CN111004757A - 一种罗伊氏乳杆菌、微生物菌剂及食物制品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri CCTCC M20191116)，通过细胞实验和动物模型，检测其拮抗肿瘤细胞的功能，可以显著地预防肿瘤的发生，并且显著延长荷瘤小鼠的存活时间。灌胃L.reuteri CCTCC M20191116的荷瘤小鼠能够维持正常谷丙转氨酶的水平，说明L.reuteri CCTCC M20191116能阻止黑色素瘤细胞对肝脏的损伤。本发明属于微生物技术领域，提供的L.reuteri CCTCC M20191116可刺激机体产生抗癌的细胞因子，抑制肿瘤细胞的迁移和定植，保护内脏器官，具有预防肿瘤发生和延长存活时间的功能。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及新的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株及其益生功能，尤其是用于拮抗肿瘤的功能。
背景技术
自古以来各国人民就有食用益生菌发酵食品的传统，Metchnikoff等发现保加利亚农民的长寿与嗜好食用含有乳杆菌的酸奶密切相关。乳杆菌是普遍意义上的益生菌，目前研究发现乳杆菌种类已经超过170多种，可改善和维持机体正常的免疫系统、产生抗菌物质、增强粘膜屏障功能、拮抗致病菌、抗肿瘤等。随着不断的深入研究，肿瘤和益生菌之间的相互作用受到广泛关注，由于99％的微生物都寄居在胃肠道内，很多研究集中于探索肠道微生物与肠癌的相关性，少部分涉及了乳腺癌、黑色素瘤等肿瘤。Zitvogel等认为，肠道内的特定微生物群影响肿瘤的生长，他们将特定的微生物(脆弱拟杆菌和多形拟杆菌与伯克氏菌)定植到无菌小鼠肠腔内，结果显示，肠道菌的移植能够抑制黑色素瘤生长。Sivan等的数据也表明，操纵微生物群可能调节小鼠黑色素瘤免疫治疗。但大多数微生物不能穿越胃肠道屏障进入器官中，与皮肤癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤细胞发生直接作用，而可能与肿瘤细胞发生直接作用的内源性共生菌却研究不多。健康的人体具有各种不同的细菌群，不仅不会危害我们的健康，反而帮助身体进行消化、生长和免疫。
到目前为止，有关哺乳动物器官内源性共生菌与肿瘤细胞的相关研究并不多。
发明内容
本发明人鉴定了一种新的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri CCTCCM20191116菌株，经鉴定，是一类厌氧，不产孢子的革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状，在MRS琼脂平板培养基中呈白棕色，圆形，光滑的菌落。本发明提供的罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116可以在MRS肉汤培养基上生长，是革兰氏阳性菌。
本发明提供一种罗伊氏乳杆菌，其菌株名称为Lactobacillus reuteri，保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M20191116，保藏日期为2019年12月26日。
本发明还提供一种能拮抗肿瘤的微生物菌剂，包括所述的罗伊氏乳杆菌。
优选地，所述肿瘤为黑色素瘤。
本发明还提供一种食物制品，包含所述的罗伊氏乳杆菌，或包含所述的微生物菌剂；所述制品包括乳制品、蔬菜制品及饮料制品。
本发明还提供一种组合物，包含所述的罗伊氏乳杆菌；或包含所述的微生物菌剂；包含所述的食物制品。
此外，本发明还提供罗伊氏乳杆菌在制备防治肿瘤或肝脏损伤的药物中的用途。优选地，所述肿瘤为黑色素瘤。
灌胃本发明提供的罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116可以促进小鼠血清中的TNF-α、INF-γ的分泌量，并随着血液到达肿瘤病灶，对肿瘤的生长和迁移产生抑制作用，从而减少肿瘤的发生率，延长荷瘤小鼠的生存期。并且罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116可以有效的缓解肿瘤生长造成的肝脏受累而损伤情况。
菌株与脱脂牛奶的混合液对模拟胃液和模拟肠液有较好的耐受性。
本发明提供的罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116作为益生菌，不仅具有促进宿主TNF-α、 INF-γ的分泌量，且有良好的耐胆盐性，促进宿主肝功能健康，能减少肿瘤发生率，延长患瘤小鼠寿命，是一株性能优良的菌种。因此，具有很高的研究价值和应用价值。
本发明所述罗伊氏乳杆菌可用于制作治疗和预防肿瘤疾病的组合物成分，还可以用于保健品和抗肿瘤药品的复合剂。
附图说明
图1罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116对模拟肠胃液的耐受能力。其中，PBS组菌株在PBS溶液中；Milk+GJ+IJ组菌株在10％脱脂乳(Milk)、模拟胃液(GJ)、模拟肠液(IJ)的混合溶液中；GJ+IJ组菌株在模拟胃液(GJ)、模拟肠液(IJ)的混合溶液中。
图2罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116对黑色素瘤B16-F10的预防作用小鼠体重影响。 M模型组(皮下注射黑色素瘤细胞B16-F10的小鼠)；F实验组(皮下注射黑色素瘤细胞B16-F10同时每天灌胃罗伊氏乳杆菌的小鼠)；C对照组(只灌胃10％脱脂乳没有其他任何处理的小鼠)。
