CN115236329A - Covid-19中和抗体检测试剂盒及其检测卡 - Google Patents

Covid-19中和抗体检测试剂盒及其检测卡 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种COVID‑19中和抗体检测试剂盒及其检测卡，其中COVID‑19中和抗体检测卡，包括卡壳，设置于卡壳内的试纸条，以及转动设置于卡壳侧面的采血针；试纸条包括底衬，设置于底衬上表面中部的包被膜，以及分别搭接设置于包被膜的上表面两端的样品垫和吸水纸；采血针在检测卡的使用过程中具有：使用前收纳状态、使用状态、使用后锁死状态三种状态。本发明的纳米微球为稀土氟化物纳米材料具有背景低，荧光信号强，发光寿命长，信噪比高等优势，标记通过共价键将微球与新冠S‑RBD抗原连接，标记产物稳定，具有准确度高、灵敏度高、检测快速简便等特点，可检测出最近或以前感染过新型冠状病毒，可判断是否具有预防病毒感染的能力以及对疫苗产的开发及评价。

Description

COVID-19中和抗体检测试剂盒及其检测卡
技术领域
本发明属于纳米材料应用体外诊断检测领域，尤其是一种COVID-19中和抗体检测试剂盒及其检测卡。
背景技术
新型冠状病毒是一种包膜非片段的正链单股RNA病毒，可引起急性呼吸道疾病。新型冠状病毒具有多个结构蛋白，包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、跨膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)，其中刺突蛋白(S)和核衣壳(N)蛋白是主要的免疫原。特别地，S蛋白是一种主要的保护性抗原，可诱导产生高效中和抗体(NAbs)，在病毒的附着、融合、进入和传播中发挥重要作用。S蛋白包含一个与病毒受体结合的N端S1亚基和一个与病毒-细胞膜融合的C端S2亚基。S1进一步分为N端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)，S1 内的RBD直接与宿主受体相互作用。人血管紧张素转换酶2(hACE2)是SARS-CoV-2 结合进入宿主细胞的受体。感染新型冠状病毒会引发免疫反应，包括在血液中产生抗体或结合抗体。并不是所有的结合抗体都能阻断新冠病毒的细胞浸润和复制。可阻断病毒细胞浸润和复制的结合抗体的亚群称为NAbs。S1亚基内的RBD是SARS-CoV单链抗体最关键的靶点。这些NAbs可以中断RBD与其受体ACE2的相互作用。因此，人血清中新型冠状病毒抗体水平与新型冠状病毒感染后恢复个体的保护性免疫反应相关，也反映了人群水平的群体免疫，为过去或正在感染COVID-19患者的临床管理提供了信息。然而，目前尚不清楚产生中和抗体需要多长时间，以及它们是否总是在新型冠状病毒感染后产生。
本发明旨在通过RBD蛋白与hACE2蛋白的直接相互作用来模拟病毒与宿主的相互作用。然后，与传统的病毒中和试验(VNT)相同的方法可以中和这种高度特异性的相互作用。另外，本发明在检测线处设置了两条检测线，一条包被血管紧张素转化酶2，可直接测得中和抗体的含量，另一条包被COVID-19RBD抗原2，可测得新型冠状病毒总抗体的含量，可以更明确的检测出体内产生新型冠状病毒抗体的具体情况。
稀土纳米微球具有荧光寿命长、发射峰半峰宽很窄和Stokes位移大等光学特性，在检测中能够有效降低背景荧光的干扰，能够实现高灵敏度的分析检测，同时还能够进行多标记，实现同时检测样品中的多种物质。利用纳米稀土颗粒的上转换发光特性，制成生物示踪颗粒，应用于体外诊断试剂，与传统的稳定态发光检测技术相比，由于信号/ 噪声比显著增大，其检测灵敏度大大提高。不仅如此，稀土纳米微球还具有高光化学稳定性、生物兼容性等特点，能够保证检测过程信号的稳定性，提高检测灵敏度，已经在体外诊断领域得到了广泛的应用。
因此，本项目拟基于稀土纳米微球优异的光学特性和生物兼容性，开发一种适用于 COVID-19中和抗体高灵敏度、高特异性便携式快速现场检测的新方法、试剂盒。可检测人群中是否存在中和抗体以及潜在的免疫力，对恢复的个体进行中和抗体检测，从而检测其潜在的免疫力，检测药物阻断RBD-ACE2相互作用的能力，测试接种疫苗产生中和抗体的效果及中和抗体的寿命监测。
因此开发一种具有灵敏度高、快速测定血液中COVID-19中和抗体、检测准确度高的上转换试剂盒具有重要意义。
发明内容
发明的目的是提供一种COVID-19中和抗体检测试剂盒及其检测卡，以解决背景技术中所涉及的问题。
实现本发明目的的技术方案是：一种COVID-19中和抗体检测卡，包括卡壳，设置于卡壳内的试纸条，以及转动设置于卡壳侧面的采血针；所述试纸条包括底衬，设置于底衬上表面中部的包被膜，以及分别搭接设置于包被膜的上表面两端的样品垫和吸水纸；所述样品垫喷涂有微球线，所述微球线为由稀土纳米微球标记的第一重组COVID-19 S-RBD抗原；所述包被膜上依次设置有第一检测线，第二检测线和质控线，所述第一检测线靠近所述样品垫；所述第一检测线包被有血管紧张素转化酶2，第二检测线包被有第二重组COVID-19S-RBD抗原，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；所述采血针在检测卡的使用过程中具有：使用前收纳状态、使用状态、使用后锁死状态三种状态。
