌方面的应用。
所述化合物用于制备抑菌剂。
所述细菌为柠檬假交替单胞菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌。
本发明具有以下优点:
本发明提供一株分离于海洋松节藻内生真菌深绿木霉RR-dl-3-9,该木霉及其粗提物对多种海洋细菌具有显著的抑制作用,同时本发明所获得内酯类化合物分离于深绿木霉的次生代谢产物,经活性实验得出该化合物对柠檬假交替单胞菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌的抑菌圈直径分别为7.7毫米、11毫米、10毫米、9.7毫米和7.7毫米,可见本发明菌株是一株有潜力的抗菌的木霉,可以减少化学药剂的使用,对农业生产和生态环境均具有良好的发展应用前景。
具体实施方式:
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明,应当指出的是,此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明,并不局限于本发明。
实施例1
深绿木霉(Trichoderma atroviride)RR-dl-3-9的获取:
1、菌株的分离:
菌株RR-dl-3-9分离自2017年8月从大连海域采集的松节藻内生真菌,分离方法为将海藻用无菌海水冲洗3次,用75%的无水乙醇浸泡0.5-1分钟,无菌海水漂洗4次,样品用无菌刀片切片或者切块插入无菌PDA培养基上,25℃条件下培养,定期观察生长情况,挑取单菌落,反复运用平板划线法纯化得到单一菌落。
2、菌株的鉴定:
2.1、形态学及生理生化特征鉴定:
该菌株生物学特性,在PDA培养基上,25℃恒温培养时,生长初期为白色菌丝体,后期生长出绿色木霉孢子,初步鉴定为木霉。
2.2、分子鉴定:
菌种鉴定通过形态学观察并通过提取并克隆该菌种核糖体rDNA基因转录间隔序列(ITS1-5.8S-ITS2全长序列)然后进行基因测序,将得到的菌株序列与Genbank中已知菌株的基因序列进行对比。经检索比对该菌株与Trichoderma atroviride DNA序列相似度为100%,故将其鉴定为Trichoderma atroviride。提取并克隆该菌种核糖体rDNA基因转录间隔序列进行基因测序,得到基因序列如下:
AACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA,经过检索对比,将菌株RR-dl-3-9确定为深绿木霉(Trichodermaatroviride)。
实施例2
深绿木霉RR-dl-3-9粗提物的制备方法:
1)将深绿木霉(Trichoderma atroviride)RR-dl-3-9菌株接种于PDA固体培养基中,在25℃活化5-7天,制得活化菌株;
2)将步骤1)制得的活化菌株切成小块接种至马铃薯葡萄糖液体培养基中,在25℃的条件下发酵培养15天;
3)用适量的乙酸乙酯灭菌48小时,菌丝晾干后粉碎,用二氯甲烷:甲醇(1:1,v/v)萃取,减压蒸馏得到粗提物。
所述的马铃薯葡萄糖液体培养基成分:马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,蛋白胨5g/L,酵母浸粉5g/L,海水1000mL/L,pH值7.0~8.0。
实施例3
海藻内生真菌来源的内酯类化合物结构如式(I)所示。
Figure BDA0003043470660000041
该化合物具有以下理化和波谱特性:
无色油状;比旋光度[α]20 D=+28(c 0.20,MeOH);核磁共振氢谱(DMSO-d6,500MHz)δH 2.61dd(17.3,4.6),2.38ddd(17.3,3.5,1.8),4.10m,1.80m,1.63ddd(14.2,11.4,3.1),4.54m,1.58m,1.52m,1.39m,1.31m,1.27m,1.27m,1.25m,1.27m,0.86t(7.0),5.16d(3.2);核磁共振碳谱(DMSO-d6,125MHz)δC 170.3(C),38.6(CH2),61.3(CH),35.1(CH2),75.4(CH),35.0(CH2),24.5(CH2),28.8(CH2),28.6(CH2),31.2(CH2),22.1(CH2),14.0(CH3);高分辨质谱[M]+m/z 214.1568,计算值214.1569。
实施例4
如式(I)所示的内酯类化合物的制备方法:
