CN115215826A - 一种基于香豆素的新型n2h4荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于香豆素的新型n2h4荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于香豆素的新型N2H4荧光探针及其制备方法和应用，荧光探针为2‑氧代‑2H‑色烯‑7‑基4‑溴丁酸酯，其可以特异性检测环境水样和生物体内的N2H4。荧光探针上4‑溴丁酰基修饰7‑羟基香豆素上羟基阻断7‑羟基香豆素分子内电荷转移过程，淬灭荧光基团荧光，然后所述被检测物N2H4能够首先通过亲核取代反应攻击荧光探针末端溴原子，接下来，另一个带有孤对电子的氮通过亲核加成攻击酯基上的羰基碳，然后加成环化形成稳定的六元环脱去，释放出7‑羟基香豆素产生荧光增强实现对N2H4的特异性检测。该荧光探针制备过程简单，结构稳定，且具有较好的细胞膜通透性以及较低的细胞毒性。

Description

一种基于香豆素的新型N2H4荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及有机小分子荧光探针技术领域，具体的涉及一种基于香豆素的新型N2H4荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
联氨(N2H4)是一种具有腐蚀性、高还原性的精细化学原料，广泛应用于制药、化学、催化、农业等领域。尽管N2H4有广泛的工业应用，但肼对生物体也具有剧毒和致癌性。N2H4在使用或运输过程中，微量泄漏也会污染环境，并通过吸入或皮肤接触进入人体，造成呼吸和神经系统的伤害。因此，开发一种快速、简单、敏感和有选择性的检测肼的方法在环境和生物科学领域至关重要。
近年来报道了许多检测N2H4的常规方法，如滴定法、光谱化学法、电化学法、表面增强拉曼光谱法和色谱法。然而，这些检测方法有许多缺点，如要求对测试样品进行预处理，准备特定的测试试剂，测试时间长，设备昂贵，操作复杂以及难以实现实时监控。此外，这些检测方法对N2H4检测灵敏度低以及不能用来可视化生物样品中的N2H4的缺点限制了它们的发展。
荧光探针技术在理论和应用方面都有了快速的发展，现在它已经被广泛地应用于医学、生命科学和环境科学等多个领域。然而，许多这类探针仍然存在着包括低选择性、生物相容性差和背景干扰等问题，这严重限制了它们在细胞和体内的应用。因此，设计和合成具有选择性、敏感性、生物相容性并能在细胞和体内检测N2H4的有机小分子荧光探针意义重大。为此，我们提出一种基于香豆素的新型N2H4荧光探针的合成及应用。
发明内容
1.要解决的技术问题
本发明要解决的技术问题在于提供一种基于香豆素的新型N2H4荧光探针的合成及应用，有以下目的：
本发明第一个目的是开发出一种可选择性检测环境污染物N2H4的荧光探针，该荧光探针可在其他分析物干扰下区分N2H4的存在。
本发明第二个目的是提供一种可特异性检测环境污染物N2H4的荧光探针的制备方法。
本发明第三个目的是发展一种能够定量检测环境水样中N2H4的方法。
本发明第四个目的是研究一种能够可视化细胞以及活体中外源性N2H4迁移分布规律的方法。
2.技术方案
为解决上述问题，本发明采取如下技术方案：
一种基于香豆素的新型N2H4荧光探针，所述荧光探针为2-氧代 -2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯，其分子式为：C13H11BrO4，合成路径如下：
Figure RE-GDA0003851204370000021
该荧光探针由两部分组成，其中4-溴丁酰基作为识别基团，7- 羟基香豆素为信息报告基团。
上述基于香豆素的新型N2H4荧光探针的制备方法，包括以下具体操作步骤：
步骤一：将7-羟基香豆素(2.0g，12.3mmol)和三乙胺(1.87 g，18.5mmol)在30mL的二氯甲烷中充分混匀，获得混合液A；
步骤二：将步骤一中获得的混合液A通过冰浴将温度降至0℃；
步骤三：将4-溴丁酰氯(2.73g，14.8mmol)用恒压滴液漏斗缓慢加入经过步骤二处理的溶液中，获得混合液B；