其中，所述样品垫喷涂有微球线，所述微球线为由稀土纳米微球标记的第一重组COVID-19S-RBD抗原；所述包被膜上依次设置有第一检测线，第二检测线和质控线，所述第一检测线靠近所述样品垫；所述第一检测线包被有血管紧张素转化酶2，第二检测线包被有第二重组COVID-19S-RBD抗原，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。
优选地，所述稀土纳米微球为核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠，其组成为：NaErF4@NaYF4；其中，NaErF4为全铒掺杂核结构；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaErF4表面。
优选地，所述稀土纳米微球在基态下稳定，在808nm的激发光源作用下发射出波长范围在500-550nm，640-680nm和1500-1600nm的三发射荧光。
优选地，所述稀土纳米微球的制备活化方法，包括以下步骤：
步骤一：合成氟化铒钠核结构：在容器中，加入油酸、1-十八烯、铒的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，并进行反应；随后用环己烷乙醇混合液洗涤，分散于环己烷中，得到NaErF4纳米微球环己烷溶液；
步骤二：制备核壳结构稀土纳米微球：在容器中，加入油酸、1-十八烯、醋酸钇、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液、NaErF4纳米微球环己烷溶液，并进行反应，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；用酸洗法将微球转移至水相，再在微球表面修饰羧基，得到水溶性NaErF4@NaYF4稀土纳米微球；
步骤三：活化稀土纳米微球：对步骤二的稀土纳米微球进行超声波处理和离心处理，对沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤；加入碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀后高速离心，对沉淀物用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米微球。
优选地，所述样品垫上喷涂的稀土纳米微球标记的第一重组COVID-19S-RBD抗原的含量为50～200μg抗体/200μl荧光微球。
优选地，所述第一检测线和第二检测线中血管紧张素转化酶2和第二重组 COVID-19S-RBD抗原包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，所述质控线中羊抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
优选地，所述试纸条的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：根据所述稀土纳米微球的制备活化方法制备得到活化稀土纳米微球；
步骤二：制备稀土纳米微球标记的重组COVID-19S-RBD抗原：对步骤一的活化稀土纳米微球按照50～200μg/200μl加入第一重组COVID-19S-RBD抗原，用封闭液封闭后高速离心，用含保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备包被膜：分别用血管紧张素转化酶2，第二重组COVID-19S-RBD抗原和羊抗鼠IgG抗体作为第一检测线、第二检测线和质控线平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；
步骤四：制备样品垫：用样品垫处理液含0.1％Tween20、0.5％酪蛋白、3％蔗糖的10mM、pH8.2的PB浸泡样品垫37度烘干过夜，在样品垫上用稀土纳米微球标记的第一重组COVID-19S-RBD抗原喷涂一条线，烘干；
步骤五：在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述COVID-19中和抗体检测卡。
优选地，所述试纸条的制备方法的步骤三中，用微球稀释液将稀土纳米微球标记的第一重组COVID-19S-RBD抗原稀释8～30倍，用量为2～4μl液量/cm样品垫；所述微球稀释液为含1％BSA、0.5％酪蛋白、15％蔗糖的50mM Tris-HCl缓冲液。
优选地，所述卡壳的一个转角处的侧面设有L形凹槽，所述采血针包括主体和设于主体一端的针头；所述主体远离针头的一端的两侧设有转轴，转轴转动设置在L形凹槽的转折处；所述L形凹槽的一端口部设有弹片，所述弹片远离采血针的一端固定在L形凹槽内，弹片靠近采血针的一端被限定为只能向L形凹槽的内部弹性变形。
上述结构使得：采血针的针头所在的一端越过弹片转入L形凹槽后，将被弹片限制在L形凹槽内无法转出，从而避免使用过后的采血针被重复使用，或者对其他人或物造成伤害。
优选地，所述弹片与其所在的L形凹槽的一端的卡壳外壁间距设置；所述采血针的针头所在的一端边缘设有盖板；所述盖板的厚度等于弹片到卡壳外壁之间的距离，盖板的深度宽度等于L形凹槽的宽度；所述采血针的针头所在的一端越过弹片转入L形凹槽后，盖板盖住所述弹片。
