CN115210378A - 用于诱导对sars-cov-2特异性免疫的药剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学，描述了用于诱导针对SARS‑CoV‑2的特异性免疫的液体形式的试剂，其含有单一活性成分，包括人腺病毒血清型26的表达载体，其中E1和E3区缺失，ORF6‑Ad26区被ORF6‑Ad5替代，并具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的整合表达盒。在另一种变体中，试剂含有单一活性成分，包括人腺病毒血清型5的表达载体，其中E1和E3区缺失，并具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的整合表达盒。在另一种变体中，试剂含有单一活性成分，包括猿腺病毒血清型25的表达载体，其中E1和E3区缺失，并具有选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3的整合表达盒。

Description

用于诱导对sars-cov-2特异性免疫的药剂
技术领域
本发明涉及生物技术、免疫学和病毒学。要求保护的药剂可以用于预防由严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2引起的疾病。
背景技术
导致冠状病毒(COVID-19)的病原体是一种单链RNA病毒SARS-CoV-2，属于冠状病毒科，β-CoV谱系。
冠状病毒感染通过呼吸道飞沫、灰尘颗粒和接触在人与人之间传播。平均潜伏期为5至6天，然后出现疾病的初步症状。COVID-19的常见症状包括发热、干咳、呼吸短促和疲劳。据报道，喉咙痛、关节痛、流鼻涕和头痛也是不太常见的症状。然而，该疾病的临床病程的特征在于从无症状病例到严重急性呼吸综合征和死亡的严重程度不同。
SARS-CoV-2的快速地理传播和高死亡率已经导致迫切需要开发有效的药剂来预防由该病毒引起的疾病。因此，目前开发安全有效的SARS-CoV-2疫苗被公认为是全球的首要任务。
在大流行病爆发后的一年内，多家制药公司提出了他们的COVID-19候选疫苗变体。
辉瑞制药公司(Pfizer pharmaceutical company)与BioNTech生物公司合作开发了一种被称为BNT162b2(tozinameran)的疫苗。它基于修饰的mRNA编码包埋在脂质纳米颗粒中的SARS-CoV-2的突变S蛋白。疫苗接种方案需要间隔21天进行两次注射 (F.P.Polack等人《BNT162b2 mRNA2019新冠疫苗的安全性和有效性(Safety and Efficacy of theBNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine)》《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》2020； 383:2603-2615)。
Moderna制药公司和美国国家过敏和传染病研究所(NIAID)共同开发了mRNA-1273疫苗。其活性组分是编码包被在脂质壳中的SARS-CoV-2的突变S蛋白的mRNA。根据免疫方案，疫苗将分两剂接种，间隔28天进行接种(L.A.Jackson等人《抗SARS-CoV-2 的mRNA疫苗——初步报告(An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2—Preliminary Report)》《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》2020；383:1920-1931)。
牛津大学与阿斯利康(AstraZenecaplc)合作开发了一种病毒载体疫苗ChAdOx1nCoV-19(AZD1222)。其活性组分是编码SARS-CoV-2病毒(基因库MN908947)的密码子优化的全长S蛋白序列的黑猩猩腺病毒ChAdOx1，具有人类组织纤溶酶原激活物前导序列。根据免疫方案，疫苗将分两剂接种，间隔28天进行接种(M.Voysey等人《ChAdOx1 nCoV-19疫苗(AZD1222)抗SARS-CoV-2的安全性和有效性：巴西、南非和英国四个随机对照试验的中期分析》《柳叶刀杂志(The Lancet.)》第397卷，第10269 期，P99-111，2021)。
康希诺(CanSino)开发了一种基于表达SARS-CoV-2全长S糖蛋白的无法复制的人类5型腺病毒(Ad5)的抗COVID-19的病毒载体疫苗。它是一种单剂方案疫苗。 (GenBankYP_009724390)(Feng-Cai Zhu等人《重组5-型腺病毒载体COVID-19疫苗在 18岁或以上健康成人中的免疫原性和安全性：一项随机、双盲、安慰剂对照的2期试验》《柳叶刀杂志(TheLancet.)》第369卷，第10249期，P479-488，2020)。
强生公司(Johnson&Johnson)旗下的杨森制药公司(Janssen PharmaceuticalCompanies)的研究团队与贝斯以色列女执事医疗中心(Beth Israel DeaconessMedicalCenter)合作，使用杨森的
Figure GDA0003687684200000021
技术平台，已经开发了几种候选疫苗。基于安全性和有效性研究的结果，选择候选疫苗Ad26.COV2.S(Ad26COVS1)。该疫苗基于含有 SARS-CoV-2病毒S蛋白基因的重组E1/E3缺失的腺病毒血清型26载体，具有弗林蛋白酶切割位点的突变和两个稳定的脯氨酸突变。现在，对两种免疫方案进行了测试：疫苗以单次剂量或间隔8周的两次剂量进行接种(J.Sadoff等人《Ad26.COV2.S Covid-19疫苗的1-2a期试验的中期结果》《新英格兰医学杂志》，2021年1月13日。DOI：10.1056 /NEJMoa2034201)。
因此，应当指出，绝大多数COVID-19疫苗需要两次注射方案。
上述每种疫苗都有其优点和局限性。因此，mRNA疫苗的副作用较轻。然而，与病毒载体疫苗相比，它们的免疫原性较低。此外，RNA更脆弱且对储存条件敏感。
重组病毒载体疫苗具有高免疫原性。但是这类疫苗的缺点是可能诱导对载体部分的免疫应答，这使得再接种变得更加困难。另外，腺病毒在人群中传播，因此有些人可能对这些病毒具有预先存在的免疫力。基于其它哺乳动物腺病毒的表达载体被用于解决预先存在的免疫问题，但是此类载体进入人体细胞的能力较低，进而降低了疫苗的功效。
根据专利RF第2731342号(公开于2020年9月1日)，存在由要求保护的本发明的作者选择作为原型的技术方案。从本专利中可知，用于诱导对严重急性呼吸系统综合症病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药物制剂有以下变体：
-其含有组分1，包含基于重组人腺病毒血清型26基因组的表达载体形式的药剂，其中E1和E3区缺失且ORF6-Ad26区被ORF6-Ad5取代，整合表达盒选自SEQ ID NO:1、 SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3，并且其还含有组分2，包含基于重组人腺病毒血清型5基因组的表达载体形式的药剂，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3
-其含有组分1，包含基于重组人腺病毒血清型26基因组的表达载体形式的药剂，其中E1和E3区缺失且ORF6-Ad26区被ORF6-Ad5取代，整合表达盒选自SEQ ID NO:1、 SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3，并且其还含有组分2，包含基于重组猿腺病毒血清型25 基因组的表达载体形式的药剂，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3。