步骤四：将步骤三获得的混合液B温度升至室温，并搅拌3小时，获得混合液C，其中，反应进度使用TLC板进行监测；
步骤五：将步骤四中的混合液C，减压浓缩获得粗产物，利用洗脱液通过层析柱法分离纯化得到探针2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯；所述洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，其对应比例为4:1。
上述基于香豆素的新型N2H4荧光探针用于N2H4的特异性检测。
所述的基于香豆素的新型N2H4荧光探针用于溶液体系中N2H4的检测，包括以下具体操作步骤：
步骤1：将4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和二甲基亚砜(DMSO) 按体积比为1:1配置成pH值为7.4的缓冲液，用制得的缓冲液将所述的荧光探针配置成浓度为10μM的荧光探针工作液；
步骤2：取54份3.0mL步骤1所得的荧光探针工作液，向其中分别加入200μL待测分析物，待测分析物的浓度为5×10-5mol/L，其中，待测分析物共17种，每种待测分析物由3个平行单元，得到54份反应物，反应物中分析物最终浓度为200μM，反应完全后分别对54份反应物进行荧光强度测定；
步骤3：通过步骤2的荧光强度测定获得结果；结果表明，N2H4能够提高荧光探针荧光探针工作液荧光强度；该荧光探针仅仅可以与 N2H4发生荧光增强反应，不受其他分析物的干扰，即所述荧光探针对 N2H4的识别具有特异性和抗干扰性。
所述的基于香豆素的新型N2H4荧光探针用于HeLa细胞中N2H4的检测，包括以下具体操作步骤：
步骤①：制备荧光探针工作液；将4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 和二甲基亚砜(DMSO)按体积比为1:1配置成pH值为7.4的缓冲液，用制得的缓冲液将所述的荧光探针配置成浓度为20μM的荧光探针工作液；
步骤②：制备多组被检测物，取a1、b1、c1、d1、e1五组实验；
a1组为空白对照组：未经任何处理的HeLa细胞，为a1组被检测物；
b1组为N2H4处理对照组：用浓度50μM的N2H4与HeLa细胞孵育20分钟，得到用于检测的b1组被检测物；
c1组为荧光探针处理对照组：用浓度20μM的荧光探针与HeLa细胞孵育20分钟，得到用于检测的c1组被检测物；
d1组为实验组1：用浓度为20μM的荧光探针工作液预处理HeLa细胞的孔板20分钟，然后与N2H4(50μΜ)一起孵育20分钟，得到用于检测的d1组被检测物；
e1组为实验组2：用浓度为20μM的荧光探针工作液预处理HeLa细胞的孔板20分钟，然后与N2H4(100μΜ)一起孵育20分钟，得到用于检测的e1组被检测物；
步骤③：利用荧光显微镜对比；将步骤②中的a1组被检测物、b1 组被检测物、c1组被检测物、d1组被检测物和e1组被检测物分别放置在荧光显微镜下观察；
步骤④：获得结果：荧光成像结果显示a1组被检测物、b1组被检测物和c1组被检测物均未发现有荧光；而d1组和e1组被检测物显示出明显的绿色荧光，而且随着N2H4浓度的增加，荧光增强越明显；荧光成像结果表明1所述荧光探针能够进入HeLa细胞并与外源性N2H4发生反应，产生强烈的绿色荧光，实现HeLa细胞中外源性N2H4的特异性检测。
所述的基于香豆素的新型N2H4荧光探针用于斑马鱼中外源N2H4的检测，包括以下具体操作步骤：
步骤Ⅰ：制备荧光探针工作液；将4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 和二甲基亚砜(DMSO)按体积比为1:1配置成pH值为7.4的缓冲液，用制得的缓冲液将所述的荧光探针配置成浓度为30μM的荧光探针工作液；
步骤Ⅱ：制备多组被检测物，取a2、b2、c2、d2四组实验；
a2组为空白对照组：未经处理过的3日龄斑马鱼，得到用于检测的a2组被检测物；
b2组为荧光探针处理对照组：取用10mL浓度为30μM的荧光探针工作液对3日龄斑马鱼处理30分钟，得到用于检测的b2组被检测物；
c2组为N2H4处理对照组：用10mL，且浓度为100μM的N2H4与发育正常的3日龄斑马鱼孵育30分钟，得到用于检测的c2组被检测物；