上述结构使得：使用过后的采血针能够被彻底锁死在L形凹槽内，不会被轻易取出。
优选地，所述L形凹槽内部位于弹片的中部下方设有支撑弹片的支撑杆，L形凹槽内部位于弹片自由端的上方两侧内壁上设有挡块。支撑杆能够有利于弹片复位，挡块能够避免弹片向L形凹槽外部变形。
优选地，所述采血针的转轴为阻尼转轴；所述采血针的针头上包裹有酒精棉片；所述针头置于酒精棉片的中部，酒精棉片的两端对折后露出L形凹槽。
阻尼转轴使得采血针不会轻易从L形凹槽内转出，酒精棉片不但能够为采血针消毒，还能在使用时方便将采血针从L形凹槽内拉出来。
本发明还提供一种COVID-19中和抗体检测试剂盒，包括：
上述的COVID-19中和抗体检测卡，以及
含有定标曲线的ID卡，由COVID-19中和抗体检测卡测定不同抗体滴度的质控品，以质控品抗体滴度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。
优选地，所述COVID-19中和抗体检测试剂盒还包括样本稀释液，其组成成分为1％Tween-20、150mM氯化钠、pH8.0的Tris-HCl。
本发明还提供一种COVID-19中和抗体检测试剂盒定量检测COVID-19中和抗体的方法，包括以下步骤：
步骤一：以血清/血浆/全血样本作为检测样本；
步骤二：开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应的含有定标曲线的ID卡；
步骤三：将血液样本加入到COVID-19中和抗体检测卡加样孔中；
步骤四：将COVID-19中和抗体检测卡插入干式荧光免疫分析仪的检测槽；
步骤五：干式荧光免疫分析仪进行分析，10min读取/打印检测结果，其中T1线血管紧张素转化酶2<20提示有中和抗体，T2线第二重组COVID-19S-RBD抗原>20提示有总抗体存在。
本试剂采用荧光免疫层析原理，样本在毛细管作用下沿着测试卡向前移动。如果标本含有新型冠状病毒抗体或中和抗体，抗体将结合稀土纳米荧光标记的第一重组COVID-19S-RBD抗原形成抗原1-抗体复合物，层析至检测区。由于第一检测线血管紧张素转化酶2和中和抗体与稀土纳米荧光标记的第一重组COVID-19S-RBD抗原竞争结合，因此血液中有中和抗体时，第一检测线处不结合，免疫荧光检测仪扫描的信号值低，在第二检测线处是双抗原夹心法，因此与预包被的第二重组COVID-19S-RBD抗原结合，形成稀土纳米荧光微球标记抗原1-总抗体-抗原2的复合物，层析至检测区，结合的量越多，免疫荧光检测仪扫描的信号值越高，则样本阳性程度越强，此时检测结果为阳性；当样本不含COVID-19抗体或中和抗体或者抗体滴度低于最低检测限时，则在第一检测线处结合，免疫荧光检测仪扫描的信号值越高，在第二检测线处没有或有极少量复合物聚积，此时用免疫荧光检测仪扫描为无信号值或信号值低于最低检测限的信号值，此时检测结果为阴性。剩余未结合的荧光微球标记的第一重组COVID-19S-RBD抗原层析至质控区，与质控区包被的羊抗鼠结合，反应形成具有一定荧光信号值的反应线作为质控线。用光源(808nm)对检测区扫描检测，检测线和质控线上稀土纳米微球发出荧光(670nm)，在此荧光范围内生物体自发荧光较弱。延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光(1～10ns)全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光，这样就可以完全排除特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。
采用了上述技术方案后，本发明具有积极的效果：
(1)本发明同时采用竞争法检测新型冠状病毒中和抗体和双抗原夹心法检测总抗体，新冠疫苗诱导产生的抗体不全是中和抗体，只有中和抗体才有抗病毒的作用，另外除了检测出中和抗体外，还需要明确中和抗体的量，只有达到一定量才能起到保护作用，目前新冠疫苗接种分三针，可以通过检测中和抗体的量来确定接种的有效性。
(2)本发明的纳米微球为稀土氟化物纳米材料，具有背景低，发光寿命长，荧光信号强，信噪比高等优势，标记通过共价键将微球与抗原连接，标记产物稳定，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。稀土掺杂纳米材料具有稳定的物理化学性质，窄带发射，宽Stokes位移，长寿命等优点，从而排除激发光干扰，可通过时间分辨延迟检测消除本底荧光干扰，在生物标记过程中不容易受环境影响。稀土发光材料尤其是稀土氟化物具有较低的声子能量，且物理化学性能稳定，适合于稀土发光材料的基质材料，它能减少激活离子激发态的无辐射驰豫从而提高激活离子的发光效率。因此采用稀土氟化物纳米粒子作为标记物，发光寿命长，激发波长为 808nm，发射波长为540nm、670nm和1540nm，同时具有近红外及可见光三发射可避免激发光源的干扰，同时结合时间分辨荧光免疫技术，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度和准确性，具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。
