CN115216469A - 一种病毒拭子核酸快速释放保护试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种病毒类采用拭子核酸样本快速释放保护试剂盒及其应用。所述样本释放保护试剂盒包括两个独立的包装组分，快速释放保护剂和反应稳定剂。快速释放保护剂含有0.01‑6 mol/L蛋白变性剂、PH 3.5‑6 10‑80 mmol/L的缓冲液、3%‑30%（w/v）的表面活性剂、0.5‑20 mg/ml的蛋白酶K。反应稳定剂含有0.3‑10 mg/L的PMSF。病毒类采用拭子核酸样本释放保护剂仅需室温10分钟，即可促使拭子上粘附的病毒颗粒裂解并释放出所带核酸，操作及其简单。并且在反应稳定剂的辅助下，所获得的病毒核酸可适用于现有市场上各种PCR检测试剂，具有通用性。
Description
技术领域
本发明涉及一种操作简便，且可通用的病毒类病原体核酸释放和保护的试剂盒。
背景技术
病原体的核酸分子检测因其检测灵敏度高，特异性强，具有其他检测方法所不可比拟的优势，一直作为一种重要的病原体检测手段被广泛应用，并已在临床实验室中广泛推广。尤其是在近期的疫情防控阶段，病毒的核酸检测成为病毒感染与否的首要标准，并且成为区域封闭式大规模疫情筛查的唯一手段。
虽然自疫情爆发后，国内众多厂家推出了各自的针对病毒样本的PCR检测试剂，均具有良好的检测敏感度。但是绝大多数的厂家病毒样本检测试剂的流程为，从检测对象获得鼻拭子、咽拭子或粪便拭子，随后通过各种核酸提取试剂将各种拭子样本中的病原体核酸成分分离出来，最后应用商家的PCR检测试剂进行检测。这就造成检测流程中至少存在三套试剂，样本保护剂、核酸提取试剂、和PCR扩增试剂，导致试验材料要求多、检测时间严重拖长，而且存在流程中各种试剂之间的相互匹配难题。
为解决以上难题，已有部分试剂厂家推出了简化的成套试剂盒，设计了自己的病毒样本快速释放剂，简化了中间病原体核酸纯化分离过程，但是因为其快速释放剂的组分限制，商家不得不设计全新的PCR扩增试剂盒，以便获得阳性检测结果，例如圣湘生物新型冠状病毒核酸检测试剂盒便是采用了这一方略。
总之，快速的病毒病原体核酸释放是目前传染性病原体检测的主流发展方向，但是不恰当的处理方式，限制了样本检测的通用性，造成客户的检测成本因商家的限制而居高不下。一种即快速又通用的核酸释放剂成为市场迫切所需。
发明内容
本发明申请内容涉及病原体核酸检测技术领域，拟提供一种既能简单、快速释放病毒类病原体核酸，又能通用于各类常规PCR核酸检测试剂的病毒类病原体核酸释放和保护的试剂盒。
在本发明试剂盒中快速释放保护剂的作用下，各类拭子中所携带的病毒颗粒蛋白膜被迅速破坏，核酸类物质得以释放。且各种核酸结合蛋白和可能破坏核酸的核酸酶被抑制，使样本在短期内得到保护，便于样本的运输和检测流程的方便安排，增强了检测的便捷性。试剂盒中反应稳定剂则中和了快速释放保护剂中可能影响下游PCR扩增反应的成分，保证PCR扩增反应顺利进行，从而实现了市场上主流的各种PCR扩增试剂盒均可适用，无需对PCR扩增试剂盒进行特殊的重新设计，增加了试剂的通用性。
试剂盒所包含的快速释放保护剂含有蛋白变性剂、表面活性剂、蛋白酶K，可裂解病毒，并释放病毒中所含有的核酸成分；
蛋白变性剂和蛋白酶K同时起到核酸酶抑制剂的作用；
试剂盒所包含的反应稳定剂含有蛋白酶抑制剂，终止蛋白酶的作用，保证后期所获得的的核酸获取物可用于后续的基因检测工作，包括PCR、RT-PCR扩增反应，基因测序建库；
本发明上述特征可通过以下技术方案实现：
所述的快速释放保护剂包括如下组分：
（1）0.01-6 mol/L蛋白变性剂
（2）PH 3.5-6 10-80 mmol/L 缓冲液
（3）3 %-30 %（w/v）表面活性剂
（4）0.5-20 mg/ml蛋白酶K
其中，优选地，所述表面活性剂为Triton X-100、NP-40、Tween-20、SDS中的一种或几种。
优选地，所述缓冲液为甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸缓冲液、Tris缓冲液或邻苯二甲酸缓冲液，PH值为3.5-6，浓度为10-150 mmol/L。
优选地，所述的蛋白变性剂为盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素中的一种或几种，浓度为0.01-6 mol/L。
优选地，所述蛋白酶K、浓度为0.5-20 mg/ml。
所述反应稳定剂为蛋白酶K抑制剂为PMSF，优选地，浓度为0.3-10 mg/L。
相对目前市场上的病原体核酸释放剂，本发明所提供的病毒拭子核酸快速释放保护试剂盒操作程序更加简单快速，兼具样本保存释放于一体，更重要的是，获得的样本可适用于市场上绝大多数通用的PCR扩增检测试剂盒。
附图说明
图1为本发明病毒拭子核酸快速释放保护试剂盒和对照试剂（江苏硕世生物新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒配套核酸提取试剂）对样本1、样本2，通过荧光定量PCR扩增检测Lab靶基因的扩增图。
