CN115245598B - 一种钴离子缓释材料及其制备方法与应用 - Google Patents
一种钴离子缓释材料及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种钴离子缓释材料及其制备方法与应用。本发明将钴离子与咪唑类配体通过Co‑N化学键连接，合成钴基金属‑有机框架，将钴基金属‑有机框架搭载到甲基丙烯酸酐化明胶上构建一种钴离子缓释材料；通过改变钴基金属‑有机框架内咪唑类配体的掺杂比例，进一步调控钴离子释放模式，从而实现从7天到21天的不同释放模式；所构建的钴离子缓释材料在释放模式上更适应骨再生中的早期血管新生；本发明的钴离子缓释材料具有优异的组织和细胞相容性，不会引起毒副作用，成本低廉且制备简单，具有进一步结合其他材料应用的广阔前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料领域，尤其涉及一种钴离子缓释材料及其制备方法与应用。
背景技术
由于创伤、感染及肿瘤造成的骨组织缺损一直是骨科领域亟待解决的难点。为解决自体骨移植对患者本身的创伤，各种骨组织替代的生物材料层出不穷。近年来，血管新生在骨再生中的作用愈来愈得到重视，早期充分、快速的成血管过程可以极大地促进成骨过程；因而，促进血管化生物材料在骨缺损的应用前景十分广阔。然而，目前的促血管化材料多添加外源性生长因子、细胞或基因片段，仍存在较大的生物安全隐患。近年来学者认为，通过激活修复相关信号通路激活局部组织的修复能力的仿生型修复材料可以解决生物安全方面的隐患。
钴离子可以在细胞周围模拟低氧环境，激活低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α)信号通路，高效促进局部血管新生进而促进组织再生。然而，当钴离子浓度过高时，会对机体产生毒性并造成包括神经、心血管和内分泌等多个系统的毒副作用。因此，钴离子的应用必须是以缓释的形式，以较低的浓度缓慢释放以避免钴离子过度富集产生毒性。目前，已有研究人员提出将钴离子以化学配位的形式掺杂在生物玻璃等支架材料中。Yunfei Zheng等人将钴离子以化学配位的方式掺杂进三磷酸钙(TCP)支架中，制备了钴-三磷酸钙支架(Co-TCP)用作骨组织工程支架，实现了体外超过60天的钴离子释放；他们的体外实验结果表明，相比于单纯的TCP支架，Co-TCP可以更好地促进体外成血管及成骨活动(Materials Science&Engineering C 99(2019)770-782.)。王晓伟等人公开了一种含纳米磷化钴的胶原-羟基磷灰石支架；他们首先制备了纳米磷化钴，随后将其与胶原-羟基磷灰石溶液混合均匀后一步法冻干并交联制备获得该支架，为创面提供了合理的纳米磷化钴缓释体系，为创面提供长期有效的药物缓释(专利CN106552289A)。这些研究及发明均为钴离子缓释及在骨再生中的应用提供了一定的解决方案。但是，文献研究表明，钴离子可能对破骨细胞介导的骨吸收作用具有促进作用。Chen等的研究表明钴离子在体内的长期作用可以通过激活骨免疫及破骨活动促进骨吸收(Biomaterials 2015,61,126-38.)。骨再生活动中血管新生的活跃期为早期的2-4周；而破骨活动多活跃在中晚期的骨重塑阶段。因此，在骨再生过程中钴离子应尽可能地在早期释放(2-4周)，以充分地形成新生血管，加速骨再生过程；而当中晚期的骨重塑阶段，不应释放钴离子，以避免激活骨吸收活动。因此，上述材料学的方法虽然实现了钴离子的缓释，然而其释放周期过长(约60天)，并不适应于骨再生的修复过程，难以真正通过缓释钴离子促进骨新生。