(3)本发明利用稀土氟化物作为基质，通过不同稀土离子的掺杂，合成了高性能的氟化铒钠包覆氟化钇钠纳米微球，全铒掺杂的纳米材料通过表面包覆一层氟化钇钠壳层，提高能量转化的效率，具有高灵敏度的特点，方便了其检测，故而制备出了光化学性质稳定强、发光寿命长的稀土纳米微球。
(4)本发明利用NaErF4@NaYF4纳米稀土颗粒的上转换发光特性，制成生物示踪颗粒，应用于体外诊断试剂，与传统的稳定态发光检测技术相比，由于信号/噪声比显著增大，其检测灵敏度大大提高，在新型冠状病毒检测中，由于上转发光现象产生于晶体结构内部，完全避免发光淬灭；具有检测范围宽、灵敏度高、准确度高、检测快速简便等特点，可用于快速检测。
(5)本发明的采血针在检测卡的使用过程中具有使用前收纳状态、使用状态、使用后锁死状态三种状态，能够避免使用过后的采血针被重复使用，或者对其他人或物造成伤害。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为本发明的COVID-19中和抗体检测卡的试纸条结构示意图。
图2为NaErF4@NaYF4稀土纳米微球在808nm激发下的荧光光谱图。
图3为NaErF4@NaYF4稀土纳米微球透射电镜图，纳米微球粒径在20-30nm。
图4为本发明的COVID-19中和抗体检测卡的采血针处于使用前收纳状态时的示意图。
图5为图4的A处放大图。
图6为图4的俯视图。
图7为本发明的COVID-19中和抗体检测卡的采血针处于使用状态时的示意图。
图8为本发明的COVID-19中和抗体检测卡的采血针处于使用后锁死状态时的示意图。
附图标记为：
卡壳1、L形凹槽11、弹片12、支撑杆13、挡块14；
底衬21、包被膜22、第一检测线221、第二检测线222、质控线223、样品垫23、微球线231、吸水纸24；
采血针3、主体31、针头32、转轴33、盖板34、酒精棉片35。
具体实施方式
在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
(实施例1)
本实施例的COVID-19中和抗体检测试剂盒，包括COVID-19中和抗体检测卡、含有定标曲线的ID卡和样本稀释液。
含有定标曲线的ID卡由COVID-19中和抗体检测卡测定不同抗体滴度校准品，以抗体滴度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。通过干式荧光免疫分析仪可读取试剂卡上对应的二维码信息并测得相应抗体滴度。
样本稀释液的组成成分为1％Tween-20、150mM氯化钠、pH8.0的Tris-HCl。
COVID-19中和抗体检测卡包括卡壳1，设置于卡壳1内的试纸条2，以及转动设置于卡壳1侧面的采血针3。
试纸条2包括底衬21，设置于底衬21上表面中部的包被膜22，以及分别搭接设置于包被膜22的上表面两端的样品垫23和吸水纸24。卡壳1对应样品垫23和包被膜22 的部分分别预留加样孔和观察窗。样品垫23喷涂有微球线231，所述微球线231为由稀土纳米微球标记的第一重组COVID-19S-RBD抗原，第一重组COVID-19S-RBD抗原的含量为50～200μg抗原/200μl。包被膜22上依次设置有第一检测线221，第二检测线 222和质控线223，所述第一检测线221靠近所述样品垫23；所述第一检测线221包被有血管紧张素转化酶2，第二检测线222包被有第二重组COVID-19S-RBD抗原，质控线223包被有羊抗鼠IgG抗体。
稀土纳米微球为核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠，粒径为20nm～30nm，其组成为：NaErF4@NaYF4，其中，NaErF4为全铒掺杂核结构；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaErF4表面。稀土纳米微球在基态下稳定，在808nm的激发光源作用下发射出波长范围在500-550nm，640-680nm和1500-1600nm的三发射荧光。NaErF4@NaYF4稀土纳米微球在808nm激发下的荧光光谱图，如图2所示。NaErF4@NaYF4稀土纳米微球透射电镜图，如图3所示。
上述稀土纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：合成氟化铒钠核结构：在容器中，加入体积比为3～6：7～14的油酸和1-十八烯，再按摩尔比例，加入1份铒的硝酸盐或醋酸盐或氯化物；在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至100～120℃，反应20～30分钟，再升温至150～160℃，反应10～15 分钟，得到透明溶液；自然冷却至40～50℃，释放真空，加入摩尔浓度比为1～2：1.6～3.4 的NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，反应20～30min；升温至90～100℃，抽气换气3～4 次，通入氮气，升温至280～300℃，反应1～2小时，离心处理，随后用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中，得到NaErF4纳米微球环己烷溶液；