-其含有组分1，包含基于重组猿腺病毒血清型25基因组的表达载体形式的药剂，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，并且其还含有组分2，包含基于重组人腺病毒血清型5基因组的表达载体形式的药剂，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
此外，本专利公开了用于诱导对严重急性呼吸综合征SARS-CoV-2病毒的特异性免疫的药剂的上述变体的给药，其中组分1和组分2以有效量，以至少一周的时间间隔依次使用。
应当指出，这种给药方式有几个缺点。因此，例如，药物制剂的每种组分都可能引起副作用和过敏反应；因此，在使用两针接种疫苗方案的情况下，这种事件的数量将增加。此外，这种免疫方案与多个实际困难相关，因为必须确保患者在一定时间间隔后进行第二次接种。另外，还有许多与及时递送必要的药剂组分有关的后勤挑战。
因此，本发明的领域需要扩大能够在广大群体中诱导针对SARS-CoV-2病毒的免疫应答的药剂的范围。
所要求保护的一组发明的技术目的是创造含有单一活性组分的药剂，并且与此同时确保在广大群体中有效诱导针对SARS-CoV-2病毒的免疫应答。
发明内容
技术问题的解决方案是一种用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的液体形式的药剂的变体，其含有作为单一活性组分的基于人腺病毒血清型26的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失且ORF6-Ad26区被ORF6-Ad5取代，整合表达盒选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
此外，还创造了一种用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的液体形式的药剂的变体，其含有作为单一活性组分的基于人腺病毒血清型5的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、 SEQID NO:3。
此外，本发明还要求保护一种用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的液体形式的药剂的变体，其含有作为单一活性组分的基于猿腺病毒血清型25的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO:4、 SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3。
在那种情况下，对于实施的特定情况，液体形式的药剂的缓冲溶液含有以下质量％：
Figure GDA0003687684200000041
每种药剂变体都用于诱导对严重急性呼吸综合征SARS-CoV-2病毒的特异性免疫。
因此，该药剂用于鼻内或肌内给药。此外，该药剂可以经由鼻内和肌内途径伴随和同时给药。
在那种情况下，对于实施的特定情况，药剂以5*1010至5*1011病毒颗粒的剂量经由鼻内途径给药，或以5*1010至5*1011病毒颗粒的剂量经由肌内途径给药。而对于经由鼻内和肌内途径的伴随给药的情况，肌内给药5*1010至5*1011病毒颗粒的剂量，并且鼻内给药5*1010至5*1011病毒颗粒的剂量。
伴随给药设想在单一疫苗接种程序中鼻内和肌内给药。
技术结果是产生一种确保在广大群体中产生针对SARS-Cov-2病毒的体液和细胞介导的免疫应答的药剂。
免疫的主要目的是确保对病原体的有效和持久的保护。实现该目标的方法之一是使用多剂量疫苗系列。当人体第一次接触到疫苗抗原时，适应性免疫应答的两个主要组分，即B淋巴细胞和效应T淋巴细胞发生活化。活化后，B淋巴细胞转化为负责抗体产生的浆细胞，并且还转化为记忆B细胞。效应T淋巴细胞分为两个主要类型：辅助T细胞 (CD4+)和细胞毒性(杀伤)T细胞(CD8+)。辅助T细胞的关键功能是促进体液和细胞免疫应答的发展。细胞毒性T细胞的主要功能是杀死宿主的受损的细胞。杀伤T细胞被认为是抗病毒免疫应答的主要组分之一。然而，在免疫接种后，抗原特异性免疫细胞的数量随着时间的推移而减少，并且因此给药加强剂量的疫苗。后者使得免疫系统能够维持适当数量的抗原特异性T细胞和B细胞(确保身体免受病原体侵害所需)。
开发在单次免疫方案后诱导可持续免疫应答的单组分药剂是一项复杂的研究和实践任务。然而，难以高估这种发展的重要性。单剂量的疫苗给药可以促进更高的大规模免疫接种率，这在大流行病的条件下至关重要。此外，该药剂可有益于流动人群(移民部落等)的紧急使用和免疫接种。此外，值得注意的是，单剂量药剂的给药与人类中较少的不良事件相关，如损伤率和副作用和过敏反应的数量。
附图说明
图1
绘示了在用根据变体1的液体形式的所开发的药剂进行免疫的志愿者中评估对SARS-CoV-2病毒抗原的体液免疫应答的结果，
Y轴——抗SARS-CoV-2的S糖蛋白的RBD的IgG滴度。
X轴——天数。
○参与研究的每个志愿者在第14天时对SARS-CoV-2的S糖蛋白的RBD的IgG 滴度
□参与研究的每个志愿者在第21天时对SARS-CoV-2的S糖蛋白的RBD的IgG 滴度
△参与研究的每个志愿者在第28天时对SARS-CoV-2的S糖蛋白的RBD的IgG 滴度
对于每个数据组，抗体滴度的几何平均值用黑线表示。第14天、第21天和第28 天的值之间的统计学显著差异由括号示出，括号上方指示Wilcoxon T检验的p值。
图2
绘示了在用根据变体2的液体形式的所开发的药剂进行免疫的志愿者中评估对SARS-CoV-2病毒抗原的体液免疫应答的结果，
Y轴——抗SARS-CoV-2的S糖蛋白的RBD的IgG滴度。
X轴——天数。
○参与研究的每个志愿者在第14天时对SARS-CoV-2的S糖蛋白的RBD的IgG 滴度
□参与研究的每个志愿者在第21天时对SARS-CoV-2的S糖蛋白的RBD的IgG 滴度
△参与研究的每个志愿者在第28天时对SARS-CoV-2的S糖蛋白的RBD的IgG 滴度
对于每个数据组，抗体滴度的几何平均值用黑线表示。第14天、第21天和第28 天的值之间的统计学显著差异由括号示出，括号上方指示Wilcoxon T检验的p值。
图3绘示了在接受根据变体1的液体形式的所开发药剂的志愿者中评估免疫效力的结果，如通过SARS-CoV-2的S抗原再刺激的增殖CD8+(A)和CD4+(B)淋巴细胞的百分比所估计的。
Y轴——增殖细胞的数量，％
X轴——天数。
Figure GDA0003687684200000061
-用于表示每个志愿者在第0天时增殖的CD8+的百分比的符号。
Figure GDA0003687684200000062
-用于表示每个志愿者在第14天时增殖的CD8+的百分比的符号。
Figure GDA0003687684200000063
-用于表示每个志愿者在第28天时增殖的CD8+的百分比的符号。
Figure GDA0003687684200000064
-用于表示每个志愿者在第0天时增殖的CD4+的百分比的符号。
Figure GDA0003687684200000065
-用于表示每个志愿者在第14天时增殖的CD4+的百分比的符号。
Figure GDA0003687684200000066
-用于表示每个志愿者在第28天时增殖的CD4+的百分比的符号。
对于每个数据组，中值用黑线表示。在第0天、第14天和第28天获得的数值之间的统计学差异用括号和符号*表示，p<0.05；**，p<0.01；****，p<0.001(曼-惠特尼检验)。
图4绘示了在接受根据变体2的液体形式的所开发药剂的志愿者中评估免疫效力的结果，如通过SARS-CoV-2的S抗原再刺激的增殖CD8+(A)和CD4+(B)淋巴细胞的百分比所估计的。
Y轴——增殖细胞的数量，％
X轴——天数。
Figure GDA0003687684200000067
-用于表示每个志愿者在第0天时增殖的CD8+的百分比的符号。
Figure GDA0003687684200000068