d2组为实验组：将3日龄斑马鱼用10mL，且浓度为100μM的N2H4孵育30分钟，处理完成后，再使用浓度为30μM的荧光探针工作液处理30分钟，得到用于检测的d2组被检测物；
步骤Ⅲ：利用荧光显微镜对比；将步骤Ⅱ中的a2组被检测物、b2 组被检测物、c2组被检测物和d2组被检测物分别放置在荧光显微镜下观察；
步骤Ⅳ：获得结果；结果显示a2组被检测物、b2组被检测物和c2 组被检测物未发现有荧光；而d2组被检测物显示出明显的绿荧光；荧光成像结果表明所述荧光探针能够进入斑马鱼体内并与外源性N2H4发生反应，产生强烈的绿色荧光，实现斑马鱼体内外源性N2H4的特异性检测。
所述的基于香豆素的新型N2H4荧光探针用于环境水样中N2H4的检测，包括以下具体操作步骤：
步骤
Figure RE-GDA0003851204370000061
制备荧光探针工作液；将4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 和二甲基亚砜(DMSO)按体积比为1:1配置成pH值为7.4的缓冲液，用制得的缓冲液将所述的荧光探针配置成浓度为10μM的荧光探针工作液；
步骤
Figure RE-GDA0003851204370000062
制备待测环境水样；采集不同区域的环境水样，并通过100μm水相滤膜过滤，得到处理后的环境水样；在处理后的环境水样中，添加浓度为0.1μM、0.5μM和1.0μM的N2H4，得到多组不同的环境水样；
步骤
Figure RE-GDA0003851204370000071
荧光强度测定；向步骤
Figure RE-GDA0003851204370000072
的多组待测环境水样中分别添加步骤
Figure RE-GDA0003851204370000073
制得的荧光探针工作液，反应完全后，分别对不同环境水样反应物进行荧光强度测定；
步骤
Figure RE-GDA0003851204370000074
获得结果；结果表明，N2H4的回收率达到80-104％，结果表明荧光探针工作液能够在环境水样中定量的检测N2H4的存在。
3.有益效果
(1)本发明所述荧光探针原料易得且便宜，合成步骤简单，仅通过一步反应完成该荧光探针的合成，反应条件温和。
(2)本发明利用4-溴丁酰基阻断7-羟基香豆素分子内电荷转移过程，淬灭7-羟基香豆素荧光，然后所述被检测物N2H4能够首先通过亲核取代反应攻击荧光探针末端溴原子，接下来，另一个带有孤对电子的氮通过亲核加成攻击酯基上的羰基碳，然后加成环化形成稳定的六元环脱去，释放出7-羟基香豆素产生荧光增强；
(3)该荧光探针能够特异性识别N2H4，并且可排除溶液及生物体中常见分析物的干扰荧光探针；
(4)该荧光探针具有低细胞毒性、良好的组织下穿透力和较低的检测限(78nM)；
(5)该荧光探针logP＝2.63，表明该荧光探针属于亲水性化合物，具有较好的水溶性；
(6)该荧光探针能够定量检测不同水环境中的痕量N2H4。
(7)该荧光探针具有良好的活体成像应用潜力。
附图说明
图1为本发明的2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯与N2H4反应产物的核磁共振氢谱图；
图2为本发明的2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯与N2H4反应前后化合物的量子化学计算图；
图3为不同因素对2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯检测N2H4的影响(a：溶剂比例；b：pH)；
图4为本发明的2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯的工作液中加入不同分析物等化合物反应的荧光发射和紫外光谱图；
图5为本发明的2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯的工作液中加入不同分析物等化合物反应的荧光发射和紫外光谱图；
图6为本发明的2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯对HeLa细胞中外源性N2H4的荧光成像图；
