CN115245557A - 短胜肽及其组合物用于治疗或/及预防骨骼肌萎缩症或与其相关疾病的用途 - Google Patents
短胜肽及其组合物用于治疗或/及预防骨骼肌萎缩症或与其相关疾病的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明实施例中揭露一种短胜肽或含有其混合物能够用于预防及/或骨骼肌萎缩相关疾病组合物的用途，其中，该短胜肽氨基酸编码为SEQ ID No.1所示序列或其进行一个或多个氨基酸取代、删除、添加所衍生同源性氨基酸序列。
Description
技术领域
本发明有关于一种短胜肽的用途，特别指一种短胜肽及其组合物用于治疗或/及预防骨骼肌萎缩症或与其相关疾病的用途。
背景技术
骨骼肌对老年人而言，扮演着重要角色，协助年长者维持住较佳身体活动功能，一般来说，年轻成人其精瘦肌肉组织(lean muscle mass)约占总体重的50％，年纪到了40岁以后，肌肉组织量会逐渐下降，约以每10年8％的速度下降到70岁左右，之后则会以每10年15％的速度继续下降。肌少症(Sarcopenia)，又被称为肌肉减少症或骨骼肌萎缩症，好发于老年人，该疾病主要特征为骨骼肌质量和功能呈现渐行性和普遍性的丧失，因而肌少症与跌倒、骨折、行动不便、残疾、感染、生理代谢紊乱等发生有关，因此，肌少症的发生会使老年人生活质量低下及提高死亡率。
目前肌少症被认为是一种新的老年症候群(geriatric syndromes)，随着人类寿命延长及具有代谢症候群人口数增加，研究估算认为，在2050年时，全球约有2亿人将受到肌少症影响，并且，根据研究显示，每年度用于肌少症直接医疗保健费用超过185亿美元，占医疗保健总支出的1.5％左右，因此，治疗或/及预防肌少症及其相关疾病已经成为现今年照护与健康促进的重大研究目标。若能降低肌少症罹病率或是延缓肌少症发生年纪，将大幅节省医疗费用及国家公共卫生负担。
发明内容
本发明主要目的在于提供一种短胜肽的第二用途，其能够用于保护肌肉细胞，并且促进肌肉合成蛋白质、提高线粒体合成能量效率，借以达到预防或/及治疗与骨骼肌萎缩相关疾病及其并发症的功效。
本发明另一目的在于提供一种短胜肽的第二用途，其能够保护肌肉细胞免受高糖环境或其所诱导氧化压力破坏，而能维持肌肉细胞活性并且持续生长，以达到预防或/及治疗与骨骼肌萎缩相关疾病及其并发症的功效。
因此，为能达成上述目的，本发明实施例中揭露一种短胜肽或含有其混合物用于治疗及/或预防骨骼肌萎缩症或与其相关疾病的用途，其中，该短胜肽氨基酸编码为SEQ IDNo.1所示序列或其进行一个或多个氨基酸取代、删除、添加所衍生同源性氨基酸序列。
其中，该与骨骼肌萎缩相关疾病为肌肉萎缩症或肌少症。
其中，该组合物能调控MAFbx及MuRF1表现。
本发明另一实施例揭露该短胜肽或含有其混合物用于制备肌肉蛋白合成因子促进剂的用途。
其中，该肌肉蛋白合成因子促进剂能提升P-ERK/ERK、P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR及P-FOXO3a/FOXO3a表现量。
在本发明又一实施例中揭露短胜肽或含有其混合物用于制备肌管分化促进剂的用途。
其中，该肌管分化促进剂能抑制GSK3β表现。
在本发明实施例中，该短胜肽氨基酸编码为SEQ ID No.1所示序列。
在本发明实施例中，含有该短胜肽混合物为一马铃薯水解产物。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种短胜肽或含有其混合物用于制备预防及/或骨骼肌萎缩相关疾病组合物的用途，该短胜肽能有效地达到改善或治疗肌少症、肌肉萎缩症或其引发的相关病症的功效。本发明还提供该短胜肽用于制备肌肉蛋白合成因子促进剂的用途，该短胜肽能够用于保护肌肉细胞，并且促进肌肉合成蛋白质、提高线粒体合成能量效率；其能够保护肌肉细胞免受高糖环境或其所诱导氧化压力破坏，而能维持肌肉细胞活性并且持续生长。借以达到预防或/及治疗与骨骼肌萎缩相关疾病及其并发症的功效。
附图说明
图1为确认本发明所揭DI-10胜肽氨基酸序列结果。
图2为以HPLC确认DI-10胜肽纯度的结果，其中，分析条件如下：梯度为21-46％B缓冲液，25分钟；缓冲液A为0.1％TFA(Trifluoroacetic acid)及100％水；缓冲液B为0.1％TFA及100％乙腈。
图3为以Mass仪确认DI-10胜肽纯度的结果。
图4为不同水解时间对于6％水解酵素(Alcalase)对于马铃薯水解蛋白水解率。
图5为不同水解时间对于6％水解酵素(Alcalase)对于马铃薯水解蛋白产率。
图6A为添加不同浓度DI-10胜肽进行培养后所得细胞存活率。