-用于表示每个志愿者在第14天时增殖的CD8+的百分比的符号。
Figure GDA0003687684200000069
-用于表示每个志愿者在第28天时增殖的CD8+的百分比的符号。
Figure GDA00036876842000000610
-用于表示每个志愿者在第0天时增殖的CD4+的百分比的符号。
Figure GDA00036876842000000611
-用于表示每个志愿者在第14天时增殖的CD4+的百分比的符号。
Figure GDA00036876842000000612
-用于表示每个志愿者在第28天时增殖的CD4+的百分比的符号。
对于每个数据组，中值用黑线表示。在第0天、第14天和第28天获得的数值之间的统计学差异用括号和符号*表示，p<0.05；**，p<0.01；****，p<0.001(曼-惠特尼检验)。
具体实施方式
所开发的药剂的活性组分包含基于重组腺病毒株基因组的表达载体，其整合表达盒含有SARS-CoV-2抗原基因。
腺病毒载体可以进入许多不同的人类细胞类型，确保高水平的靶抗原表达，并且辅助避开体液和细胞介导的免疫应答。俄罗斯联邦卫生部的FSBI“N.F.Gamaleya NRCEM”开发了以下3种基于哺乳动物腺病毒的表达载体变体：
-基于人类腺病毒血清型26重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失，并且ORF6-Ad26区被ORF6-Ad5取代
-基于人类腺病毒血清型5重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失
-基于猿腺病毒血清型25重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
选择SARS-CoV-2病毒表面S蛋白作为抗原。它是最有前途的能够诱导强烈和持久的免疫应答的抗原之一。还证明抗SARS-CoV-2的S蛋白的抗体具有病毒中和活性。
为了最大限度地诱导免疫应答，作者开发了含有S蛋白基因的表达盒的多种变体。
表达盒SEQ ID NO:1含有CMV启动子、SARS-CoV-2病毒S蛋白基因和聚腺苷酸化信号。CMV启动子是巨细胞病毒的立即早期基因的启动子，其确保在多种细胞类型中组成型表达。然而，由CMV启动子控制的靶基因表达强度因不同的细胞类型而变化。此外，在CMV启动子控制下的转基因表达的水平显示随着细胞培养的持续时间的增加而下降。它是由于与DNA甲基化相关的基因表达受到抑制而发生的[Wang W.,Jia YL.,Li YC.,Jing CQ.,GuoX.,Shang XF.,Zhao CP.,Wang TY.《不同启动子、启动子突变和增强子对CHO细胞中重组蛋白表达的影响(Impact of different promoters,promoter mutation, and an enhanceron recombinant protein expression in CHO cells)》//科学报告-2017。－第 8卷。－P.10416]
表达盒SEQ ID NO:2含有CAG启动子、SARS-CoV-2病毒S蛋白基因和聚腺苷酸化信号。CAG启动子是一种合成启动子，其含有CMV启动子的早期增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和嵌合内含子(鸡β-肌动蛋白和兔β-珠蛋白)。实验证明，CAG启动子与 CMV启动子相比具有更高的转录活性[Yang C.Q.,Li X.Y.,Li Q.,Fu S.L.,Li H.,Guo Z.K., Lin J.T.,ZhaoS.T.《通过使用体内电穿孔评估在发育中的鸡胚中驱动基因表达的三种不同启动子(Evaluation of three different promoters driving gene expression indeveloping chicken embryo by using in vivo electroporation)》//《遗传学和分子研究(Genet.Mol.Res.)》 -2014。－第13卷。－P.1270-1277]。
表达盒SEQ ID NO:3含有EF1启动子、SARS-CoV-2病毒S蛋白基因和聚腺苷酸化信号。EF1启动子是人真核翻译延伸因子1α(EF-1α)的启动子。启动子在多种细胞类型中是组成型活性的[Wang X,Xu Z,Tian Z,Zhang X,Xu D,Li Q,Zhang J,Wang T. 《EF-1α启动子在转染的CHO-K1细胞中维持来自游离型载体的高水平转基因表达(The EF-1αpromotermaintains high-level transgene expression from episomal vectors intransfected CHO-K1 cells)》《细胞与分子医学杂志(J Cell Mol Med.)》2017年11月； 21(11):3044-3054.doi:10.1111/jcmm.13216。Epub 2017年5月30日。PMID：28557288；PMCID：PMC5661254.]。EF-1α基因编码延伸因子1α，其是真核细胞中最常见的蛋白之一，并且几乎在所有哺乳动物细胞类型中显示出表达。EF-1α启动子经常在其中病毒启动子不能促进受控基因的表达的细胞中和在其中病毒启动子逐渐被消灭的细胞中显示其活性。
表达盒SEQ ID NO:4含有CMV启动子、SARS-CoV-2病毒S蛋白基因和聚腺苷酸化信号。
因此，作为完成任务的结果，开发了以下3种药剂变体。
1)一种用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂，呈液体形式，其含有单一活性组分，包含基于人腺病毒血清型26的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失且ORF6-Ad26区被ORF6-Ad5取代，整合表达盒选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3
2)一种用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂，呈液体形式，其含有单一活性组分，包含基于人腺病毒血清型5的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
3)一种用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂，呈液体形式，其含有单一活性组分，包含基于猿腺病毒血清型25的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
本发明的实现方式由以下实例证明：
实例1.基于人腺病毒血清型26的重组株基因组生产用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂的活性组分。
在第一阶段，设计了以下3种表达盒变体：
-表达盒SEQ ID NO:1含有CMV启动子、SARS-CoV-2病毒S蛋白基因和聚腺苷酸化信号；
-表达盒SEQ ID NO:2含有CAG启动子、SARS-CoV-2病毒S蛋白基因和聚腺苷酸化信号；
-表达盒SEQ ID NO:3含有EF1启动子、SARS-CoV-2病毒S蛋白基因和聚腺苷酸化信号。
SARS-CoV-2病毒S蛋白基因的合成由“Eurogen”ZAO公司(莫斯科)进行。
为了获得人腺病毒血清型26的重组株，使用了俄罗斯联邦卫生部的FSBI“N.F.GamaleyaNRCEM”生产的以下两种质粒：携带人腺病毒血清型26基因组同源臂的质粒pAd26-Ends，以及携带重组人腺病毒血清型26基因组的质粒pAd26-too，其中含有人腺病毒血清型5的开放阅读框ORF6，并缺失了E1和E3区。