图7为本发明的2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯对3日龄斑马鱼中外源性N2H4的荧光成像图；
表1为本发明的2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯对不同环境水样中N2H4的添加回收；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
该荧光探针2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯的特征在于它由两部分组成，其中4-溴丁酰基作为识别基团，7-羟基香豆素为信息报告基团。所报告荧光探针上4-溴丁酰基修饰7-羟基香豆素上羟基阻断7-羟基香豆素分子内电荷转移过程，淬灭荧光基团荧光，然后所述被检测物N2H4能够首先通过亲核取代反应攻击荧光探针末端溴原子，接下来，另一个带有孤对电子的氮通过亲核加成攻击酯基上的羰基碳，然后加成环化形成稳定的六元环脱去，释放出7-羟基香豆素产生荧光增强实现对N2H4的特异性检测。
下面结合实施例对本发明进一步描述：
实施例1
用于特异性识别N2H4的荧光探针制备方法
本发明本发明所述荧光探针为2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯，具体制备过程如下：
Figure RE-GDA0003851204370000091
一种基于香豆素的新型N2H4荧光探针的制备方法，包括以下具体操作步骤：
①将7-羟基香豆素(2.0g，12.3mmol)和三乙胺(1.87g，18.5mmol)充分在30mL的二氯甲烷中混匀；
②将上述混合溶液通过冰浴将温度降至0℃；
③然后将4-溴丁酰氯(2.73g，14.8mmol)用恒压滴液漏斗缓慢加入溶液中；
④将混合物温度升至室温搅拌3小时，反应进度使用TLC板进行监测；
⑤反应完成后，减压浓缩获得粗产物，利用洗脱液通过层析柱法分离纯化得到探针2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯(3.2g，产率83.6％)。
上述洗脱液分别为石油醚和乙酸乙酯，比例为4:1。核磁共振氢谱：1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.05(d,J＝9.6Hz,1H),7.75 (d,J＝8.4Hz,1H),7.28(d,J＝2.2Hz,1H),7.16(dd,J＝ 8.4,2.2Hz,1H),6.45(d,J＝9.6Hz,1H),3.62(t,J＝6.6 Hz,2H),2.76(t,J＝7.3Hz,2H),2.19–2.15(m,2H)。高分辨质谱：HRMS(ESI，m/z)calcd for[C13H11BrO4+H]+:310.9919，发现:310.9910。
所述荧光探针为2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯，如式(I) 所示
Figure RE-GDA0003851204370000101
本发明所述荧光探针2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯对N2H4的识别机理如下：
Figure RE-GDA0003851204370000102
(1)本发明所述荧光探针，2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯与N2H4发生反应，所述被检测物N2H4能够首先通过亲核取代反应攻击荧光探针末端溴原子，接下来，另一个带有孤对电子的氮通过亲核加成攻击酯基上的羰基碳，然后加成环化形成稳定的六元环脱去，释放出7-羟基香豆素产生荧光增强实现对N2H4的特异性检测。不仅如此，产物7-羟基香豆素的能级差为4.60eV，小于荧光探针的4.69eV，说明香豆素荧光基团比荧光探针更稳定。探针与N2H4的反应也被显示为基于分子内电荷转移(ICT)机制，导致荧光探针的荧光增加，密度泛函数理论计算验证了上述反应机理的正确性。图1-2显示了该荧光探针与N2H4反应产物的核磁共振图谱和密度泛函数理论计算；