步骤二：制备核壳结构稀土纳米微球：在容器中，加入体积比为3～6：7～14油酸和1-十八烯，加入醋酸钇，混合搅拌，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，以及与油酸体积比为3～6：2～4的NaErF4纳米微球环己烷溶液，混合搅拌，反应20～30min；升温至90～100℃，抽气换气3～4 次，通入氮气，升温至280～290℃，反应1～2小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；所述醋酸钇、NaOH、氟化铵物质的量之比为0.2～0.4： 0.5～1：0.8～1.6；利用酸洗法将微球转移至水相，再在微球表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性NaErF4@NaYF4稀土纳米微球；
步骤三：活化稀土纳米微球：对步骤二的稀土纳米微球进行1～2min的超声波处理和离心处理12000～14000rpm高速，对沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，超声波处理2～3min；加入20～100mg/ml碳二亚胺，混匀5～10min，再加入 20～100mg/mlN-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀10～20min后12000～14000rpm高速离心 5～15min，对沉淀物用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米微球。
包被膜22上第一检测线221中血管紧张素转化酶2包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，第二检测线222中第二重组COVID-19S-RBD抗原的包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，质控线223中羊抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
见图4至图8，卡壳1的一个转角处的侧面设有L形凹槽11，所述采血针3包括主体31和设于主体31一端的针头32；所述主体31远离针头32的一端的两侧设有转轴 33，转轴33转动设置在L形凹槽11的转折处；所述L形凹槽11的一端口部设有弹片 12，所述弹片12远离采血针3的一端固定在L形凹槽11内，弹片12靠近采血针3的一端被限定为只能向L形凹槽11的内部弹性变形。这种结构使得采血针3的针头32所在的一端越过弹片12转入L形凹槽11后，将被弹片12限制在L形凹槽11内无法转出，从而避免使用过后的采血针3被重复使用，或者对其他人或物造成伤害。
采血针3在检测卡的使用过程中具有：使用前收纳状态、使用状态、使用后锁死状态三种状态。其中，采血针3的针头32位于L形凹槽11远离弹片12的一端内部时为使用前收纳状态，采血针3的针头32位于L形凹槽11外部使为使用状态，采血针3被弹片12限制在L形凹槽11内时为使用后锁死状态。
L形凹槽11内部位于弹片12的中部下方设有支撑弹片12的支撑杆13，L形凹槽 11内部位于弹片12自由端的上方两侧内壁上设有挡块14。支撑杆13能够有利于弹片 12复位，挡块14能够避免弹片12向L形凹槽11外部变形。
弹片12与其所在的L形凹槽11的一端的卡壳1外壁间距设置，采血针3的针头 32所在的一端边缘设有盖板34。盖板34的厚度等于弹片12到卡壳1外壁之间的距离，盖板34的深度宽度等于L形凹槽11的宽度。采血针3的针头32所在的一端越过弹片 12转入L形凹槽11后，盖板34盖住所述弹片12。通过盖板34盖住弹片12，使得使用过后的采血针3能够被彻底锁死在L形凹槽11内，不会被轻易取出。
采血针3的转轴33为阻尼转轴，阻尼转轴使得采血针3不会轻易从L形凹槽11内转出。采血针3的针头32上包裹有酒精棉片35；所述针头32置于酒精棉片35的中部，酒精棉片35的两端对折后露出L形凹槽11。酒精棉片35不但能够为采血针3消毒，还能在使用时方便将采血针3从L形凹槽11内拉出来，使采血针3由使用前收纳状态转换为使用状态。
上述试纸条2的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：根据前述的稀土纳米微球的制备方法制备得到活化稀土纳米微球；
步骤二：制备稀土纳米微球标记的重组COVID-19S-RBD抗原：对步骤一的活化稀土纳米微球超声波处理1～2min后按照50～200μg/200μl加入第一重组COVID-19S-RBD 抗原，混匀1～3小时，用含0.5％BSA的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl封闭液封闭0.5～1 小时后12000～14000rpm高速离心5～15min，用含1％NaCl、0.5％BSA、0.1％Tween-20 的10～50mM、pH7.5～8.5Tris-HCl保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备包被膜22：分别用血管紧张素转化酶2，第二重组COVID-19S-RBD 抗原和羊抗鼠IgG抗体作为第一检测线221，第二检测线222和质控线223平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；分别用包被缓冲液将血管紧张素转化酶2，第二重组 COVID-19S-RBD抗原和羊抗鼠IgG抗体调整浓度到0.5～2mg/ml，用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，分别作为第一检测线221，第二检测线222和质控线223平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，质控线223和检测线间隔3～7mm，置于烘箱中，45℃烘干过夜；