基于钴离子在骨再生过程中不同时期的作用，理想的钴离子递送材料应具有以下特征：可以长效、稳定地释放钴离子；钴离子释放出的浓度应既不造成生物危害，又可以激活血管新生作用；释放周期适应骨再生中血管新生活跃的2-4周。目前，并没有技术方案能够实现上述要求。
因此，亟需一种可实现钴离子缓释、且其钴离子释放模式可控的钴离子缓释材料及其制备方法与应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种钴离子缓释材料及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明的第一方面是提供一种钴离子缓释材料的制备方法，步骤包括：
S1、分别称取六水合硝酸钴以及咪唑类配体；将所述六水合硝酸钴溶解于第一有机溶剂中，将所述咪唑类配体溶解于第二有机溶剂中；将所述六水合硝酸钴的溶液与所述咪唑类配体的溶液混合，并于室温下搅拌反应一段时间；待反应完成后，通过第三有机溶剂以及水依次清洗离心所得到的紫色晶体沉淀若干次，真空烘干后即得钴基金属-有机框架；
S2、称取明胶，并将所述明胶溶解于PBS溶液中；通过微流控微泵，将甲基丙烯酸加入到所述明胶的溶液中，并搅拌反应一段时间；待反应完成后，加入5×PBS溶液中止反应；通过透析去除其中的盐离子以及未反应的甲基丙烯酸，并真空冻干后即得甲基丙烯酸酐化明胶固体；
S3、将步骤S2所制得的所述甲基丙烯酸酐化明胶固体溶解，在避光的情况下依次加入光引发剂与步骤S1所制得的所述钴基金属-有机框架，混合均匀后置于紫外光下进行光固化反应；待反应完成后，即得所述钴离子可调节缓释材料。
优选地，所述咪唑类配体选自咪唑、2-甲基咪唑、2-乙基咪唑、2-硝基咪唑或2-异丙基咪唑中的至少一种。
更优选地，所述钴基金属-有机框架的结构如式Ⅰ所示：
其中，0≤n≤2；R1以及R2分别独立地选自-H、-CH3、-CH2CH3、-NO2或-CH(CH3)2。
优选地，混合所述六水合硝酸钴的溶液与所述咪唑类配体的溶液时，所述六水合硝酸钴与所述咪唑类配体的摩尔比为(1-2):(3-8)。
优选地，步骤S1中，反应的时间为5-7小时。
优选地，步骤S2中，所述明胶溶解于PBS溶液时的质量/体积比为5％-15％；所述甲基丙烯酸的滴加速度为0.4mL/min-0.6mL/min；反应的温度为40℃-60℃，反应的时间为0.5-2小时；透析时所使用透析袋的截留率为12kDa-14kDa。
优选地，步骤S3中，所述光引发剂为光引发剂Irgacure2959；所述紫外光的波长为365nm-460nm。
本发明的第二方面是提供一种由上述制备方法制得的钴离子缓释材料。
本发明的第三方面是提供一种由上述钴离子缓释材料在制备骨愈合或/和骨缺损替代材料中的应用。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明将钴离子与咪唑类配体通过Co-N化学键连接，合成钴基金属-有机框架，将钴基金属-有机框架搭载到甲基丙烯酸酐化明胶上构建一种钴离子缓释材料；通过改变钴基金属-有机框架内咪唑类配体的掺杂比例，进一步调控钴离子释放模式，从而实现从7天到21天的不同释放模式；所构建的钴离子缓释材料在释放模式上更适应骨再生中的早期血管新生；本发明的钴离子缓释材料具有优异的组织和细胞相容性，不会引起毒副作用，成本低廉且制备简单，具有进一步结合其他材料应用的广阔前景。
附图说明
图1为本发明中钴离子缓释材料释放钴离子的动力学曲线；
图2为本发明中钴离子缓释材料释放的细胞生物相容性检测；
图3A为本发明中钴离子缓释材料处理HUVECs成管效果图；