(2)结果排除了溶液及生物体中常见分析物的干扰，且检测限低至78nM，该检测限相对于大多数同类型N2H4荧光探针具有很大的优势。
实施例2
用于溶液体系中荧光探针对N2H4的识别影响因素筛选：
(1)将实施例1中所制备的荧光探针用不同比例的二甲基亚砜与 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)配制成浓度为10μM的荧光探针溶液，所述比例分别为10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％， 100％；向使用不同比例二甲基亚砜配制好的3.0mL浓度为10μM的荧光探针溶液中分别对应加入200μM N2H4，每种溶液设置三个平行；反应完全，得到60份反应物(包含纯荧光探针溶液)，分别对60份反应物进行荧光强度测定。图3(a)可以看出甲基亚砜与4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)比例为1:1时，对于2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯识别N2H4的效果最好，因此，后续选择甲基亚砜与4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)比例为1:1作为溶剂比例进行后续试验。
(2)将实施例1中所制备的荧光探针用缓冲液配制成浓度10μM 的工作液，所述缓冲液由体积比为1:1的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 和二甲基亚砜(DMSO)配制成；设置缓冲溶液pH为2，3，4，5，6， 6.5，7，7.4，8，9，10，11，12；向不同pH浓度为10μM的荧光探针溶液中分别对应加入200μM N2H4，每种溶液设置三个平行；反应完全，得到78份反应物，分别对78份反应物进行荧光强度测定(包含纯荧光探针)。图3b可以看出pH对于2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯识别 N2H4的影响较小，考虑到后续在生物体内进行成像实验，因此选择生理pH为7.4作为后续实验溶液的pH。
实施例3
用于溶液体系中荧光探针对N2H4的选择性和抗干扰性研究：
(1)将实施例1中所制备的荧光探针用缓冲液配制成浓度10μM 的工作液，所述缓冲液由体积比为1:1的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 和二甲基亚砜(DMSO)配制成，缓冲液的pH值为7.4；
(2)用10μM的荧光探针溶液选择性的对溶液中的N2H4进行检测；取54份3.0mL浓度10μMol/L的荧光探针溶液，向其中分别加入200 μL浓度为5×10-5mol/L的待测分析物，待测分析物共17种，分别为色氨酸(Try)、半胱氨酸(Cys)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)，联氨(N2H4)，碘化钾(KI)，氯化钙(CaCl2)，氯化钠(NaCl)，氯化汞(HgCl2)，氯化钴(CoCl2)，氯化钡(BaCl2)，硝酸银(AgNO3)和氯化镍(NiCl2)；每种待测分析物由3个平行单元组成一组，反应得到54份反应物(包括空白组三个平行)，反应物中分析物最终浓度为200μM，反应完全后分别对54份反应物进行荧光强度测定；
(3)反应完全，得到54份反应物，分别对54份反应物进行荧光强度测定；
(4)图4a表示N2H4存在与否条件下检测体系荧光强度的结果，结果显示仅N2H4存在下工作溶液中的荧光强度有了明显的增强，即2- 氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯对N2H4具有较高的特异性；不仅如此，图4b显示了该荧光探针对N2H4的抗干扰能力结果，结果表明其他干扰分析物并不会影响荧光探针对N2H4的响应；综上，所述荧光探针可以特异性识别N2H4，并具有较强的抗干扰能力。