在工作的第一阶段，使用基因工程技术基于质粒pAd26-Ends获得质粒 pAd26-Ends-CMV-S-CoV2、pAd26-Ends-CAG-S-CoV2、pAd26-Ends-EF1-S-CoV2，其分别含有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的表达盒，以及携带人腺病毒血清型 26的基因组的同源臂。然后，通过独特的水解位点将获得的质粒线性化，并将每种质粒与重组载体pAd26-too混合。作为同源重组的结果，产生了携带重组人腺病毒血清型26 的基因组的质粒pAd26-too-CMV-S-CoV2、pAd26-too-CAG-S-CoV2、 pAd26-too-EF1-S-CoV2，具有人腺病毒血清型5的开放阅读框ORF6和E1和E3区的缺失，分别具有表达盒SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQID NO:3。
在下一阶段，用特异性限制性内切酶水解质粒pAd26-too-CMV-S-CoV2、 pAd26-too-CAG-S-CoV2、pAd26-too-EF1-S-CoV2以去除载体部分。所得DNA产物用于НЕК293细胞培养物的转染。
作为完成工作的结果，获得以下人腺病毒血清型26的重组株：Ad26-too-CMV-S-CoV2、Ad26-too-CAG-S-CoV2、Ad26-too-EF1-S-CoV2。使用类似的方案生产人腺病毒血清型26的对照株：Ad26-too，其不含SARS-CoV-2S蛋白基因。
由此获得含有重组人腺病毒血清型26基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失且ORF6-Ad26区被ORF6-Ad5取代，整合表达盒选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；表达载体是所开发药剂的活性组分。
实例2.基于人腺病毒血清型5的重组株基因组生产用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂的活性组分。
在这项研究中还使用了表达盒的三种变体：
-表达盒SEQ ID NO:1含有CMV启动子、SARS-CoV-2病毒S蛋白基因和聚腺苷酸化信号；
-表达盒SEQ ID NO:2含有CAG启动子、SARS-CoV-2病毒S蛋白基因和聚腺苷酸化信号；
-表达盒SEQ ID NO:3含有EF1启动子、SARS-CoV-2病毒S蛋白基因和聚腺苷酸化信号。
SARS-CoV-2病毒S蛋白基因的合成由“Eurogen”ZAO公司(莫斯科)进行。
为了获得人腺病毒血清型5的重组株，使用了在俄罗斯联邦卫生部的FSBI“N.F.GamaleyaNRCEM”中生产的以下两种质粒：
-携带腺病毒血清型5基因组同源臂的质粒pAd5-Ends(其中一个同源臂是人腺病毒血清型5基因组的起始部分(从左侧反向末端重复到E1区)和包括pIX蛋白的病毒基因组序列。另一个同源臂含有位于ORF3Е4区之后直到基因组末端的核苷酸序列)
-携带重组人腺病毒血清型5基因组的质粒pAd5-too，其中E1和E3区缺失。
在工作的第一阶段，使用基因工程技术基于质粒pAd5-Ends获得质粒 pAd5-Ends-CMV-S-CoV2、pAd5-Ends-CAG-S-CoV2、pAd5-Ends-EF1-S-CoV2。所生产的质粒分别含有表达盒SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2илиSEQ ID NO:3，以及携带腺病毒血清型5的基因组的同源臂。然后，通过独特的水解位点将获得的质粒线性化，并将每种质粒与重组载体pAd5－too混合。作为同源重组的结果，产生了携带重组人腺病毒血清型5的基因组的质粒pAd5-too-CMV-S-CoV2、pAd5-too-CAG-S-CoV2、 pAd5-too-EF1-S-CoV2，其中E1和E3区缺失，分别具有表达盒SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
在下一阶段，用特异性限制性内切酶水解质粒pAd5-too-CMV-S-CoV2、 pAd5-too-CAG-S-CoV2、pAd5-too-EF1-S-CoV2以去除载体部分。所得DNA产物用于НЕК293细胞培养物的转染。
作为完成工作的结果，获得以下人腺病毒血清型5的重组株：Ad5-too-CMV-S-CoV2、 Ad5-too-CAG-S-CoV2、Ad5-too-EF1-S-CoV2。使用类似的方案生产人腺病毒血清型5的对照株：Ad5-too，其不含SARS-CoV-2S蛋白基因。
由此获得含有重组人腺病毒血清型5基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；表达载体是所开发药剂的活性组分。
实例3.基于猿腺病毒血清型25重组株的基因组生产用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂的活性组分。
在这项研究中使用了表达盒的以下三种变体：
--表达盒SEQ ID NO:4含有CMV启动子、SARS-CoV-2病毒S蛋白基因和聚腺苷酸化信号；
-表达盒SEQ ID NO:2含有CAG启动子、SARS-CoV-2病毒S蛋白基因和聚腺苷酸化信号；
-表达盒SEQ ID NO:3含有EF1启动子、SARS-CoV-2病毒S蛋白基因和聚腺苷酸化信号。
SARS-CoV-2病毒S蛋白基因的合成由“Eurogen”ZAO公司(莫斯科)进行。
为了获得猿腺病毒血清型25的重组株，使用了俄罗斯联邦卫生部的FSBI“N.F.GamaleyaNRCEM”中生产的以下两种质粒：
-携带猿腺病毒血清型25基因组的同源臂的质粒pSim25-Ends
-携带具有E1和E3区缺失的重组猿腺病毒血清型25的基因组的质粒 pSim25-null。
在工作的第一阶段，使用基因工程技术基于pSim25-Ends获得质粒 p-Sim25-Ends-CMV-S-CoV2、p-Sim25-Ends-CAG-S-CoV2、p-Sim25-Ends-EF1-S-CoV2。所生产的质粒分别含有表达盒SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3，以及携带猿腺病毒血清型25的基因组的同源臂。然后，通过独特的水解位点将获得的质粒线性化，并将每种质粒与重组载体pSim25-too混合。作为同源重组的结果，产生了携带重组猿腺病毒血清型25的基因组的质粒pSim25-too-CMV-S-CoV2、 pSim25-too-CAG-S-CoV2、pSim25-too-EF1-S-CoV2，其中E1和E3区缺失，分别具有表达盒SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
在下一阶段，用特异性限制性内切酶水解质粒pSim25-too-CMV-S-CoV2、 pSim25-too-CAG-S-CoV2、pSim25-too-EF1-S-CoV2以去除载体部分。所得DNA产物用于НЕК293细胞培养物的转染。
作为完成工作的结果，获得猿腺病毒血清型25的以下重组株： simAd25-too-CMV-S-CoV2、simAd25-too-CAG-S-CoV2、simAd25-too-EF1-S-CoV2。使用类似的方案生产猿腺病毒血清型25的对照株：simAd25-too，其不含SARS-CoV-2S蛋白基因。
由此获得含有猿腺病毒血清型25重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；表达载体是所开发药剂的活性组分。
实例4.缓冲溶液的开发
本发明人选择了确保重组腺病毒颗粒稳定性的水基缓冲溶液。将三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)添加到缓冲溶液中以维持溶液的pH值。为了达到必要的离子力和渗透压，需要添加氯化钠。添加蔗糖作为冷冻保护剂。添加氯化镁六水合物作为二价阳离子源；EDTA——作为自由基氧化的抑制剂；聚山梨酯-80——作为表面活性剂的来源；乙醇 95％——作为自由基氧化的抑制剂。