将深绿木霉(Trichoderma atroviride)RR-dl-3-9菌株接种于PDA培养基中,在25℃活化5-7天,制得活化菌株;取生长良好的菌株,切成小块接种于大米固体培养基中,每1升三角瓶中放大米50g,菊糖2.2g,蛋白胨0.55g,酵母0.55g,溴化钙0.033g,味精0.33g,海水55mL,纯净水55mL,pH值7.0~8.0,共200瓶,室温静止发酵30天,用适量的乙酸乙酯灭菌48小时,菌丝晾干后粉碎,用二氯甲烷:甲醇(1:1,v/v)提取,40℃减压蒸馏得到粗提物120克。
深绿木霉(Trichoderma atroviride)RR-dl-3-9于2021年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号CCTCC M 2021425,地址:湖北省武汉市武昌区八一路299号,分类命名为Trichoderma atroviride,株号为RR-dl-3-9。
将粗提物经100-200目的硅胶柱层析,依次用体积比20:1、10:1、5:1、2:1、1:1到0:1的石油醚-乙酸乙酯和5:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱,得到7段洗脱液,收集各段洗脱液,再用薄层层析(TLC)检测各段组分(体积比50-1:1的二氯甲烷-甲醇展开,茴香醛-硫酸和碘显色),根据Rf值来判断、合并相同或类似部分,获得7个组分(1-7)。
将Rf值为0.6-0.7(体积比1:1的二氯甲烷-乙酸乙酯展开,茴香醛-硫酸显灰色)的组分5,即以体积比1:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱下的组分再依次经反相C18硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱、硅胶柱层析和制备薄层层析。反相C18硅胶柱层析洗脱液为体积比13:7的甲醇-水,TLC检测(体积比1:1的二氯甲烷-乙酸乙酯展开,茴香醛-硫酸显灰色),收集茴香醛-硫酸显灰色的组分;收集组分经Sephadex LH-20凝胶柱层析时洗脱液为体积比1:1的二氯甲烷-甲醇,TLC检测(体积比1:1的二氯甲烷-乙酸乙酯展开,茴香醛-硫酸显灰色),收集茴香醛-硫酸显灰色得组分;收集组分经硅胶柱层析洗脱液为体积比3:1的石油醚-乙酸乙酯,TLC检测(体积比1:1的二氯甲烷-乙酸乙酯展开,茴香醛-硫酸显灰色),收集茴香醛-硫酸显灰色得组分;收集组分再经过制备薄层层析,展开剂为体积比1:1二氯甲烷-乙酸乙酯,收集Rf值为0.6-0.7,茴香醛-硫酸显灰色组分,即为式(I)所示化合物(22.0毫克)。经薄层层析检测(体积比1:1的二氯甲烷-乙酸乙酯展开,茴香醛-硫酸显灰色),呈单个、均匀斑点,确定为纯化合物。通过解析其波谱数据,其结构鉴定为一种内酯类化合物,结构式如(I)所示。
Figure BDA0003043470660000051
实施例5
深绿木霉RR-dl-3-9粗提物抑菌活性实验
具体为:供试细菌接种于2216E培养基,并于37℃培养24小时,而后吸取4毫升无菌的0.85%NaCl溶液进行洗涤培养物,并用玻璃刮刀将菌轻轻刮下,用移液枪吸取适量菌悬液于无菌试管中,应用比浊法,然后用0.85%NaCl溶液将菌悬液稀释至1.5×108CFU/毫升。其中,供试菌株为:柠檬假交替单胞菌和鳗弧菌。
培养基中加入200微升菌液,用涂布器进行均匀涂布。测试上述实施例获得粗提物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,浓度为20.0毫克/毫升。取5微升样品加到直径为5毫米的无菌滤纸片上(每片100微克),并用加有相同体积DMSO的滤纸片做阴性对照,用氯霉素作为阳性对照,各三个平行。加有样品的平板培养基置于37℃静置培养24小时,观察实验结果,测量其抑菌圈直径。
实验结果:上述获得的深绿木霉粗提物对柠檬假交替单胞菌和鳗弧菌的抑菌圈直径分别为12毫米和7.5毫米,具有一定抑制柠檬假交替单胞菌和鳗弧菌的作用。
实施例6
内酯类化合物抑菌活性实验
具体为:供试细菌接种于2216E培养基,并于37℃培养24小时,而后吸取4毫升无菌的0.85%NaCl溶液进行洗涤培养物,并用玻璃刮刀将菌轻轻刮下,用移液枪吸取适量菌悬液于无菌试管中,应用比浊法,然后用0.85%NaCl溶液将菌悬液稀释至1.5×108CFU/毫升。其中,供试菌株分别为:柠檬假交替单胞、鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血性弧菌或灿烂弧菌。