图6B为添加不同浓度PP622水解产物进行培养后所得细胞存活率。
图7A为经不同浓度DI-10胜肽处理C2C12细胞中与肌肉合成相关蛋白的表现。
图7B为定量图7A中P-ERK/ERK蛋白表现的结果。
图7C为定量图7A中P-Akt/Akt蛋白表现的结果。
图7D为定量图7A中P-mTOR/mTOR蛋白表现的结果。
图7E为定量图7A中P-FOXO3a/FOXO3a蛋白表现的结果。
图8A为经不同浓度PP622水解产物处理C2C12细胞中与肌肉合成相关蛋白的表现。
图8B为定量图8A中P-ERK/ERK蛋白表现的结果。
图8C为定量图8A中P-Akt/Akt蛋白表现的结果。
图8D为定量图8A中P-mTOR/mTOR蛋白表现的结果。
图8E为定量图8A中P-FOXO3a/FOXO3a蛋白表现的结果。
图9A以显微镜观察经不同浓度DI-10胜肽处理C2C12细胞中微管形成的结果。
图9B以显微镜观察经不同浓度PP622水解产物处理C2C12细胞中微管形成的结果。
图10为检测以不同浓度葡萄糖培养C2C12细胞后细胞存活率的结果。
图11为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度DI-10胜肽处理C2C12细胞后，检测细胞存活率的结果。
图12为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度PP622水解产物处理C2C12细胞后，检测细胞存活率的结果。
图13A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度DI-10胜肽处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中MyHC蛋白表现的结果。
图13B为图13A定量的结果。
图13C为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度PP622水解产物处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中MyHC蛋白表现的结果。
图13D为图13C定量的结果。
图14A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度DI-10胜肽处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中pAkt/Akt蛋白表现的结果。
图14B为图14A定量的结果。
图15A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度DI-10胜肽处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中pmTOR/mTOR蛋白表现的结果。
图15B为图15A定量的结果。
图16A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度DI-10胜肽处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中pAMPK/AMPK蛋白表现的结果。
图16B为图16A定量的结果。
图17A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度DI-10胜肽处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中pFC1α蛋白表现的结果。
图17B为图17A定量结果。
图18A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度PP622水解蛋白处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中pAkt/Akt蛋白表现的结果。
图18B为图18A定量的结果。
图19A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度PP622水解蛋白处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中pmTOR/mTOR蛋白表现的结果。
图19B为图19A定量的结果。
图20A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度PP622水解蛋白处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中pAMPK/AMPK蛋白表现的结果。