实施例4
用于溶液体系中荧光探针对N2H4的识别灵敏度：
(1)将实施例1中所制备的荧光探针用缓冲液配制成浓度10μM 的工作液，所述缓冲液由体积比为1:1的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 和二甲基亚砜(DMSO)配制成，缓冲液的pH值为7.4；
(2)用10μM的荧光探针溶液对不同浓度(0μM，10μM，20μM， 30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，100μM)的N2H4进行荧光检测；
(3)向配制好的33份3.0mL浓度10μM的荧光探针溶液，分别对应加入不同浓度(0μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM， 70μM，80μM，90μM，100μM)的N2H4，每个浓度设三组平行单元；
(4)反应完全，得到33份反应物，分别对33份反应物进行荧光强度测定。
(5)由图5a可见，N2H4能够提高荧光探针溶液荧光强度，随着 N2H4浓度的不断的增大，荧光探针溶液的荧光强度随之增强；图5(b) 显示工作溶液的荧光强度与N2H4的浓度呈较好的线性关系 (R2＝0.9926)，计算得到荧光探针对N2H4的检测限低至78nM，即该荧光探针能够定量检测溶液中痕量N2H4的存在。
实施例5
应用于环境水样中N2H4的定量检测
(1)用于环境水样中N2H4检测时，用缓冲液配制成浓度10μM 的工作液，所述缓冲液由体积比为1:1的4-羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)和二甲基亚砜(DMSO)配制成，缓冲液的pH值为7.4；
(2)用于环境水样中外源性N2H4检测时，采集不同区域的环境水样，并将其通过100μM水相滤膜过滤，得到处理后的环境水样；向处理后的环境水样中添加0.1μM、0.5μM和1.0μM的N2H4；
(3)向荧光探针工作液中添加不同待测环境水样，反应完全后分别对不同环境水样反应物进行荧光强度测定，结果入表1所示；
表1.荧光探针在不同环境水样中对N2H4的添加回收
Figure RE-GDA0003851204370000151
*上述水样是在多个点采集的，采样点不小于5。数据为平均值±标准差(n＝3)，LOQ＝0.1mg/L。
(4)表1可以看出N2H4在不同环境水样中的回收率达到80-104％，结果表明荧光探针工作液能够在环境水样中定量的检测N2H4的存在。
实施例6
HeLa细胞内荧光成像
(1)用于HeLa细胞中N2H4检测时，用缓冲液配制成浓度20μM的工作液，所述缓冲液由体积比为1:1的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 和二甲基亚砜(DMSO)配制成，缓冲液的pH值为7.4；
(2)取a、b、c、d1、d2五组实验组；
a组为空白对照组：未经任何处理的HeLa细胞，为a组被检测物；b组为N2H4处理对照组：用浓度50μM的N2H4与HeLa细胞孵育20分钟，得到用于检测的b组被检测物；c组为荧光探针处理对照组：用浓度20 μM的荧光探针与HeLa细胞孵育20分钟，得到用于检测的c组被检测物；d1组为实验组1：用浓度20μM荧光探针预处理HeLa细胞的孔板20 分钟，然后与N2H4(50μΜ)一起孵育20分钟，得到用于检测的d1 组被检测物；d2组为实验组2：用浓度20μM荧光探针预处理HeLa细胞的孔板20分钟，然后与N2H4(100μΜ)一起孵育20分钟，得到用于检测的d2组被检测物；将上述a组被检测物、b组被检测物、c组被检测物、d1组被检测物和d2组被检测物分别放置在荧光显微镜下观察；
(3)荧光成像结果显示a组被检测物、b组被检测物和c组被检测物均未发现有荧光；而d1组和d2组被检测物显示出明显的绿色荧光，而且随着N2H4浓度的增加，荧光增强越明显(图6)；荧光成像结果表明所述荧光探针能够进入HeLa细胞并与外源性N2H4发生反应，产生强烈的绿色荧光，实现HeLa细胞中外源性N2H4的特异性检测。
实施例7
斑马鱼的荧光成像