图3罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116对黑色素瘤B16-F10模型小鼠发生率的影响。其中，M模型组(皮下注射黑色素瘤细胞B16-F10的小鼠)；F灌胃组(皮下注射黑色素瘤细胞B16-F10同时灌胃罗伊氏乳杆菌的小鼠)；C对照组(只灌胃10％脱脂乳没有其他任何处理的小鼠)。
图4罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116对小鼠肝脏的保护作用。其中，FT灌胃肿瘤组(皮下注射黑色素瘤细胞B16-F10同时灌胃罗伊氏乳杆菌产生肿瘤的小鼠)；FO灌胃无肿瘤组 (皮下注射黑色素瘤细胞B16-F10同时灌胃罗伊氏乳杆菌没有产生肿瘤的小鼠)；MT模型肿瘤组(皮下注射黑色素瘤细胞B16-F10产生肿瘤的小鼠)；MO模型无肿瘤组(皮下注射黑色素瘤细胞B16-F10没有产生肿瘤的小鼠；C对照组(只灌胃10％脱脂乳没有其他任何处理的小鼠)。
图5罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116对患黑色素瘤B16-F10小鼠寿命的影响。其中，M模型组(荷瘤小鼠)；F实验组(灌胃罗伊氏乳杆菌的荷瘤小鼠)。
图6罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116灌胃组小鼠血清对黑色素瘤B16-F10细胞活性的影响。其中，F灌胃组；C对照组。
图7罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116灌胃对小鼠肿瘤组织TNF-α、IL-6、INF-γ分泌的影响。其中，Model模型组(荷瘤小鼠)；Treatment实验组(灌胃罗伊氏乳杆菌的荷瘤小鼠)；M模型组(荷瘤小鼠)；F实验组(灌胃罗伊氏乳杆菌的荷瘤小鼠)；
图8罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116灌胃对小鼠血清中TNF-α、INF-γ分泌的影响。其中，M模型组(荷瘤小鼠)；F实验组(灌胃罗伊氏乳杆菌的荷瘤小鼠)。
图9罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116灌胃对小鼠肝脏的保护作用病理评估。其中，M模型组(荷瘤小鼠)；F实验组(灌胃罗伊氏乳杆菌的荷瘤小鼠)；O对照组(只灌胃脱脂乳的正常小鼠)。
本发明提供的罗伊氏乳杆菌，其菌株名称为Lactobacillus reuteri，保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M20191116，保藏日期为2019年12月26日，保藏地址为中国武汉武汉大学。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施例仅用于说明本发明，而本发明的应用范围不能以任何方式由这些实施例所限制。
实施例1：罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116的分离与鉴定
将雌性8周大小的健康BALB/C小鼠取血后用新吉尔灭浸泡消毒，再进行解剖，将肝脏及肾脏分别使用组织研磨棒进行研磨至浆状，生理盐水梯度稀释后涂布在含1％万古霉素的 MRS平板上，放至37℃厌氧恒温培养箱中培养48h，待菌落长出后挑取单菌落，在平板上划线分离，反复进行纯化培养，用革兰氏染色法观察菌落形态选出革兰氏阳性菌。将分离得到的菌株液体培养后，平板培养，用接种环挑取单一的菌落作为模板，进行菌落PCR。将阳性 PCR产物送至公司测序。
将所分离菌株的16S rRNA碱基序列分析测序碱基序列进行比对分析，发现与数据库里的罗伊氏乳杆菌序列一致。将所获得的菌株保存于武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏号为Lactobacillus reuteri CCTCC M20191116。16S rRNA碱基序列如下所示：
ATACATGCAAGTCGTACGCACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGACGA TGGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCG GGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTT TGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTG GTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCA CAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCAC AATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTA AAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATC CAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAA GCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGA GGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTG GCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAA CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCArGCCGTAAACGATGAGTGCTAGTGTTGGAGGGTTT CCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAA GGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA，即SEQ ID NO：1。