培养基中加入200微升菌液,用涂布器进行均匀涂布。测试样品(式(I)所示内酯类化合物)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,浓度为10.0毫克/毫升。取5微升样品加到直径为5毫米的无菌滤纸片上(每片50微克),并用加有相同体积DMSO的滤纸片做阴性对照,用氯霉素作为阳性对照,各三个平行。加有样品的平板培养基置于37℃静置培养24小时,观察实验结果,测量其抑菌圈直径。
实验结果:上述获得的内酯类化合物对致病性细菌柠檬假交替单胞菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血性弧菌和灿烂弧菌的抑菌圈直径分别为7.7毫米、11毫米、10毫米、9.7毫米和7.7毫米,具有一定抑制柠檬假交替单胞菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血性弧菌或灿烂弧菌的活性。
序列表
<110> 中国科学院烟台海岸带研究所
<120> 深绿木霉及代谢产物和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacccaatgt gaaccatacc aaactgttgc ctcggcgggg tcacgccccg ggtgcgtcgc 60
agccccggaa ccaggcgccc gccggaggga ccaaccaaac tcttttctgt agtcccctcg 120
cggacgttat ttcttacagc tctgagcaaa aattcaaaat gaatcaaaac tttcaacaac 180
ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt 240
gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg cgcccgccag tattctggcg 300
ggcatgcctg tccgagcgtc atttcaaccc tcgaacccct ccggggggtc ggcgttgggg 360
acctcgggag cccctaagac gggatcccgg ccccgaaata cagtggcggt ctcgccgcag 420
cctctcctgc gcagtagttt gcacaactcg caccgggagc gcggcgcgtc cacgtccgta 480
aaacacccaa ctttctgaaa tgttgacctc ggatcaggta ggaatacccg ctgaacttaa 540

Claims (10)

1.一株深绿木霉菌株,其特征在于:深绿木霉菌株RR-dl-3-9,于2021年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号CCTCC M 2021425,地址:湖北省武汉市武昌区八一路299号。
2.一种权利要求1所述的深绿木霉的应用,其特征在于:所述深绿木霉在制备抗菌制剂中的应用。
3.按权利要求2所述的深绿木霉的应用,其特征在于:所述菌为细菌。
4.一种抗菌制剂,其特征在于:抗菌制剂中含权利要求1所述菌株。
5.按权利要求4所述的抗菌制剂,其特征在于:所述抗菌制剂含权利要求1所述深绿木霉、该菌株粗提物、该菌株代谢产物中的一种或几种。
6.一种权利要求1所述的深绿木霉的应用,其特征在于:所述菌株在制备内酯类化合物的应用。
7.一种内酯类化合物,其特征在于:结构式如式(Ⅰ)所示。
Figure FDA0003043470650000011
8.一种权利要求7所述的内酯类化合物的制备方法,其特征在于:将松节藻来源的真菌深绿木霉(Trichoderma atroviride)RR-dl-3-9接种于真菌培养基中发酵培养,发酵产物经纯化后,即为式(I)所示的内酯类化合物。
9.按权利要求8所述的内酯类化合物的制备方法,其特征在于具体制备步骤:
1)将深绿木霉(Trichoderma atroviride)RR-dl-3-9接种于真菌培养基中,发酵10-60天,经有机溶剂提取并浓缩,得到其粗提物;
2)取步骤1)中获取的粗提物进行硅胶柱层析,有机溶剂进行梯度洗脱,收集洗脱液,洗脱液经薄层层析检测;
3)收集步骤2)中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析、凝胶柱层析、硅胶柱层析、制备薄层层析,即得如式(I)所示的内酯类化合物。
10.一种权利要求7所述的内酯类化合物的应用,其特征在于:所述的内酯类化合物用于制备细菌的抑菌剂。
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