(1)用于斑马鱼中外源N2H4检测时，用缓冲液配制成浓度30μM 的工作液，所述缓冲液由体积比为1:1的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 和二甲基亚砜(DMSO)配制成，缓冲液的pH值为7.4；
取a、b、c、d四组实验组
(2)a组为空白对照组：未经处理过的3日龄斑马鱼，得到用于检测的a组被检测物；
b组为荧光探针处理对照组：3日龄斑马鱼用10mL浓度30μM的所述荧光探针处理30分钟，得到用于检测的b组被检测物；
c组为N2H4处理对照组：用10mL浓度100μM的N2H4与发育正常的 3日龄斑马鱼孵育30分钟，得到用于检测的c组被检测物；
d组为实验组：3日龄斑马鱼用10mL浓度100μM的N2H4孵育30分钟，然后在使用30μM的所述荧光探针处理30分钟，得到用于检测的d 组被检测物；
(3)将a组被检测物、b组被检测物、c组被检测物和d组被检测物分别放置在荧光显微镜下观察；
(4)结果显示a组被检测物、b组被检测物和c组被检测物未发现有荧光；而d组被检测物显示出明显的绿荧光；荧光成像结果表明所述荧光探针能够进入斑马鱼体内并与外源性N2H4发生反应，产生强烈的绿色荧光，实现斑马鱼体内外源性N2H4的特异性检测(图7)。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求范围内。

Claims (7)

1.一种基于香豆素的新型N2H4荧光探针，其特征在于：所述荧光探针为2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯，其分子式为C13H11BrO4，化学结构式如式（І）所示：
Figure 182958DEST_PATH_IMAGE001
式（І）。
2.权利要求1所述的基于香豆素的新型N2H4荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下具体操作步骤：
步骤一：将7-羟基香豆素和三乙胺在二氯甲烷中充分混匀，获得混合液A；
步骤二：将步骤一中获得的混合液A通过冰浴将温度降至0℃；
步骤三：将4-溴丁酰氯用恒压滴液漏斗缓慢加入经过步骤二处理的溶液中，获得混合液B ；
步骤四：将步骤三获得的混合液B温度升至室温，并搅拌3小时，获得混合液C，其中，反应进度使用TLC板进行监测；
步骤五：将步骤四中的混合液C，减压浓缩获得粗产物，利用洗脱液通过层析柱法分离纯化得到探针2-氧代-2H-色烯-7-基4-溴丁酸酯；
所述洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，其对应比例为4:1。
3.权利要求1所述的基于香豆素的新型N2H4荧光探针的用途，其特征在于：用于N2H4的特异性检测。
4.根据权利要求1所述的基于香豆素的新型N2H4荧光探针用于溶液体系中N2H4的检测方法，其特征在于，包括以下具体操作步骤：
步骤1：将4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）按体积比为1:1配置成pH值为7.4的缓冲液，用制得的缓冲液将权利要求1所述的荧光探针配置成浓度为10μM的荧光探针工作液；
步骤2：取54份3.0 mL步骤1所得的荧光探针工作液，向其中分别加入200 μL待测分析物，待测分析物的浓度为5×10-5mol/L，其中，待测分析物共17种，每种待测分析物由3个平行单元，得到54份反应物，反应物中分析物最终浓度为200μM，反应完全后分别对54份反应物进行荧光强度测定；
步骤3：通过步骤2的荧光强度测定获得结果；结果表明，N2H4能够提高荧光探针荧光探针工作液荧光强度；该荧光探针仅仅可以与N2H4发生荧光增强反应，不受其他分析物的干扰，即所述荧光探针对N2H4的识别具有特异性和抗干扰性。
5.权利要求1所述的基于香豆素的新型N2H4荧光探针用于HeLa细胞中N2H4的检测方法，其特征在于，包括以下具体操作步骤：
步骤①：制备荧光探针工作液；将4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）按体积比为1:1配置成pH值为7.4的缓冲液，用制得的缓冲液将权利要求1所述的荧光探针配置成浓度为20μM的荧光探针工作液；