实施例2：L.reuteri CCTCC M20191116与10％脱脂乳混合液的耐酸耐胆盐
益生菌在经过胃、肠消化过程中，除了酸压力和胆盐压力，还有各种消化酶可能会对菌体造成受损伤或导致其死亡，从而导致最终到达肠道关键作用位点的活菌数大量减少。实验结果如图1所示，PBS混合的存活率只有0.1％，而10％脱脂乳的菌悬液在模拟转运结束后为起始菌总数的10％，由此可见，脱脂乳在益生菌在胃肠道转运过程中可以极大的保护乳杆菌的活力，有助于乳杆菌到达肠道，保证其相应的功能。罗伊氏乳杆菌CCTCCM20191116与 10％的脱脂乳进行混合后耐酸和耐胆盐的能力是对照组的100倍，与脱脂乳混合进行实验可以很好的保证该菌到达肠道作用位点，保证其充分发挥相应功能。
实施例3：罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116灌胃预防组小鼠体重变化
通过皮下注射的方式对BALB/C小鼠进行黑色素瘤细胞造模，15天左右可以观察到小鼠肿瘤有发生，随之肿瘤不断变大，重量也逐渐增多，体重在后期迅速增加，变化如图2所示。模型组小鼠36日小鼠开始出现死亡现象，而每三天灌胃100μL108CFU/mL罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116脱脂乳菌悬液(10％脱脂乳)的灌胃组和同样每三天灌胃100μL10％脱脂乳的对照组小鼠都未出现死亡现象。
如图2所示，通过灌胃罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116能缓解因肿瘤引起的小鼠体重增加，一定程度上缓解了宿主的荷瘤负担。
实施例4：菌株对造模小鼠的肿瘤发生率的影响
造模过程中20天后肿瘤发生情况稳定，不再有新的肿块出现。如图3所示，模型组肿瘤发生率达到70％，而罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116灌胃组肿瘤发生率为30％。
实验结果表明罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116能够有效的抑制黑色素瘤B16-F10的肿瘤发生率。
实施例5：肝功能指标的检测
小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)的含量检测结果如图4所示，罗伊氏乳杆菌 CCTCCM20191116灌胃组小鼠无论是有肿瘤还是没有肿瘤小鼠，血清中谷丙转氨酶含量与空白组的一致，但模型组的谷丙转氨酶含量显著上升，而且同组中观察到肿瘤的小鼠比没有肿瘤块的小鼠，谷丙转氨酶含量要高出2倍多。实验结果表明：灌胃罗伊氏乳杆菌 CCTCCM20191116能够有效的降低小鼠血清中ALT的分泌水平，证明对小鼠肝脏具有很好的保护作用。
实施例6：治疗组小鼠存活率及肿瘤大小记录
接种黑色素瘤细胞15天后，选取观察到有肿瘤块的小鼠进行分组，灌胃组小鼠每三天灌胃100μL108CFU/mL罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116脱脂乳菌悬液(10％脱脂乳)，而模型组每三天灌胃100μL 10％的脱脂乳。图5为实验小鼠生存曲线图。第20天开始，模型组开始出现死亡现象，40天全部死亡。而罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116灌胃组在第30天开始出现死亡现象，持续观察60天后，仍然还有2只存活。由图5，可以得出结论，罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116能够显著延长患瘤小鼠的存活时间。
实施例7血清对肿瘤细胞的抑制作用
实验小鼠分为两组，灌胃组小鼠每三天灌胃100μL108CFU/mL罗伊氏乳杆菌 CCTCCM20191116脱脂乳菌悬液(10％脱脂乳)，对照组每三天灌胃100μ10％脱脂乳。30 天后分别取小鼠血清，与黑色素瘤细胞B16-F10细胞短时间共孵育(2h)后检测黑色素瘤细胞的存活率。PI和台盼蓝染色结果如图6所示，灌胃组的小鼠血清与细胞孵育2h，通过PI 染色和台盼蓝细胞死亡率显著性的低于对照组。如图6所示，罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116灌胃小鼠，可刺激机体分泌免疫因子，进而对肿瘤细胞活性具有明显的抑制作用。
实施例8：肿瘤组织中相关的细胞因子的变化情况
细胞因子IL-6、TNF-α、INF-γ是影响肿瘤生长过程重要的免疫因子。按照实施例6的方法处理小鼠后，将模型组和L.reuteri CCTCC M20191116灌胃组小鼠肿瘤块进行免疫组化染色，分析肿瘤块中IL-6、TNF-α、INF-γ的分泌情况，结果如图7所示。灌胃L.reuteriCCTCC M20191116后，肿瘤块中的IL-6和TNF-α具有一个下调的现象，其中IL-6的下调作用具有显著性。而INF-γ的表达量却显著上升。
如图7所示，罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116灌胃之后，肿瘤组织中的IL-6和TNF-α具有一个下调的现象，其中IL-6的下调作用具有显著性。而INF-γ的表达量却显著上升。
实施例9：实验小鼠血清中细胞因子的表达水平