附图标记：1-对照试剂处理检测样本2；2-实施例2处理检测样本1；3-实施例1处理检测样本2；4-实施例1处理检测样本1；5-实施例2处理检测样本2；6-对照试剂处理检测样本1。
图2为本发明病毒拭子核酸快速释放保护试剂盒和对照试剂（江苏硕世生物新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒配套核酸提取试剂）处理样本1、样本2，并通过荧光定量PCR扩增检测N靶基因的扩增图。
附图标记：1-对照试剂处理检测样本2；2-实施例2处理检测样本1；3-实施例1处理检测样本2；4-实施例1处理检测样本1；5-对照试剂处理检测样本1；6-实施例2处理检测样本2
具体实施方式
以下为通过优化进行的具体实施，以进一步对本发明进行补充说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1试剂成分如下：
快速释放保护剂：2 mol/L Guanidium HCl，0.02 mol/L Tris-HCI，0.01 mol/LUrea，20 %（w/v）Triton X-100, 3 mg/ml Proteinase K，pH 4.2;
反应稳定剂：1.3 mg/L PMSF
实施例2试剂成分如下：
快速释放保护剂：1.5 mol/L Guanidine isothiocyanate，0.1 mol/L CPBS，10 %（w/v）Triton X-100, 5 mg/ml Proteinase K，pH 6.0;
反应稳定剂：2.0 mg/L PMSF
以上实施例所采用的操作方法均如下：
病毒拭子核酸快速释放操作方法为：将采样后的病毒类拭子采样部浸没于含有样本释放保护剂的采样管里，弃去超长的杆部，旋紧管盖，室温条件下，震荡采样管1分钟，静置5分钟；再震荡30秒，并瞬时离心，获取含有核酸片段的释放保护液，上清用于下一步PCR扩增试验。
PCR扩增试验方法为：按照商用PCR试剂盒配置反应液，按照15:1比例加入反应稳定剂，最后加入上一步所获得的含有核酸片段的释放保护液，上PCR扩增仪进行扩增。
PCR扩增试验体系如表格1所示。
表格 1。
PCR扩增程序如表格2所示。
其中，PCR扩增试验所采用的试剂盒为江苏硕世生物新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（国械注准20203400384）。试验中的仪器为上海宏石SLAN-96P，荧光设置参照供应厂商试剂盒说明书。
实施例1-2中的拭子样本为新冠假病毒颗粒标准品悬液（购自北京金豪生物），通过拭子蘸取作为拭子模拟样本。
实施例1-2中对照检测样本采用江苏硕世生物新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒配套核酸提取试剂（病毒DNA/RNA磁珠法核酸提取试剂盒）。
如表格3中PCR扩增检测结果Ct值对比结果所示，本发明的病毒拭子核酸快速释放保护试剂盒对相同类型的拭子样本进行处理后，与采用硕世生物新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒配套核酸提取试剂相比较，在最终PCR扩增检测环节所获得的结果没有显著性差异。
表格 3
Claims (7)
1.一种病毒拭子核酸快速释放保护试剂盒，其特征在于：
试剂盒所包含的快速释放保护剂含有蛋白变性剂、表面活性剂、蛋白酶K，可裂解病毒，并释放病毒中所含有的核酸成分；
蛋白变性剂和蛋白酶K同时起到核酸酶抑制剂的作用；
试剂盒所包含的反应稳定剂含有蛋白酶抑制剂，终止蛋白酶的作用，保证所获得的核酸获取物可用于后续的基因检测工作，包括PCR、RT-PCR扩增反应，基因测序建库。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的快速释放保护剂包括如下组分：
0.01-6 mol/L蛋白变性剂
PH 3.5-6 10-80 mmol/L 缓冲液
3 %-30 %（w/v）表面活性剂
0.5-20 mg/ml蛋白酶K。
3.根据权利要求2所述快速释放保护剂，其特征在于，所述表面活性剂为Triton X-100、NP-40、Tween-20、SDS中的一种或几种。
4.根据权利要求2所述快速释放保护剂，其特征在于，所述缓冲液为甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸缓冲液、Tris缓冲液或邻苯二甲酸缓冲液，PH值为3.5-6，浓度为10-150 mmol/L。
5.根据权利要求2所述快速释放保护剂，其特征在于，所述的蛋白变性剂为盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素中的一种或几种，浓度为0.01-6 mol/L。
6.根据权利要求2所述快速释放保护剂，其特征在于，所述蛋白酶K、浓度为0.5-20 mg/ml。
7.根据权利要求1所反应稳定剂，其特征在于，所述蛋白酶K抑制剂为PMSF, 浓度为0.3-10 mg/L。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20221021 |