为了估计液体形式的药剂的缓冲溶液组成中所包含的物质的浓度，产生了几个变体的实验组(表1)。将药剂中的一种活性组分添加到所生产的每一种缓冲溶液中：
1.基于人腺病毒血清型26重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失且 ORF6-Ad26区被ORF6-Ad5取代，具有整合表达盒SEQ ID NO:1(Ad26-CMV-S-CoV2， 1*1011病毒颗粒))。
2.基于人腺病毒血清型5重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失，具有整合表达盒SEQ ID NO:1(Ad5-CMV-S-CoV2，1*1011病毒颗粒)
3.基于猿腺病毒血清型25重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失，具有整合表达盒SEQ ID NO:4(simAd25-CMV-S-CoV2，1*1011病毒颗粒)。
将获得的药剂在18℃和-70℃的温度下储存3个月，然后解冻，并评估重组腺病毒的滴度变化。
表1——液体形式的药剂的实验缓冲溶液的组成
表1.
Figure GDA0003687684200000121
所进行的实验结果表明，重组腺病毒的滴度在-18℃和-70℃的温度下在液体形式药剂的缓冲溶液中储存3个月后没有变化。
因此，所开发的用于液体形式的药剂的缓冲溶液确保所开发的药剂的所有组分在以下活性部分范围(质量％)内的稳定性：
Tris：0.1831质量％至0.3432质量％；
氯化钠：0.3313质量％至0.6212质量％；
蔗糖：3.7821质量％至7.0915质量％；
氯化镁六水合物：0.0154质量％至0.0289质量％；
EDTA：0.0029质量％至0.0054质量％；
聚山梨酯-80：0.0378质量％至0.0709质量％；
乙醇95％：0.0004质量％至0.0007质量％；
溶剂：剩余部分。
实例5.用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的液体形式的药剂的生产。
根据变体1开发的用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的液体形式的药剂在缓冲溶液中含有基于人腺病毒血清型26的重组株基因组的表达载体，整合表达盒选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
根据变体2开发的用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的液体形式的药剂在缓冲溶液中含有基于人腺病毒血清型5的重组株基因组的表达载体，整合表达盒选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
根据变体3开发的用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的液体形式的药剂在缓冲溶液中含有基于猿腺病毒血清型25的重组株基因组的表达载体，整合表达盒选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
在制造过程中，活性组分与缓冲溶液的组分混合。无菌小瓶用于填充药剂。储存在温度不超过“零下”18°С的避光处。在使用前，应从冷藏室中取出并保持在室温下(直至完全解冻)，不超过30分钟；在给药前，应轻轻摇动小瓶(安瓿)混合。不要剧烈摇动小瓶。请勿重新冻结。
实例6.所开发的药剂对小鼠单剂量静脉内和肌内给药后的毒性(急性毒性)
本研究旨在评估以下产品的急性毒性：
-用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂，呈液体形式，其含有单一活性组分，包含基于人腺病毒血清型26的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失且ORF6-Ad26区被ORF6-Ad5取代，整合表达盒选自SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
-用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂，呈液体形式，其含有单一活性组分，包含基于人腺病毒血清型5的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3
-用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂，呈液体形式，其含有单一活性组分，包含基于猿腺病毒血清型25的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
在本研究中使用6至8周龄、体重为18至20g的远交雄性和雌性小鼠。
药剂剂量的计算基于免疫剂量(108v.p.)，这是在使用易感动物物种——叙利亚金仓鼠的初步实验中发现的。根据小鼠的体重计算小鼠的剂量。小鼠毒理学研究选择的最小剂量为108v.p.，这是最接近治疗剂量的剂量。种间比例因子不用于剂量转换；根据世卫组织疫苗制备指南，直接根据体重重新计算剂量。
因此，在本实验中选择以下剂量对小鼠给药。
108v.p.——接近用于小鼠的有效剂量(ED)；
109v.p.——高20倍的小鼠ED；
1010v.p.——高200倍的小鼠ED；
1011v.p.——高2000倍的小鼠ED；
因此，形成以下实验动物组：
1)Ad26-too-CMV-S-CoV2，1*108v.p.，20只小鼠；
2)Ad26-too-CMV-S-CoV2，1*109v.p.，20只小鼠；
3)Ad26-too-CMV-S-CoV2，1*1010v.p.，20只小鼠；
4)Ad26-too-CMV-S-CoV2，1*1011v.p.，20只小鼠；
5)Ad5-too-CMV-S-CoV2，1*108v.p.，20只小鼠；
6)Ad5-too-CMV-S-CoV2，1*109v.p.，20只小鼠；
7)Ad5-too-CMV-S-CoV2，1*1010v.p.，20只小鼠；
8)Ad5-too-CMV-S-CoV2，1*1011v.p.，20只小鼠；
9)simAd25-too-CMV-S-CoV2，1*108вv.p.，20只小鼠；
10)simAd25-too-CMV-S-CoV2，1*109v.p.，20只小鼠；
11)simAd25-too-CMV-S-CoV2，1*1010v.p.，20只小鼠；
12)simAd25-too-CMV-S-CoV2，1*1011v.p.，20只小鼠；
13)安慰剂(缓冲溶液)，20只小鼠。
每天对每只动物进行体格检查，持续14天，以记录中毒迹象和死亡动物的数量。
记录实验动物功能状态的以下参数：活动、活动能力、外观、毛发、眼睛、耳朵、牙齿和肢体的状况。评估的生理功能包括呼吸、唾液分泌、唾液、尿液、排泄物。
所有动物在实验期间存活。所有组的动物看起来都很健康，积极进食饲料，对刺激有足够的反应，并显示出他们对探索环境的兴趣。毛层浓密、匀亮、贴身；未发现脱发或脆性。肌张力没有高渗的特征。外耳没有结痂、炎症迹象或抽搐。牙齿颜色正常，牙齿没有断裂。小鼠营养良好，没有营养不良。腹部区域未扩大。呼吸平稳，无困难。唾液分泌正常。排尿、尿色、胃肠系统参数、肌肉紧张和反射在正常生理范围内。实验动物的行为与对照组的动物行为没有区别。
在实验的第14天，通过颈脱位对小鼠进行预定的安乐死。在研究过程中，没有发现动物处于具有不可避免死亡迹象的临界状态。此外，未报告动物死亡。
对所有动物进行完全尸检。尸检包括评估动物的身体状况、内表面和管道、颅内、胸腔、腹腔和盆腔(包括这些腔的内部器官和组织)、颈部及其器官和组织以及骨骼肌系统。
大体尸检未发现药剂对小鼠内脏器官有任何影响。未发现对照组和实验组动物之间的差异。动物的对照组和实验组之间的体重增加没有差异。
实例7.