图3B为本发明中钴离子缓释材料处理rBMSCs分化14天后茜素红染色效果图；
图4为本发明中钴离子缓释材料植入大鼠颅骨缺损模型后8周组织学HE染色。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1
分别称取0.45g六水合硝酸钴以及5.5g(24.65mmol)2-甲基咪唑，将所述六水合硝酸钴溶解于3mL甲醇中；将所述2-甲基咪唑溶解于20mL甲醇中；将六水合硝酸钴的甲醇溶液与2-甲基咪唑的甲醇溶液混合，并于室温下搅拌反应6小时；待反应完成后，通过甲醇以及水依次清洗离心所得到的紫色晶体沉淀三次，真空烘干后即得n＝0，R2为-CH3的钴基金属-有机框架。
称取明胶，并将所述明胶以10％质量/体积比溶解于PBS溶液中；通过微流控微泵，将甲基丙烯酸(MA)以0.5mL/min的速度加入到所述明胶的溶液中，并以50℃的温度搅拌反应1小时；待反应完成后，加入5×PBS溶液中止反应；使用截留率为12kDa的透析袋，通过透析去除其中的盐离子以及未反应的MA，并真空冻干后即得甲基丙烯酸酐化明胶固体。
将所述甲基丙烯酸酐化明胶固体以10％质量/体积比溶解于去离子水中，在避光的情况下加入0.05％质量/体积比水溶性的2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮(光引发剂2959)与所述钴基金属-有机框架，混合均匀制得浓度为500μmol/L的混合溶液后置于波长为365nm的紫外光下进行光固化反应；待反应完成后，即得所述钴离子缓释材料。
实施例2
分别称取0.45g六水合硝酸钴以及5.5g(24.65mmol)2-甲基咪唑以及2-乙基咪唑，将所述六水合硝酸钴溶解于3mL甲醇中；将所述2-甲基咪唑以及所述2-乙基咪唑溶解于20mL甲醇中；将六水合硝酸钴的甲醇溶液与2-甲基咪唑以及2-乙基咪唑的甲醇溶液混合，并于室温下搅拌反应6小时；待反应完成后，通过甲醇以及水依次清洗离心所得到的紫色晶体沉淀三次，真空烘干后即得n＝1.5，R1为-CH3，R2为-CH2CH3的钴基金属-有机框架。
甲基丙烯酸酐化明胶固体以及混合制得钴离子缓释材料的步骤与实施例1类似。
实施例3
钴离子释放测试
准确称取5.58mg(2.5mmol)实施例1中制备的n＝0，R2为-CH3的钴基金属-有机框架、6.10mg实施例2中制备的n＝1.5，R1为-CH3，R2为-CH2CH3的钴基金属-有机框架以及4.94mg(2.5mmol)六水合氯化钴，将上述材料分别与0.5mL甲基丙烯酸酐化明胶溶液混合均匀，光固化获得水凝胶；将获得的水凝胶转移至截留值为4kDa的即用型透析管中，加入胎牛血清使得水凝胶浸泡在牛血清中；将透析管浸泡在含50mL去离子水的离心管中，在37℃的温度下以100rpm的转速进行释放试验；在需要检测的时间点取5mL透析液并添加等量的去离子水；通过电感耦合等离子体原子发射光谱法测定钴离子含量。
结果如图1所示，相比于直接掺杂氯化钴的甲基丙烯酸酐化明胶，含钴基金属-有机框架的甲基丙烯酸酐化明胶可以有效控制钴离子释放，使钴离子逐渐、缓慢释放，避免了钴离子的爆发性突释。此外，结果还表明不同配体掺杂比例的钴基金属-有机框架的甲基丙烯酸酐化明胶具有快慢不同的钴离子释放模式，使得钴离子释放周期从10天(n＝0)到21天(n＝1.5)可控。由此可见本发明所公开的钴基金属-有机框架的甲基丙烯酸酐化明胶不仅可以长期、缓慢释放钴离子，并且其释放模式可以通过改变其内配体掺杂的比例而调控，这种释放周期更为契合骨再生早期的血管新生周期。
实施例4
钴离子缓释材的体外生物相容性测试