图20B为图20A定量的结果。
图21A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度PP622水解蛋白处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中pFC1α蛋白表现的结果。
图21B为图21A定量的结果。
图22A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度DI-10胜肽处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中Nrf1、TFam、CoxIV蛋白表现的结果。
图22B为图22A定量的结果。
图23A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度PP622水解蛋白处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中Nrf1、TFam、CoxIV蛋白表现的结果。
图23B为图22A定量的结果。
图24A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度DI-10胜肽处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中pGSK3β/GSK3β蛋白表现的结果。
图24B为图24A定量的结果。
图25A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度PP622水解蛋白处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中pGSK3β/GSK3β蛋白表现的结果。
图25B为图25A定量的结果。
图26A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度DI-10胜肽处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中MAFbx、Murf1蛋白表现的结果。
图26B为图26A定量的结果。
图27A为在高糖环境(30mM葡萄糖)下，以不同浓度PP622水解蛋白处理C2C12细胞后，检测各C2C12细胞中MAFbx、Murf1蛋白表现的结果。
图27B为图27A定量的结果。
图28以显微镜观察经不同处理C2C12细胞在高糖培养环境下蛋白质合成的结果。
具体实施方式
本发明所揭DI-10胜肽，其氨基酸序列为SEQ ID No.1，化学式为C55H91N13O15，结构如下式(I)所示。
本发明所揭DI-10胜肽具有增强肌肉细胞增生、分化及蛋白质合成的能力，以及增进线粒体生物合成降低细胞内氧化压力及抑制肝醣合成激酶(Glycogen synthase kinase3β,GSK3β)基因蛋白表现，进而促进了肌原性分化及改善肌管及肌球蛋白重链(MyHC)蛋白的合成。而能够用以作为组合物有效成分，达到预防或/及治疗肌肉萎缩相关疾病的功效。
更进一步来说，本发明所揭DI-10胜肽依据本领域通常知识及当时技术而得通过人工合成方式、重组生物体产制平台或是由植物中分离得到。而先前研究中亦有揭露该DI-10胜肽可由马铃薯或茄科植物以酵素进行水解后分离而得，意即马铃薯或茄科植物水解产物中含有本发明所揭DI-10胜肽，如将马铃薯以水解酵素(Alcalase)进行水解反应，可以得到含有DI-10胜肽的水解产物，并且该水解产物具有促脂肪分解的功效。
本发明所谓“人工合成方式”，是指通过如化学合成法或胜肽合成仪等人工方式将氨基酸依序连接而成为一多胜肽的方法。化学合成法包含有固相胜肽合成法及液相胜肽合成法；固相合成法是在溶剂中，在固体聚合物颗粒(或聚合支撑物)上进行胜肽的键结反应。
本发明所谓“重组生物体产制平台”，是指通过生物重组技术，将一用以表现特定蛋白质的核酸构筑在一表现载体上而得到一重组载体，该重组表现载体在一宿主细胞中表现该核酸，进而通过分离纯化等步骤可得到该特定蛋白质，其中，该宿主细胞得为枯草杆菌、酵母菌、乳酸菌等。
本发明所谓“组合物”，是指包含一有效量的欲产生特定效果的所需化合物或活性成份，以及至少一药学上或一食品上能接受的载体。如同本发明所属技术领域技术人员所了解，组合物的形态随着欲引起特定效果的投予方式有所不同，如锭剂、粉剂、针剂等，并且，该载体亦随着组合物的形态而可为固态、半固态或液态。举例来说，载体包含，但不限于，明胶、乳化剂、烃类混合物、水、甘油、生理食盐水、缓冲生理盐水、羊毛脂、石蜡、蜂蜡、二甲基硅油、乙醇。