基于体液免疫应答评估的用所开发的药剂的免疫功效的评估
免疫功效的关键特征之一是抗体滴度。该实例得出了关于在向实验动物给药后第21 天抗SARS-CoV-2S蛋白的抗体滴度变化的数据。
实验中使用了哺乳动物物种-BALB/c小鼠，体重为18g的雌性小鼠。将所有动物分成13组，每组5只动物，以5*1010病毒颗粒/200μl的剂量对其进行肌肉注射所开发的液体形式的药剂的变体。
形成以下动物组：
1)Ad26-too-CMV-S-CoV2，
2)Ad26-too-CAG-S-CoV2，
3)Ad26-too-EF1-S-CoV2
4)Ad26-too
5)Ad5-too-CMV-S-CoV2，
6)Ad5-too-CAG-S-CoV2，
7)Ad5-too-EF1-S-CoV2
8)Ad5-too
9)simAd25-too-CMV-S-CoV2，
10)simAd25-too-CAG-S-CoV2，
11)simAd25-too-EF1-S-CoV2
12)simAd25-too
13)安慰剂(缓冲剂)
三周后，从动物的尾静脉取血样，分离血清。根据以下方案使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量抗体滴度：
1)在+4℃的温度下将抗原吸附到96孔ELISA板的孔上持续16小时。
2)然后，为了防止非特异性结合，用溶解在阻断非特异性信号缓冲溶液中的5％牛奶以每孔100μl的量“阻断”板。将其在37℃的振荡器中温育一小时。
3)将来自免疫小鼠的血清样品稀释100倍，然后制备两倍稀释系列。总共制备了每种样品的12个稀释液。
4)将各50μl稀释血清样品添加到板孔中。
5)然后，在37℃下温育1小时。
6)温育后，将孔用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次。
7)然后，添加抗与辣根过氧化物酶偶联的小鼠免疫球蛋白的第二抗体。
8)接着，在37℃下温育1小时。
9)温育后，将孔用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次。
10)然后，添加四甲基联苯胺(TMB)溶液，其用作辣根过氧化物酶的底物并通过反应转化为有色化合物。15分钟后，通过添加硫酸停止反应。接着，使用分光光度计，在450nm波长下在每个孔中测量溶液的光密度(OD)。
抗体滴度定义为溶液光密度显著高于阴性对照组的最后稀释度。获得的结果(几何平均值)在表2中呈现。
表2——小鼠血清中抗SARS-CoV-2S蛋白的抗体滴度(抗体滴度的几何平均值)
Figure GDA0003687684200000161
Figure GDA0003687684200000171
因此，实验结果表明，所有开发的药剂都能诱导对SARS-CoV-2的体液免疫应答。
实例8.通过评估疫苗接种后不同时间段志愿者血液中对SARS-CoV-2病毒抗原的体液免疫应答来评估所开发的药剂的免疫原性
本实验的目的是确定志愿者在接种不同变体的疫苗后，在不同时间段对 SARS-CoV-2病毒抗原的免疫应答强度。
试验中包括18至60岁的健康志愿者。将试验的所有参与者分成几组。
1)用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂，呈液体形式，其含有单一活性组分，包含基于人腺病毒血清型26的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失且ORF6-Ad26区被ORF6-Ad5取代，整合表达盒选自SEQ ID NO:1，1011病毒颗粒/剂量，9个个体。
2)用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂，呈液体形式，其含有单一活性组分，包含基于人腺病毒血清型5的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失且ORF6-Ad26区被ORF6-Ad5取代，整合表达盒选自SEQ ID NO:1， 1011病毒颗粒/剂量，9个个体。
志愿者经由单剂量肌内给药相关药物进行免疫接种。
在免疫前和第14天、第21天、第28天和第42天从受试者收集血样。从获得的血样中分离血清并用于测定抗SARS-CoV-2病毒S抗原的抗体滴度。
使用俄罗斯联邦卫生部的FSBI“N.F.Gamaleya NRCEM”(RZN 2020/10393 2020-05-18)中开发的检测试剂盒测定抗体滴度，用于测定抗SARS-CoV-2病毒S蛋白 RBD的IgG滴度。
将具有初步吸附的RBD(100ng/孔)的板在洗涤缓冲溶液中洗涤5次。接着，将阳性对照(100μl)和阴性对照(100μl)一式两份添加到板孔中。将一系列研究样品的两倍稀释液(每个样品两份)添加剩余的板孔中。将该板用膜密封并在+37℃下温育1小时，同时以300rpm的速度搅拌。然后，用洗涤缓冲溶液的工作溶液洗涤孔5次。接下来，将100μl的单克隆抗体缀合物的工作溶液添加到每个孔中，用粘附膜封闭板并在+37℃下温育1小时，同时以300rpm的速度搅拌。然后，用洗涤缓冲溶液的工作溶液洗涤孔5次。然后，将100μl的显色底物添加到每个孔中并在+20℃的暗处温育15分钟。在该步骤之后，通过每孔添加50μl终止试剂(1M硫酸溶液)来终止反应。通过在分光光度计上在450nm的波长下测量光密度，在停止反应后10分钟内记录结果。
IgG滴度定义为最大血清稀释度，其中免疫受试者的血清中的OD450值比对照血清(免疫前受试者的血清)中的值高两倍。
图1、2示出了给药所开发药剂的不同变体后志愿者血清中抗SARS-CoV-2抗原的抗体滴度的评估结果。
研究结果表明，用所开发制剂的两种变体对志愿者进行免疫，可以获得强大的(与对照组、非免疫组志愿者的数值相比有统计学上的显著差异)体液免疫力，其特点是对SARS-CoV-2病毒S蛋白的抗体滴度增加。因此，随着时间的推移，体液免疫应答的强度随着免疫日期的延长而不断增强。
实例9.通过评估疫苗接种后不同时间段志愿者血液中对SARS-CoV-2病毒抗原的细胞介导免疫应答来评估所开发的药剂的免疫原性
本实验的目的是确定志愿者在用所开发的不同变体免疫后血液中对SARS-CoV-2病毒抗原的免疫应答强度。
试验中包括18至60岁的健康志愿者。将试验的所有参与者分成几组。
1)用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂，呈液体形式，其含有单一活性组分，包含基于人腺病毒血清型26的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失且ORF6-Ad26区被ORF6-Ad5取代，整合表达盒选自SEQ ID NO:1，1011病毒颗粒/剂量，9个个体。
2)用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂，呈液体形式，其含有单一活性组分，包含基于人腺病毒血清型5的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失且ORF6-Ad26区域被ORF6-Ad5取代，整合表达盒选自SEQ ID NO:1，1011病毒颗粒/剂量，9个个体。