使用酶联免疫试剂盒分析法对小鼠的血清进行分析，检测试验结果如图8，血清中的 TNF-α、INF-γ都具有一个明显的上调。
如图8所示，我们可以得出结论，由于菌株CCTCC M20191116的摄入刺激小鼠的免疫调节，提高机体TNF-α、INF-γ等细胞因子的分泌量，随着血液运输，对黑色素瘤细胞的转移和定植具有抑制效果。
实施例10：小鼠肝脏组织病理评分
患肿瘤小鼠进行取样做组织病理切片分析，并进行病理评估，如图9所示，罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116灌胃组小鼠组织肝小叶膨大相对模型组有明显的缓解效果，对应其病理评分结果可知，模型组的肝脏受损程度较大。
如图9所示，持续灌胃植物罗伊氏乳杆菌CCTCC M20191116的小鼠的肝脏损伤程度较对照组具有明显的缓解，可见，该菌株具有对肝脏的保护作用。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市沁帆科技有限公司
<120> 一种罗伊氏乳杆菌、微生物菌剂及食物制品
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 929
<212> DNA
<213> Lactobacillus reuteri
<400> 1
atacatgcaa gtcgtacgca ctggcccaac tgattgatgg tgcttgcacc tgattgacga 60
tggatcacca gtgagtggcg gacgggtgag taacacgtag gtaacctgcc ccggagcggg 120
ggataacatt tggaaacaga tgctaatacc gcataacaac aaaagccaca tggcttttgt 180
ttgaaagatg gctttggcta tcactctggg atggacctgc ggtgcattag ctagttggta 240
aggtaacggc ttaccaaggc gatgatgcat agccgagttg agagactgat cggccacaat 300
ggaactgaga cacggtccat actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg 360
gcgcaagcct gatggagcaa caccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc gtaaagctct 420
gttgttggag aagaacgtgc gtgagagtaa ctgttcacgc agtgacggta tccaaccaga 480
aagtcacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg 540
gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gttgcttagg tctgatgtga aagccttcgg 600
cttaaccgaa gaagtgcatc ggaaaccggg cgacttgagt gcagaagagg acagtggaac 660
tccatgtgta gcggtggaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctg 720
tctggtctgc aactgacgct gaggctcgaa agcatgggta gcgaacagga ttagataccc 780
tggtagtcca tgccgtaaac gatgagtgct agtgttggag ggtttccgcc cttcagtgcc 840
ggagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg 900
aattgacggg ggcccgcaca agcggtgga 929
Claims (7)
1.一种罗伊氏乳杆菌，其特征在于：其菌株名称为Lactobacillus reuteri，保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M20191116。
2.一种能拮抗肿瘤的微生物菌剂，其特征在于：包括权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌。
3.根据权利要求2所述的能拮抗肿瘤的微生物菌剂，其特征在于：所述肿瘤为黑色素瘤。
4.一种食物制品，其特征在于：包含权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌，或包含权利要求2或3所述的微生物菌剂；所述制品包括乳制品、蔬菜制品及饮料制品。
5.一种组合物，其特征在于：包含权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌；或包含权利要求2或3所述的微生物菌剂；或包含权利要求4所述的食物制品。
6.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌在制备防治肿瘤或肝脏损伤的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的罗伊氏乳杆菌在制备防治肿瘤或肝脏损伤的药物中的用途，其特征在于：所述肿瘤为黑色素瘤。
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| GR01 | Patent grant | ||
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