CN115216429A - 一种基于山楂水提物制备的复合菌剂及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种基于山楂水提物制备的复合菌剂及其制备方法和应用，所述方法包括：1)山楂水提物的制备；2)将嗜热链球菌种子液在含有山楂水提物的液体培养基中培养，得到嗜热链球菌菌泥；3)将嗜热链球菌菌泥与保护剂混合均匀，冷冻干燥，得到嗜热链球菌菌粉；4)将嗜热链球菌菌粉与山楂粉混合均匀，得到复合菌剂；本发明通过将嗜热链球菌在含有山楂水提物的培养基中进行培养，可以显著提高嗜热链球菌生长繁殖能力和耐酸耐胆盐的能力；通过将山楂粉与冻干的嗜热链球菌菌粉混合得到复合的菌剂可以作为益生菌饲料添加剂用于养殖业，且对饲喂的动物无害，可作为一种新型绿色饲料添加剂开发应用于养殖行业。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种基于山楂水提物制备的复合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
嗜热链球菌来源于乳制品，它是一种耗氧的革兰氏阳性菌，以两个卵圆型为一对的球菌连成约0.7到0.9微米的长链。在MRS培养基上，嗜热链球菌会长成米色的菌落。嗜热链球菌能够改善肠道微环境，降低肠道pH值，促进肠蠕动防止病原菌定植，分泌细菌素抑制病原菌的生长；而且可以抑制胆固醇合成酶活性，降低血清中胆固醇含量，其发酵产物可以调控血压。嗜热链球菌生成的多糖、细菌素、乳酸等具有一定的抗肿瘤活性的作用，通过激活机体免疫系统，抑制细胞的突变来抵抗肿瘤的发生。
目前，嗜热链球菌可以作为益生菌饲料添加剂用于养殖业，但是嗜热链球菌的生长繁殖能力和耐酸耐胆盐能力有限，有待进一步提高。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种基于山楂水提物制备复合菌剂的方法，以改善嗜热链球菌的生长繁殖能力和耐酸耐胆盐的能力。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种基于山楂水提物制备复合菌剂的方法，所述方法包括：
1)山楂水提物的制备：将山楂在水中煎煮1-4h，过滤后得到煎煮液和残渣，接着将所述残渣与水混合后再煎煮1-4次，然后合并多次煎煮得到的煎煮液，得到山楂水提物；
2)将嗜热链球菌种子液在含有所述山楂水提物的液体培养基中进行培养，得到嗜热链球菌菌泥；
3)将所述嗜热链球菌菌泥与保护剂混合均匀，然后进行冷冻干燥，得到嗜热链球菌菌粉；
4)将所述嗜热链球菌菌粉与山楂粉混合均匀，得到复合菌剂。
在进一步的技术方案中，步骤1)中，所述山楂与水的重量比为1:5-15；
所述残渣与所述水的重量比为1:5-15。
在进一步的技术方案中，步骤2)中，所述山楂水提物的体积用量为所述液体培养基的体积的1-15vol％。
在进一步的技术方案中，制备所述嗜热链球菌种子液的方法包括：将嗜热链球菌接种至MRS液体培养基中，在37-40℃下培养12h，得到嗜热链球菌种子液。
在进一步的技术方案中，步骤2)中，所述培养的条件包括：在37-40℃下培养2-48h。
在进一步的技术方案中，步骤3)中，所述冷冻干燥的条件包括：首先在-70～-90℃下预冻1-3h，然后置于冷冻干燥机中冷冻干燥24-36h。
在进一步的技术方案中，步骤3)中，所述保护剂包括乳糖、胰蛋白胨和海藻糖，所述乳糖、胰蛋白胨和海藻糖的重量比为1:1-1.5:1.2-1.6。
在进一步的技术方案中，步骤4)中，所述山楂粉由步骤1)中所述的山楂水提物干燥制得。
优选地，所述山楂粉和所述嗜热链球菌菌粉的重量比为1-5：1。
本发明还提供了一种基于上述方法制备得到的基于山楂水提物制备的复合菌剂。
本发明还提供了一种基于山楂水提物制备的复合菌剂作为饲料添加剂的应用。
与现有技术相比，本发明通过将嗜热链球菌在含有山楂水提物的培养基中进行培养，可以显著提高嗜热链球菌生长繁殖能力和耐酸耐胆盐的能力；山楂水提物干燥得到的山楂粉与冻干的嗜热链球菌菌粉混合得到复合的菌剂可以作为益生菌饲料添加剂用于养殖业，且对饲喂的动物无害，可作为一种新型绿色饲料添加剂开发应用于养殖行业。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式中予以详细说明。