步骤四：制备样品垫23：用样品垫23处理液含0.1％Tween20、0.5％酪蛋白、3％蔗糖的10mM、pH8.2的PB浸泡样品垫2337度烘干过夜，在样品垫23上将稀土纳米微球标记的第一重组COVID-19S-RBD抗原用微球稀释液稀释8～30倍均匀喷涂一条线，用量为2～4μl液量/cm样品垫23，置于烘箱中，37℃烘干过夜；所述微球稀释液为含 1％BSA、0.5％酪蛋白、15％蔗糖的50mM Tris-HCl缓冲液。
步骤五：在底衬21上顺次相互搭接地粘贴样品垫23、包被膜22和吸水纸24得到试纸板，切割得到所述试纸条2。
本实施例的COVID-19中和抗体检测试剂盒定量检测COVID-19的方法，包括以下步骤：
步骤一：以血清/血浆/全血样本作为检测样本；
步骤二：开启干式荧光免疫分析仪，预热5min后插入对应的含有定标曲线的ID卡；
步骤三：将血液样本加入到COVID-19中和抗体检测卡加样孔中；
步骤四：将COVID-19中和抗体检测卡插入干式荧光免疫分析仪的检测槽；
步骤五：干式荧光免疫分析仪进行分析，10min读取/打印检测结果，其中T1线血管紧张素转化酶2<20提示有中和抗体，T2线第二重组COVID-19S-RBD抗原>20提示有总抗体存在。
氟化铒钠包覆氟化钇钠，粒径为20nm～30nm，其组成为：NaErF4@NaYF4，其中，NaErF4为全铒掺杂核结构；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaErF4表面。本发明的纳米微球为稀土氟化物纳米材料具有背景低，发光寿命长，荧光信号强，信噪比高等优势
在本实施例中，样品垫23上微球线231上使用特定的激发光(808nm)/发射光(670nm)波长的核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠(NaErF4@NaYF4)(直径约20nm～30nm) 标记第一重组COVID-19S-RBD抗原(100μg抗原/200μl纳米微球)，检测线包被紧张素转化酶2(0.5mg/ml)，第二重组COVID-19S-RBD抗原(1mg/ml)，质控线223包被浓度为1mg/ml的羊抗鼠IgG抗体(其中紧张素转化酶2，COVID-19S-RBD抗原采购自上海近岸科技有限公司，羊抗鼠IgG抗体来自长沙博优生物科技有限公司)。微球线 231用量为4μl包被液量/cm样品垫23、检测线和质控线223用量为1μl包被液量/cm膜。
在本实施例中，COVID-19中和抗体检测试剂盒的制备包括以下步骤：
(1)氟化铒钠核结构合成：
在100mL三口圆底烧瓶中，加入4.5mL油酸和12.5mL 1-十八烯，再按摩尔比例，加入1mmol醋酸铒，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入2.5 mmolNaOH和4mmol氟化铵甲醇混合溶液，反应30min；升温至100℃，抽气换气3 次，通入氮气，升温至300℃，反应1.5小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3次，分散于4mL环己烷中。
(2)核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠纳米微球的制备：
在100mL三口圆底烧瓶中，加入3mL油酸和7mL1-十八烯，加入0.5mmol醋酸钇，混合搅拌，在室温下混合搅拌，抽真空，随后升温至120℃，反应20分钟，再升温至160℃，反应10分钟，得到透明溶液；自然冷却至50℃，释放真空，加入1.25 mmolNaOH和2mmol氟化铵甲醇混合溶液，2mL NaErF4纳米微球环己烷溶液，混合搅拌，反应30min；升温至100℃，抽气换气3次，通入氮气，升温至300℃，反应1 小时，6000rpm离心，用环己烷乙醇混合液洗涤3次，分散于环己烷中；利用酸洗法将微球转移至水相，再在微球表面修饰羧基，得到分散性好的水溶性NaErF4@NaYF4稀土纳米荧光微球。所述材料尺寸约为20nm，且形貌均一，发光性能好。纳米微球激发波长为808nm，发射波长为540nm、670nm和1540nm。
(3)稀土纳米微球的活化：
超声波处理稀土纳米微球2min后，取200μl纳米微球以14000rpm高速离心15min后，沉淀物用100mM，pH为6.0的MES溶液洗涤至1ml，超声波处理2min；加入50μl 的100mg/ml碳二亚胺，混匀5min，再加入100μl的100mg/ml N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀15min后14000rpm高速离心15min，沉淀用pH为6.0的MES溶液洗涤至1ml。