将实施例2中制备的n＝1.5的含钴金属有机框架以100μmol/L和200μmol/L的浓度分别分散于含0.05％光引发剂2959的10％甲基丙烯酸酐化明胶溶液中，混合均匀后，将配置好的溶液注射至Transwell 24孔板上室中，用紫外光照射固化形成水凝胶。配置浓度为100μmol/L以及200μmol/L的含氯化钴的甲基丙烯酸酐化明胶、空白的甲基丙烯酸酐化明胶以及生理盐水组作为对照；将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以及大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)按1×104个/每孔的密度种于Transwell 24孔板下室中，并进行共培养；24小时后，使用细胞计数试剂盒(CCK-8)计算每组的细胞活性。
结果如图2所示，钴离子缓释材料具有良好的生物相容性。经过24小时的共培养后，100μmol/L和200μmol/L的含钴基金属-有机框架的甲基丙烯酸酐化明胶都表现出超过80％的细胞活性；相比之下，培养在含氯化钴的甲基丙烯酸酐化明胶中的细胞活性显著低于钴离子缓释材料组，细胞活性严重受损；表明钴离子缓释材料通过缓慢地释放钴离子，将钴离子浓度控制在不对生物体产生毒性的范围，避免了由于钴离子突释造成的毒性。
实施例5
钴离子缓释材料体外成血管、成骨活性评估
将实施例2中制备的n＝1.5的含钴金属有机框架以200μmol/L的浓度分散于含0.05％光引发剂2959的10％甲基丙烯酸酐化明胶溶液中，制备出钴离子缓释材料前体溶液；混合均匀后，将配置好的溶液注射至Transwell 24孔板上室中，用紫外光照射固化形成水凝胶。配置空白的甲基丙烯酸酐化明胶以及生理盐水组作为对照，将HUVECs或rBMSCs根据检测需要接种至Transwell 24孔板下室中。
体外成血管活动使用成管实验检测：Transwell 24孔板上室中配置好水凝胶后，将HUVECs以1×104个/每孔的密度种于Transwell 24孔板下室中，并进行共培养。共培养24小时后，收集下室细胞。在包裹Matrigel(基质胶)的24孔板中，将共培养后的细胞以8×104个/每孔的密度接种；将空白甲基丙烯酸酐化明胶共培养24小时细胞作为对照组。合适时间后，光景下观察并抓取内皮细胞成管情况。
结果如图3A所示，钴离子缓释材料共培养的HUVECs所形成的管状结构更为成熟、完整，其分枝及交点较对照组明显增多；结果显示本发明公开的钴离子缓释材料在体外具有良好的促成血管能力。
体外成骨活动使用茜素红S染色标记钙结节检测：将rBMSCs以1×104个/每孔的密度种于Transwell 24孔板下室中进行培养；待rBMSCs达到80％细胞密度时，Transwell 24孔板下室中培养基更换为成骨诱导培养基(OIM)并在上室中加入配置好的水凝胶进行共培养；14天后使用茜素红S染色并观察钙结节生成情况。
结果如图3B所示，钴离子缓释材料共培养的rBMSCs，茜素红染色更明显，生成的钙结节较对照组明显增多；结果显示本发明公开的钴离子缓释材料在体外具有良好的促成骨能力。
实施例6
钴离子缓释材料促进SD大鼠颅骨缺损修复的效果评估
取15只重量为350±50g的雄性SD大鼠，麻醉后于颅骨中线作一矢状切口，钝性分离后于颅骨中线两侧分别钻取直径5mm的圆形缺损，以构建大鼠的颅骨缺损模型。将上述大鼠随机等分成三组，第1组注射100μL实施例5中制备的钴离子缓释材料；第2组注射100μL空白甲基丙烯酸酐化明胶；第3组注射100μL生理盐水。8周后，将动物进行安乐死，提取每只大鼠的颅骨样本，并在4％的甲醛溶液中进行组织固定、EDTA脱钙以及乙醇脱水，最后进行冰冻切片。对每组样本的颅骨组织进行组织学评价，以评估不同干预组颅骨再生情况。