附图说明
图1为实施例1-3和对比例1中嗜热链球菌生长繁殖能力；
图2为实施例4-5和对比例2-3中嗜热链球菌的耐酸能力；
图3为实施例6-7和对比例4-5中嗜热链球菌耐胆盐能力；
图4为实施例8所得嗜热链球菌菌粉(A)及山楂粉(B)。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例用于说明山楂水提物对嗜热链球菌生长繁殖能力的影响。
实施例1
S1.山楂水提物的制备：将干山楂片与清水按照1：10的比例混合后煎煮2h，四层纱布过滤后按照同样的比例再煎煮残渣两次，时间分别为1.5h、1h，过滤后合并三次煎煮液并定容至500mL，即为山楂水提物；
S2.用接种环在平板上划取一个嗜热链球菌菌落，接种至100mL MRS液体培养基中，在39℃的培养箱中过夜培养，得到种子培养液；
S3.在新鲜的MRS液体培养基中加入适量种子培养液，使其OD600为0.1，再加入山楂水提物(山楂水提物的体积用量为MRS液体培养基体积的3％)，在39℃下培养，每隔2h测一次OD600数值，实验结果如图1所示。
实施例2
按照实施例1的方法，不同的是：山楂水提物的体积用量为MRS液体培养基体积的5％，实验结果如图1所示。
实施例3
按照实施例1的方法，不同的是：山楂水提物的体积用量为MRS液体培养基体积的10％，实验结果如图1所示。
对比例1
按照实施例1的方法，不同的是：嗜热链球菌种子培养液培养过程中，不加入山楂水提物，实验结果如图1所示。
从图1中可以看出：嗜热链球菌种子培养液培养过程中加入山楂水提物，能够提高嗜热链球菌生长繁殖能力；当山楂水提物的用量为5vol％时，得到的嗜热链球菌的生长繁殖能力最优。
以下实施例用于说明山楂水提物对嗜热链球菌耐酸性的影响。
实施例4
S1.山楂水提物的制备：将干山楂片与清水按照1：10的比例混合后煎煮2h，四层纱布过滤后按照同样的比例再煎煮残渣两次，时间分别为1.5h、1h，过滤后合并三次煎煮液并定容至500mL，即为山楂水提物；
S2.用接种环在平板上划取一个嗜热链球菌菌落，接种至100mL MRS液体培养基中，在39℃的培养箱中过夜培养，得到种子培养液；
S3.在pH值为3的新鲜MRS液体培养基中加入MRS液体培养基体积5vol％的山楂水提物，再加入1vol％接种量的种子培养液，根据食物在胃中停留时间，在39℃的培养箱中培养4h，测量其OD600数值，实验结果如图2所示。
实施例5
按照实施例4的方法，不同的是，MRS液体培养基的pH值为2，实验结果如图2所示。
对比例2
按照实施例4的方法，不同的是，嗜热链球菌种子培养液培养过程中，不加入山楂水提物，实验结果如图2所示。
对比例3
按照对比例2的方法，不同的是，MRS液体培养基的pH值为2，实验结果如图2所示。
从图2中可以看出：在嗜热链球菌种子培养液培养过程中加入山楂水提物，能够提高嗜热链球菌的耐酸性能。
以下实施例用于说明山楂水提物对嗜热链球菌耐胆盐能力的影响。
实施例6
S1.山楂水提物的制备：将干山楂片与清水按照1：10的比例混合后煎煮2h，四层纱布过滤后按照同样的比例再煎煮残渣两次，时间分别为1.5h、1h，过滤后合并三次煎煮液并定容至500mL，即为山楂水提物；
S2.用接种环在平板上划取一个嗜热链球菌菌落，接种至100mL MRS液体培养基中，在39℃的培养箱中过夜培养，得到种子培养液；
S3.在新鲜的MRS液体培养基中加入MRS液体培养基体积5vol％的山楂水提物，再加入1vol％接种量的种子培养液，取1mL混合后的培养液在12,000rpm离心2min，去除上清液，将菌体用同体积含0.5％胆盐的新鲜培养基重悬，根据食物在胃中停留时间，在39℃下培养4h，对每个样品进行稀释涂布，之后39℃培养24h，计算其CFU和在胆盐中的存活率，实验结果如图3所示。
实施例7
按照实施例6的方法，不同的是：将菌体用同体积含0.3％胆盐的新鲜培养基重悬，实验结果如图3所示。
对比例4
按照实施例6的方法，不同的是：嗜热链球菌种子培养液培养过程中，不加入山楂水提物，实验结果如图3所示。