(4)稀土纳米微球标记第一重组COVID-19S-RBD抗原的制备：
在上述活化后的荧光微球超声波处理2min后按照100μg/200μl加入第一重组COVID-19S-RBD抗原，混匀2小时，用含0.5％BSA的50mM、pH8.0Tris-HCl封闭液封闭1小时后14000rpm高速离心15min，用含1％(w/w)Nacl、0.5％(w/w)BSA、 0.1％(w/w)Tween-20的50mM、pH8.0的Tris-HCl保存液中缓冲液洗涤两次并超声处理重悬至200μl于4℃避光保存。
(5)包被膜22的制备：
分别用包被缓冲液(含2.5％(w/w)蔗糖的20mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液)将紧张素转化酶2调整浓度到0.5mg/ml，第二重组COVID-19S-RBD抗原调整浓度到 1mg/ml，羊抗鼠IgG抗体调整浓度到1mg/ml，用量为1μl包被液量/cm膜，分别作为第一检测线221，第二检测线222和质控线223平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线223间隔4mm，在湿度<30％，温度45℃烘箱中烘干过夜，封袋，备用；
(6)样品垫23的制备：
用样品垫23处理液含0.1％Tween20、0.5％酪蛋白、3％蔗糖的10mM、pH8.2的PB 浸泡样品垫23，然后37度烘干过夜，在样品垫23上将稀土纳米微球标记的第一重组 COVID-19S-RBD抗原用微球稀释液(1％(w/w)BSA、0.5％酪蛋白、15％(w/w)蔗糖的50mM Tris-HCl缓冲液)稀释20倍均匀喷涂一条线，用量为4μl液量/cm样品垫 23。置于烘箱中，37℃烘干过夜。
(7)试纸条2组装：
在底衬21(尺寸为80*300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫23(尺寸为31*300mm，玻璃纤维棉材质)、包被膜22(尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸24(尺寸为28*300mm)得到试纸板，按照要求切割成4mm宽度的试纸条2。
下面详细介绍标准曲线的绘制
取滴度为1：1200的中和抗体校准品用阴性临床样本分别稀释1.5，2，6，60，240，1200倍，每个浓度重复测量三次，取T/C值均值与校准品浓度建立标准曲线。
取滴度为1：1200的总抗体校准品用阴性临床样本分别稀释1.5，2，6，60，240，1200倍，每个浓度重复测量三次，取T/C值均值与校准品浓度建立标准曲线。
实验结果及分析见表1：
表1 COVID-19中和抗体标准曲线
Figure RE-GDA0003819431280000131
表2 COVID-19总抗体标准曲线
Figure RE-GDA0003819431280000141
以抗原浓度和样本信号T/C平均值绘制标准曲线，曲线数据见表1和表2，通过该标线对样品中所含COVID-19中和抗体和总抗体浓度进行定量测定。
对COVID-19中和抗体检测卡进行性能测试结果：
1.最低检出限：COVID-19中和抗体检测试剂盒(稀土纳米荧光免疫层析法)的LoD为1.0(抗体滴度倒数)；
2.线性范围为1.0-1200，在此线性范围内线性相关系数r大于0.990；
3.用参考品重复测试同个批次试剂盒10次，所得结果的变异系数(CV)≤15％；
4.交叉反应：对人新冠抗体(HKU1,OC43,NL63,229E)，甲型流感病毒抗体，乙型流感病毒抗体，人体免疫缺陷病毒抗体，丙型肝炎病毒抗体，乙型肝炎病毒抗体，呼吸道合胞病毒抗体，巨细胞病毒抗体，EB病毒抗体，肺炎支原体抗体，腺病毒抗体，抗核抗体不存在交叉反应。
为了验证产品性能，还进行了临床样本检测：
对COVID-19中和抗体检测试剂盒进行了评估，以研究产品性能。本研究共纳入321份样本(其中101份为检测样本)，确诊为COVID-19 VNT 50≥20。220份样本来自非 COVID-19感染或未接种疫苗的受试者)。
Figure RE-GDA0003819431280000142
Figure RE-GDA0003819431280000151
*95％置信区间
稀土纳米荧光免疫层析技术的灵敏性，结合干式免疫荧光分析仪，实现了高灵敏度、可准确定量、简便快捷的定量检测COVID-19中和抗体。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种COVID-19中和抗体检测卡，其特征在于，包括卡壳(1)，设置于卡壳(1)内的试纸条(2)，以及转动设置于卡壳(1)侧面的采血针(3)；所述试纸条(2)包括底衬(21)，设置于底衬(21)上表面中部的包被膜(22)，以及分别搭接设置于包被膜(22)的上表面两端的样品垫(23)和吸水纸(24)；所述样品垫(23)喷涂有微球线(231)，所述微球线(231)为由稀土纳米微球标记的第一重组COVID-19S-RBD抗原；所述包被膜(22)上依次设置有第一检测线(221)，第二检测线(222)和质控线(223)，所述第一检测线(221)靠近所述样品垫(23)；所述第一检测线(221)包被有血管紧张素转化酶2，第二检测线(222)包被有第二重组COVID-19S-RBD抗原，质控线(223)包被有羊抗鼠IgG抗体；所述采血针(3)在检测卡的使用过程中具有：使用前收纳状态、使用状态、使用后锁死状态三种状态。