结果如图4所示，植入钴离子缓释材料的第1组骨组织再生情况最好，颅骨组织切片照片显示该组颅骨缺损处新生骨数量明显多于其他两组，甚至于整个颅骨区域都有新生骨组织存在。同样地，免疫荧光结果提示植入钴离子缓释材料的第1组颅骨缺损处新生血管数量最多。以上结果表明，本发明公开的钴离子缓释材料具有显著的促进成骨及血管新生的作用，证实了钴离子缓释材料的高效性。
综上所述，本发明将钴离子与咪唑类配体通过Co-N化学键连接，合成钴基金属-有机框架，将钴基金属-有机框架搭载到甲基丙烯酸酐化明胶上构建一种钴离子缓释材料；通过改变钴基金属-有机框架内咪唑类配体的掺杂比例，进一步调控钴离子释放模式，从而实现从7天到21天的不同释放模式；所构建的钴离子缓释材料在释放模式上更适应骨再生中的早期血管新生；本发明的钴离子缓释材料具有优异的组织和细胞相容性，不会引起毒副作用，成本低廉且制备简单，具有进一步结合其他材料应用的广阔前景。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种钴离子缓释材料的制备方法，其特征在于，步骤包括：
S1、分别称取六水合硝酸钴以及咪唑类配体；将所述六水合硝酸钴溶解于第一有机溶剂中，将所述咪唑类配体溶解于第二有机溶剂中；将所述六水合硝酸钴的溶液与所述咪唑类配体的溶液混合，并于室温下搅拌反应一段时间；待反应完成后，通过第三有机溶剂以及水依次清洗离心所得到的紫色晶体沉淀若干次，真空烘干后即得钴基金属-有机框架；
S2、称取明胶，并将所述明胶溶解于PBS溶液中；通过微流控微泵，将甲基丙烯酸加入到所述明胶的溶液中，并搅拌反应一段时间；待反应完成后，加入5×PBS溶液中止反应；通过透析去除其中的盐离子以及未反应的甲基丙烯酸，并真空冻干后即得甲基丙烯酸酐化明胶固体；
S3、将步骤S2所制得的所述甲基丙烯酸酐化明胶固体溶解，在避光的情况下依次加入光引发剂与步骤S1所制得的所述钴基金属-有机框架，混合均匀后置于紫外光下进行光固化反应；待反应完成后，即得所述钴离子可调节缓释材料；
其中，所述钴基金属-有机框架的结构如式Ⅰ所示：
；
式Ⅰ
其中，0≤n≤2；R1以及R2分别独立地选自-H、-CH3、-CH2CH3、-NO2或-CH(CH3)2；
步骤S1中，混合所述六水合硝酸钴的溶液与所述咪唑类配体的溶液时，所述六水合硝酸钴与所述咪唑类配体的摩尔比为（1-2）:（3-8）。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，反应的时间为5-7小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述明胶溶解于PBS溶液时的质量/体积比为5%-15%；所述甲基丙烯酸的滴加速度为0.4mL/min-0.6mL/min；反应的温度为40℃-60℃，反应的时间为0.5-2小时；透析时所使用透析袋的截留率为12kDa-14kDa。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述光引发剂为光引发剂Irgacure2959；所述紫外光的波长为365nm-460nm。
5.一种如权利要求1-4任一项所述制备方法制得的钴离子缓释材料。
6.一种如权利要求5所述钴离子缓释材料在制备骨愈合或/和骨缺损替代材料中的应用。
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