对比例5
按照对比例4的方法，不同的是：将菌体用同体积含0.3％胆盐的新鲜培养基重悬，实验结果如图3所示。
从图3中可以看出：在嗜热链球菌种子培养液培养过程中加入山楂水提物，能够提高嗜热链球菌的耐胆盐能力。
实施例8：复合菌剂的制备
S1.山楂水提物的制备：将干山楂片与清水按照1：10的比例混合后煎煮2h，四层纱布过滤后按照同样的比例再煎煮残渣两次，时间分别为1.5h、1h，过滤后合并三次煎煮液并定容至500mL，即为山楂水提物；
S2.将山楂水提物进行喷雾干燥，干燥条件为进风温度180℃，蠕动泵速度7min，得到山楂粉(如图4B所示)；
S2.用接种环在平板上划取一个嗜热链球菌菌落，接种至100mL MRS液体培养基中，在39℃的培养箱中过夜培养，得到种子培养液；
S4.冷冻干燥制备菌剂：按照乳糖5.58g/100mL，胰蛋白胨6.27g/100mL，海藻糖7.73g/100mL配置保护剂；
在100mL培养液富集的菌泥中加入20vol％的保护剂，混合均匀。然后在-80℃下预冻2h后置于冷冻干燥机中冷冻干燥24h，冻干结束后，研磨成粉置于4℃冰箱中保存，得到嗜热链球菌菌粉(如图4A所示)；
S5.将山楂粉和嗜热链球菌菌粉按照重量比3：1的比例混合，即可得到复合菌剂。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的特点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种基于山楂水提物制备复合菌剂的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)山楂水提物的制备：将山楂在水中煎煮1-4h，过滤后得到煎煮液和残渣，接着将所述残渣与水混合后再煎煮1-4次，然后合并多次煎煮得到的煎煮液，得到山楂水提物；
2)将嗜热链球菌种子液在含有所述山楂水提物的液体培养基中进行培养，得到嗜热链球菌菌泥；
3)将所述嗜热链球菌菌泥与保护剂混合均匀，然后进行冷冻干燥，得到嗜热链球菌菌粉；
4)将所述嗜热链球菌菌粉与山楂粉混合均匀，得到复合菌剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述山楂与水的重量比为1:5-15；
所述残渣与所述水的重量比为1:5-15。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述山楂水提物的体积用量为所述液体培养基的体积的1-15vol％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备所述嗜热链球菌种子液的方法包括：将嗜热链球菌接种至MRS液体培养基中，在37-40℃下培养12h，得到嗜热链球菌种子液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述培养的条件包括：在37-40℃下培养2-48h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述冷冻干燥的条件包括：首先在-70～-90℃下预冻1-3h，然后置于冷冻干燥机中冷冻干燥24-36h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述保护剂包括乳糖、胰蛋白胨和海藻糖，所述乳糖、胰蛋白胨和海藻糖的重量比为1:1-1.5:1.2-1.6。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述山楂粉由步骤1)中所述的山楂水提物干燥制得；
优选地，所述山楂粉和所述嗜热链球菌菌粉的重量比为1-5：1。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的方法制备得到的基于山楂水提物制备的复合菌剂。
10.根据权利要求9所述的基于山楂水提物制备的复合菌剂作为饲料添加剂的应用。
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