2.根据权利要求1所述的COVID-19中和抗体检测卡，其特征在于，所述稀土纳米微球为核壳结构氟化铒钠包覆氟化钇钠，其组成为：NaErF4@NaYF4；
其中，NaErF4为全铒掺杂核结构；NaYF4为壳层，@表示NaYF4包覆在NaErF4表面。
3.根据权利要求2所述的COVID-19中和抗体检测卡，其特征在于，所述稀土纳米微球在基态下稳定，在808nm的激发光源作用下发射出波长范围在500-550nm，640-680nm和1500-1600nm的三发射荧光。
4.根据权利要求2所述的COVID-19中和抗体检测卡，其特征在于，所述稀土纳米微球的制备活化方法，包括以下步骤：
步骤一：合成氟化铒钠核结构：在容器中，加入油酸、1-十八烯、铒的硝酸盐或醋酸盐或氯化物、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液，并进行反应；随后用环己烷乙醇混合液洗涤，分散于环己烷中，得到NaErF4纳米微球环己烷溶液；
步骤二：制备核壳结构稀土纳米微球：在容器中，加入油酸、1-十八烯、醋酸钇、NaOH和氟化铵甲醇混合溶液、NaErF4纳米微球环己烷溶液，并进行反应，用环己烷乙醇混合液洗涤3～4次，分散于环己烷中；用酸洗法将微球转移至水相，再在微球表面修饰羧基，得到水溶性NaErF4@NaYF4稀土纳米微球；
步骤三：活化稀土纳米微球：对步骤二的稀土纳米微球进行超声波处理和离心处理，对沉淀物用10～100mM，pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤；加入碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，混匀后高速离心，对沉淀物用pH为5.0～7.0的MES溶液洗涤，即得到活化稀土纳米微球。
5.根据权利要求1所述的COVID-19中和抗体检测卡，其特征在于，所述样品垫(23)上喷涂的微球线(231)中。
6.根据权利要求1所述的COVID-19中和抗体检测卡，其特征在于，所述包被膜(22)上第一检测线(221)中血管紧张素转化酶2包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，第二检测线(222)中第二重组COVID-19S-RBD抗原的包被浓度为0.1～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜，质控线(223)中羊抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5～2mg/ml、用量为0.5～1.5μl包被液量/cm膜。
7.根据权利要求1所述的COVID-19中和抗体检测卡，其特征在于，所述试纸条(2)的制备方法包括以下步骤：
步骤一：根据稀土纳米微球的制备活化方法制备得到活化稀土纳米微球；
步骤二：制备稀土纳米微球标记的重组COVID-19S-RBD抗原：对步骤一的活化稀土纳米微球按照50～200μg/200μl加入第一重组COVID-19S-RBD抗原，用封闭液封闭后高速离心，用含保存液洗涤并重悬，于4℃避光保存；
步骤三：制备包被膜(22)：分别用血管紧张素转化酶2，第二重组COVID-19S-RBD抗原和羊抗鼠IgG抗体作为第一检测线(221)、第二检测线(222)和质控线(223)平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，烘干；
步骤四：制备样品垫(23)：用样品垫(23)处理液含0.1％Tween20、0.5％酪蛋白、3％蔗糖的10mM、pH8.2的PB浸泡样品垫(23)37度烘干过夜，在样品垫(23)上用稀土纳米微球标记的第一重组COVID-19S-RBD抗原喷涂一条线，烘干；
步骤五：在底衬(21)上顺次相互搭接地粘贴样品垫(23)、包被膜(22)和吸水纸(24)得到试纸板，切割得到所述试纸条(2)。
8.根据权利要求7所述的COVID-19中和抗体检测卡，其特征在于，所述试纸条(2)的制备方法的步骤四中，用微球稀释液将稀土纳米微球标记的第一重组COVID-19S-RBD抗原稀释8～30倍，用量为2～4μl液量/cm样品垫(23)；所述微球稀释液为含1％BSA、0.5％酪蛋白、15％蔗糖的50mM Tris-HCl缓冲液。
9.一种COVID-19中和抗体检测试剂盒，其特征在于，包括：
COVID-19中和抗体检测卡，结构与权利要求1-8之一所述的COVID-19中和抗体检测卡结构一致；
含有定标曲线的ID卡，由COVID-19中和抗体检测卡测定不同抗体浓度的质控品，以质控品抗原浓度为横坐标，以荧光信号比值作为纵坐标，绘制成标准曲线，写入并生成相应二维码信息存储在ID卡中。
10.根据权利要求9所述的COVID-19中和抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括样本稀释液，其组成成分为1％Tween-20、150mM氯化钠、pH8.0的Tris-HCl。
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