以下，为能详细说明本发明的技术特征及其功效，将兹举若干实施例并搭配附图做更进一步说明如后。
以下实施例中所使用的细胞株皆为可购买所得，并且仅为验证本发明所揭DI-10胜肽的功效，并非为限制本发明说明书及申请专利范围的解释。
以下实施例中，若未特别说明，所使用培养细胞的基础培养基为DMEM培养基。
实施例一：制备短胜肽
以化学合成方式制备氨基酸序列为SEQ ID No.1的DI-10胜肽，如图1所示，并且，以HPLC及Mass仪确认DI-10胜肽的纯度，结果如图2及图3所示，显示通过化学合成方法制得的胜肽具有高纯度(约98％)。
实施例二：制备马铃薯水解产物
将马铃薯以6％水解酵素(Alcalase)同水解时间下马铃薯水解蛋白的产率及水解率，结果如图4及图5所示，显示马铃薯以6％水解酵素(Alcalase)进行水解反应22小时，水解率及产率最高。
据此结果，本发明以下实施例中是以6％水解酵素(Alcalase)及水解时间为22小时的条件产制所得的马铃薯水解产物(下称PP622水解产物)进行以下实施例。
实施例三：细胞存活率试验
取C2C12细胞，在培养第0天至培养第2天时，先已添加0.25μM DEX(dexamethasone)、0.5μM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthanine)及1 1μg/ml胰岛素的DMEM培养基进行分化培养，在培养第2天至培养第8天时，将培养基更换为添加胰岛素的DMEM培养基进行培养，并在培养第8天开始分别添加不同浓度的DI-10胜肽(氨基酸序列为SEQ ID No.1)及PP622水解产物培养3天，培养完成后，分别检测在不同培养条件下的C2C12细胞存活率，结果如图6A及图6B所示。
由图6A及图6B结果可知，本发明所揭DI-10胜肽及PP622水解产物对于细胞皆无毒性，不会影响到细胞生长。
实施例四：检测促肌肉合成蛋白表现
如实施例三所示流程，在细胞培养第8天时，分别以不同浓度的DI-10胜肽或PP622水解产物处理C2C12细胞，培养完成后，以西方墨点法检测分析经不同浓度DI-10胜肽及PP622水解产物进行培养C2C12细胞中与肌肉合成相关蛋白的表现，包含有ERK、Akt、mTOR及FOXO3a，并且将之定量，借此分析不同浓度DI-10胜肽及PP622水解产物分别对于细胞中与肌肉生成相关Akt/mTOR讯息路径的影响，结果如图7及图8所示。
由图7A至图7E及图8A至图8E结果可知，DI-10胜肽及PP622水解产物分别能够诱导Akt及mTOR蛋白磷酸化，并且会提高磷酸化肌原性转录因子Foxo3a的表现量，由此显示，本发明所揭DI-10胜肽及PP622水解产物会活化Akt/mTOR讯息路径，并且随着添加剂量的增加，意即本发明所揭DI-10胜肽及PP622水解产物分别具有促进肌肉合成的功能，而能够达到改善或治疗肌少症、肌肉萎缩症或其引发的相关病症的功效。
实施例五：检测细胞内微管形成
如实施例三所示流程，在培养第8天开始，分别以添加不同浓度的DI-10胜肽或PP622水解产物的DMEM培养基培养C2C12细胞48小时，而后在显微镜下观察经不同浓度的DI-10胜肽或PP622水解产物进行培养C2C12细胞是否有微管形成(Microtubuleformation)，结果如图9A及图9B所示。
由图9A及图9B结果可知，以浓度为10μg/ml以上DI-10胜肽或PP622水解产物处理C2C12细胞一预定时间后，能够使细胞内有微管形成。由此结果显示，本发明所揭DI-10胜肽或PP622水解产物能促进C2C12细胞的微管形成，意即本发明所揭DI-10胜肽或PP622水解产物具有促进肌纤维细胞结构完整，进而促进肌肉细胞生成，以达到改善或治疗肌少症、肌肉萎缩症或其引发的相关病症的功效。
实施例六：高糖处理下细胞存活率试验
取C2C12细胞，培养在添加不同浓度(0、5、15、30mM)葡萄糖的培养基中，观察其细胞存活率，结果如图10所示。由图10结果显示，以浓度30mM葡萄糖处理细胞，细胞会遭遇高糖份所引发的高氧化压力而导致细胞存活率大幅下降
取C2C12细胞，以添加浓度为30mM葡萄糖培养基作为高糖诱导环境进行培养，并分别以不同浓度的DI-10胜肽或PP622水解产物处理，而后分别检测各C2C12细胞存活率，结果如图11及图12所示。
由图11及图12结果可知，本发明所揭DI-10胜肽及PP622水解产物不论在何种浓度下皆能抵抗高糖所造成的氧化压力，使细胞继续生长，并且，细胞存活率会随着所浓度增加而升高。