步骤②：制备多组被检测物，取a1、b1、c1、d1、e1五组实验；
a1组为空白对照组：未经任何处理的HeLa细胞，为a1组被检测物；
b1组为N2H4处理对照组：用浓度50μM的N2H4与HeLa细胞孵育20分钟，得到用于检测的b1组被检测物；
c1组为荧光探针处理对照组：用浓度20μM的荧光探针与HeLa细胞孵育20分钟，得到用于检测的c1组被检测物；
d1组为实验组1：用浓度为20μM的荧光探针工作液预处理HeLa细胞的孔板20分钟，然后与N2H4（50μΜ）一起孵育20分钟，得到用于检测的d1组被检测物；
e1组为实验组2：用浓度为20μM的荧光探针工作液预处理HeLa细胞的孔板20分钟，然后与N2H4（100μΜ）一起孵育20分钟，得到用于检测的e1组被检测物；
步骤③：利用荧光显微镜对比；将步骤②中的a1组被检测物、b1组被检测物、c1组被检测物、d1组被检测物和e1组被检测物分别放置在荧光显微镜下观察；
步骤④：获得结果：荧光成像结果显示a1组被检测物、b1组被检测物和c1组被检测物均未发现有荧光；而d1组和e1组被检测物显示出明显的绿色荧光，而且随着N2H4浓度的增加，荧光增强越明显；荧光成像结果表明权利要求1所述荧光探针能够进入HeLa细胞并与外源性N2H4发生反应，产生强烈的绿色荧光，实现HeLa细胞中外源性N2H4的特异性检测。
6.权利要求1所述的基于香豆素的新型N2H4荧光探针用于斑马鱼中外源N2H4的检测方法，其特征在于，包括以下具体操作步骤：
步骤Ⅰ：制备荧光探针工作液；将4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）按体积比为1:1配置成pH值为7.4的缓冲液，用制得的缓冲液将权利要求1所述的荧光探针配置成浓度为30μM的荧光探针工作液；
步骤Ⅱ：制备多组被检测物，取a2、b2、c2、d2四组实验；
a2组为空白对照组：未经处理过的3日龄斑马鱼，得到用于检测的a2组被检测物；
b2组为荧光探针处理对照组：取用10mL浓度为30μM的荧光探针工作液对3日龄斑马鱼处理30分钟，得到用于检测的b2组被检测物；
c2组为N2H4处理对照组：用10 mL，且浓度为100μM的N2H4与发育正常的3日龄斑马鱼孵育30分钟，得到用于检测的c2组被检测物；
d2组为实验组：将3日龄斑马鱼用10 mL，且浓度为100μM的N2H4孵育30分钟，处理完成后，再使用浓度为30μM的荧光探针工作液处理30分钟，得到用于检测的d2组被检测物；
步骤Ⅲ：利用荧光显微镜对比；将步骤Ⅱ中的a2组被检测物、b2组被检测物、c2组被检测物和d2组被检测物分别放置在荧光显微镜下观察；
步骤Ⅳ：获得结果；结果显示a2组被检测物、b2组被检测物和c2组被检测物未发现有荧光；而d2组被检测物显示出明显的绿荧光；荧光成像结果表明权利要求1所述荧光探针能够进入斑马鱼体内并与外源性N2H4发生反应，产生强烈的绿色荧光，实现斑马鱼体内外源性N2H4的特异性检测。
7.权利要求1所述的基于香豆素的新型N2H4荧光探针用于环境水样中N2H4的检测方法，其特征在于，包括以下具体操作步骤：
步骤➊：制备荧光探针工作液；将4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和二甲基亚砜（DMSO）按体积比为1:1配置成pH值为7.4的缓冲液，用制得的缓冲液将权利要求1所述的荧光探针配置成浓度为10μM的荧光探针工作液；
步骤➋：制备待测环境水样；采集不同区域的环境水样，并通过100μm水相滤膜过滤，得到处理后的环境水样；在处理后的环境水样中，添加浓度为0.1μM、0.5μM和1.0μM的N2H4，得到多组不同的环境水样；
步骤➌：荧光强度测定；向步骤➋的多组待测环境水样中分别添加步骤➊制得的荧光探针工作液，反应完全后，分别对不同环境水样反应物进行荧光强度测定；
步骤➍：获得结果；结果表明，N2H4的回收率达到80-104%，结果表明荧光探针工作液能够在环境水样中定量的检测N2H4的存在。
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