志愿者经由单剂量肌内给药相关药物进行免疫接种。
在免疫前和免疫后第14天和第28天，从受试者收集血样；通过在Ficoll溶液(1.077 g/mL；PanEco)中的密度梯度离心从样品中分离出单核细胞。然后，将分离的细胞用荧光染料CFSE(美国Invivogen)染色并置于96孔板的孔中(2*105细胞/孔)。作为下一步骤，通过向培养基中添加冠状病毒S蛋白(最终蛋白浓度－1μg/ml)，在体外重新刺激淋巴细胞。没有添加抗原的完整细胞被用作阴性对照。在添加抗原72小时后测定增殖细胞的百分比，对培养基取样测定γ-干扰素。
为了测定增殖细胞的％，使用针对T淋巴细胞CD3、CD4、CD8(抗CD3 Pe-Cy7 (BDBiosciences，克隆SK7)、抗CD4 APC(BD Biosciences，克隆SK3)、抗CD8 PerCP-Cy5.5(BDBiosciences，克隆SK1))的标记物分子的抗体对它们进行染色。使用高性能细胞荧光计BDFACS AriaIII(美国BD生物科学)测定细胞混合物中的增殖细胞 (使用较少量的CFSE染料)CD4+和CD8+T淋巴细胞。通过从由冠状病毒S抗原重新刺激的细胞的分析中获得的结果中减去在完整细胞的分析中获得的结果，来测定每份样本中增殖细胞的所得百分比。结果如图3和4所示。
所进行的研究结果表明，用不同变体的药剂免疫志愿者所诱导的细胞介导的免疫强度(基于增殖的CD4+和CD8+Т淋巴细胞的中位数)随着免疫日期的推移而增加。在所有组中，在免疫后第28天记录增殖的CD4+和CD8+T淋巴细胞的峰值。在研究的第0 天和第28天的值之间，报告了增殖CD4+和CD8+Т淋巴细胞值的最大统计学显著差异， p<0.001。
因此，基于上述发现，可以得出结论，用开发的药剂进行免疫能够诱导形成强烈的抗原特异性细胞介导的抗感染免疫，这可以通过免疫前和免疫后的测量参数的高度统计学意义来证明。
实例10.评估志愿者在使用所开发制剂的变体进行单剂量和双剂量免疫后的不良事件
本实验的目的是确定志愿者在用所开发药剂的不同变体免疫后的副作用。
试验中包括18至60岁的健康志愿者。将试验的所有参与者分成几组。
1)单次肌内给药基于重组人腺病毒血清型26(Ad26-too-CMV-S-CoV2)的液体形式的药剂，1011病毒颗粒/剂，9个个体
2)单次肌内给药基于重组人腺病毒血清型5(Ad5-too-CMV-S-CoV2)的液体形式的药剂，1011病毒颗粒/剂，9个个体
3)一种双针免疫接种方案，其中首先给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型26(Ad26-too-CMV-S-CoV2)的药剂，1011病毒颗粒/剂，21天后给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型5(Ad5-too-CMV-S-CoV2)的药剂，1011病毒颗粒/剂，20个个体。
表3包括试验开始至第180天就诊(电话)报告的最常见不良事件数据。
表3——在单针给药和两针给药的情况下观察到的最常见的不良事件
Figure GDA0003687684200000201
Figure GDA0003687684200000211
如通过所提交的数据所证明的，在用所开发的用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒 SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂以液体形式进行单次免疫方案后，副作用的发生率与双针免疫方案相比显著较低。
实例11.基于体液免疫应答的评估，评估所开发制剂的鼻内免疫的有效性
本研究的目的是验证所开发的药剂在鼻内给药后的有效性。
在实验中使用18至20g的C57/Bl6雌性小鼠，5只动物/组。形成以下动物组：
1)液体形式的基于重组人腺病毒血清型26(Ad26-too-CMV-S-CoV2)的药剂的单剂量鼻内给药，5*1010病毒颗粒/剂量。
2)液体形式的基于重组人腺病毒血清型5(Ad5-too-CMV-S-CoV2)的药剂的单剂量鼻内给药，5*1010病毒颗粒/剂量。
3)液体形式的基于重组猿腺病毒血清型25(simAd25-too-CMV-S-CoV2)的药剂的单剂量鼻内给药，5*1010病毒颗粒/剂量
4)液体形式的基于重组人腺病毒血清型26(Ad26-too-CMV-S-CoV2)的药剂的单剂量鼻内给药，5*1011病毒颗粒/剂量
5)液体形式的基于重组人腺病毒血清型5(Ad5-too-CMV-S-CoV2)的药剂的单剂量鼻内给药，5*1011病毒颗粒/剂量。
6)液体形式的基于重组猿腺病毒血清型25(simAd25-too-CMV-S-CoV2)的药剂的单剂量鼻内给药，5*1011病毒颗粒/剂量
7)单剂量鼻内给药缓冲溶液(阴性对照)。
三周后，从动物的尾静脉取血样，分离血清。根据以下方案使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量抗体滴度：
1)在+4℃的温度下将抗原吸附到96孔ELISA板的孔上持续16小时。
2)然后，为了防止非特异性结合，用溶解在TPBS中的5％牛奶100μl/孔的量“封闭”板。将其在37℃的振荡器中温育一小时。
3)将来自免疫小鼠的血清样品稀释100倍，然后制备两倍稀释系列。
4)将各50μl稀释血清样品添加到板孔中。
5)然后，在37℃下温育1小时。
6)温育后，将孔用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次。
7)然后，添加抗与辣根过氧化物酶偶联的小鼠免疫球蛋白的第二抗体。
8)接着，在37℃下温育1小时。
9)温育后，将孔用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次。
10)然后，添加四甲基联苯胺(TMB)溶液，其用作辣根过氧化物酶的底物并通过反应转化为有色化合物。15分钟后，通过添加硫酸停止反应。接着，使用分光光度计，在450nm波长下在每个孔中测量溶液的光密度(OD)。
抗体滴度被确定为溶液光密度显著高于阴性对照组的最后稀释度。获得的结果(几何平均值)在表5中呈现。
表4——小鼠血清中抗SARS-CoV-2S蛋白的抗体滴度(抗体滴度的几何平均值)
动物组 抗体滴度
Ad26-too-CMV-S-CoV2，5*10<sup>10</sup>v.p./剂量 919
Ad5-too-CMV-S-CoV2，5*10<sup>10</sup>v.p./剂量 8445
simAd25-too-CMV-S-CoV2，5*10<sup>10</sup>v.p./剂量 6400
Ad26-too-CMV-S-CoV2，5*10<sup>11</sup>v.p./剂量 1838
Ad5-too-CMV-S-CoV2，5*10<sup>11</sup>v.p./剂量 19401
simAd25-too-CMV-S-CoV2，5*10<sup>11</sup>v.p./剂量 12800