换言之，由图11及图12结果显示，本发明所揭DI-10胜肽或PP622水解产物确实具有促进肌肉纤维细胞生长的功效，并且即便在高糖诱导的高氧化压力下，仍能保护肌肉细胞，不受到高氧化压力破坏而损伤，是以，本发明所揭DI-10胜肽或PP622水解产物具有改善或治疗肌少症、肌肉萎缩症或其引发的相关病症的功效。
实施例七：检测高糖环境下肌肉细胞分化的能力
取C2C12细胞，以添加浓度为30mM葡萄糖的培养基作为高糖诱导环境进行培养，再分别以不同浓度的DI-10胜肽或PP622水解产物处理，并进行分化培养。培养完成后，分别以西方墨点法分析各C2C12细胞中MyHC(myosin heavy chain)蛋白的表现，并进行定量，结果如图13A、13B、13C及13D所示。
由图13A至13D结果可知，本发明所揭DI-10胜肽或PP622水解产物在高浓度(10μg/ml以上)时，能够促进肌管分化，意即当肌肉细胞处在高糖环境或遭遇高氧化压力时，投予有效量的本发明所揭DI-10胜肽或PP622水解产物，不仅能够保护肌肉细胞不受到氧化压力破坏而死亡，并且还能够促进肌肉蛋白合成，加速肌肉细胞生长。由此可知，本发明所揭DI-10胜肽或PP622水解产物能够有效地达到改善或治疗肌少症、肌肉萎缩症或其引发的相关病症的功效。
实施例八：检测高糖环境下肌肉细胞内与肌肉合成及线粒体生合成相关蛋白的表现
本实施例流程大体上等同于实施例七，不同在于，培养完成后，是以西方墨点法分析各C2C12细胞或肌管中与蛋白质合成相关蛋白及线粒体生合成相关蛋白表现：pAkt/Akt、pmTOR/mTOR、pAMPK/AMPK、pFC1α、pGSK3β/GSK3β、MAFbx、Murf1、Nrf1、TFam、CoxIV，并进行定量，结果如图14A至图27B所示。又，以显微镜观察在高糖环境下，经不同处理的各C2C12细胞的蛋白质合成活性，结果如图28所示。
由图14A至图28结果可知，在高糖环境或在高糖诱导氧化压力下，以本发明所揭DI-10胜肽或PP622水解产物处理肌肉细胞后，肌肉细胞内pAkt、pmTOR、pAMPK、Nrf1、TFam、CoxIV、pFC1α表现增加，且MAFbx、Murf1、pGSK3β/GSK3β等下游调控因子表现下降，显示本发明所揭DI-10胜肽或PP622水解产物不仅能够保护肌肉细胞免受高糖或其造成的氧化压力伤害，更能同时促进肌肉细胞合成蛋白质、提高线粒体合成能量的效率。
由上述结果可知，在高糖环境或是其所诱导的高氧化压力下，本发明所揭DI-10胜肽或PP622水解产物能够有效提升肌肉细胞活性，以达到有效地达到改善或治疗肌少症、肌肉萎缩症或其引发的相关病症的功效。
SEQUENCE LISTING
<110> 东海大学
<120> 短胜肽及其组合物用于治疗或/及预防骨骼肌萎缩症或与其相关疾病的用途
<150> TW110115191
<151> 2021-04-27
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Asp Ile Lys Thr Asn Lys Pro Val Ile Phe
1 5 10
Claims (10)
1.一种短胜肽或含有该短胜肽混合物用于制备预防及/或骨骼肌萎缩相关疾病的组合物中的用途，其特征在于，该短胜肽氨基酸编码为SEQ ID No.1所示序列。
2.如权利要求1所述用途，其特征在于，该与骨骼肌萎缩相关疾病为肌肉萎缩症或肌少症。
3.如权利要求1所述用途，其特征在于，该组合物能调控MAFbx及MuRF1表现。
4.如权利要求1所述用途，其特征在于，含有该短胜肽混合物为一马铃薯水解产物。
5.一种短胜肽或含该短胜肽混合物用于制备肌肉蛋白合成因子促进剂的用途，其特征在于，该短胜肽氨基酸编码为SEQ ID No.1所示序列。
6.如权利要求5所述用途，其特征在于，该肌肉蛋白合成因子促进剂能提升P-ERK/ERK、P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR及P-FOXO3a/FOXO3a的表现量。
7.如权利要求5所述用途，其特征在于，含有该短胜肽混合物为一马铃薯水解产物。
8.一种短胜肽或含有该短胜肽混合物用于制备肌管分化促进剂的用途，其特征在于，该短胜肽氨基酸编码为SEQ ID No.1所示序列。
9.如权利要求8所述用途，其特征在于，该肌管分化促进剂能抑制GSK3β表现。
10.如权利要求8所述用途，其特征在于，含有该短胜肽混合物为一马铃薯水解产物。
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Legal Events
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