缓冲溶液 0
实验结果表明，用开发的药剂对动物进行鼻内免疫导致对SARS-CoV-2的S蛋白的抗体滴度增加。因此，本实验的结果证明，通过鼻内途径给药的液体形式的所开发的药剂可用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫。
实例12.在伴随肌内和鼻内免疫后评估开发的药剂的免疫原性
本研究的目的是验证所开发的药剂在伴随肌内和鼻内免疫后的功效。
在实验中使用18至20g的C57/Bl6雌性小鼠，5只动物/组。形成以下动物组：
1)同时鼻内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型26的药剂 (Ad26-too-CMV-S-CoV2)，5*1010病毒颗粒/剂，和肌内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型26的药剂(Ad26-too-CMV-S-CoV2)，5*1010病毒颗粒/剂。
2)鼻内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型26(Ad26-too-CMV-S-CoV2)的药剂，5*1010病毒颗粒/剂。
3)肌内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型26(Ad26-too-CMV-S-CoV2)的药剂，5*1010病毒颗粒/剂。
4)同时鼻内施用液体形式的基于重组人腺病毒血清型5的药剂 (Ad5-too-CMV-S-CoV2)，5*1010病毒颗粒/剂，和肌内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型5的药剂(Ad5-too-CMV-S-CoV2)，5*1010病毒颗粒/剂。
5)鼻内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型5(Ad5-too-CMV-S-CoV2)的药剂，5*1010病毒颗粒/剂。
6)肌内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型5(Ad5-too-CMV-S-CoV2)的药剂，5*1010病毒颗粒/剂。
7)同时鼻内给药液体形式的基于重组猿腺病毒血清型25的药剂 (simAd25-too-CMV-S-CoV2)，5*1010病毒颗粒/剂，和肌内给药液体形式的基于重组猿腺病毒血清型25的药物(simAd25-too-CMV-S-CoV2)，5*1010病毒颗粒/剂。
8)鼻内给药液体形式的基于重组猿腺病毒血清型25(simAd25-too-CMV-S-CoV2)的药剂，5*1010病毒颗粒/剂。
9)肌内给药液体形式的基于重组猿腺病毒血清型25(simAd25-too-CMV-S-CoV2)的药剂，5*1010病毒颗粒/剂。
10)同时鼻内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型26的药剂 (Ad26-too-CMV-S-CoV2)，5*1011病毒颗粒/剂，和肌内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型26的药剂(Ad26-too-CMV-S-CoV2)，5*1011病毒颗粒/剂。
11)鼻内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型26(Ad26-too-CMV-S-CoV2)的药剂，5*1011病毒颗粒/剂。
12)肌内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型26(Ad26-too-CMV-S-CoV2)的药剂，5*1011病毒颗粒/剂。
13)同时鼻内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型5的药剂(Ad5-too-CMV-S-CoV2)，5*1011病毒颗粒/剂，和肌内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型5的药剂(Ad5-too-CMV-S-CoV2)，5*1011病毒颗粒/剂。
14)鼻内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型5(Ad5-too-CMV-S-CoV2)的药剂，5*1011病毒颗粒/剂。
15)肌内给药液体形式的基于重组人腺病毒血清型5(Ad5-too-CMV-S-CoV2)的药剂，5*1011病毒颗粒/剂。
16)同时鼻内给药液体形式的基于重组猿腺病毒血清型25的药剂 (simAd25-too-CMV-S-CoV2)，5*1011病毒颗粒/剂，和肌内给药液体形式的基于重组猿腺病毒血清型25的药物(simAd25-too-CMV-S-CoV2)，5*1011病毒颗粒/剂。
17)鼻内给药液体形式的基于重组猿腺病毒血清型25(simAd25-too-CMV-S-CoV2)的药剂，5*1011病毒颗粒/剂。
18)肌内给药液体形式的基于重组猿腺病毒血清型25(simAd25-too-CMV-S-CoV2)的药剂，5*1011病毒颗粒/剂。
19)同时鼻内给药缓冲溶液和肌内给药缓冲溶液(阴性对照)
20)缓冲溶液的鼻内给药(阴性对照)。
21)缓冲溶液的肌内给药(阴性对照)。
三周后，从动物的尾静脉取血样，分离血清。根据以下方案使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量抗体滴度：
1)在+4℃的温度下将抗原吸附到96孔ELISA板的孔上持续16小时。
2)然后，为了防止非特异性结合，用溶解在TPBS中的5％牛奶以100μl/孔的量“封闭”板。将其在37℃的振荡器中温育一小时。
3)将来自免疫小鼠的血清样品稀释100倍，然后制备两倍稀释系列。
4)将各50μl稀释血清样品添加到板孔中。
5)然后，在37℃下温育1小时。
6)温育后，将孔用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次。
7)然后，添加抗与辣根过氧化物酶偶联的小鼠免疫球蛋白的第二抗体。
8)接着，在37℃下温育1小时。
9)温育后，将孔用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次。
10)然后，添加四甲基联苯胺(TMB)溶液，其用作辣根过氧化物酶的底物并通过反应转化为有色化合物。15分钟后，通过添加硫酸停止反应。接着，使用分光光度计，在450nm波长下在每个孔中测量溶液的光密度(OD)。
抗体滴度定义为溶液光密度显著高于阴性对照组的最后稀释度。获得的结果(几何平均值)在表5中呈现。
表5——小鼠血清中抗SARS-CoV-2S蛋白的抗体滴度(抗体滴度的几何平均值)
Figure GDA0003687684200000241
Figure GDA0003687684200000251
如获得的结果所示，与通过单一给药途径的免疫相比，用开发的药剂对动物进行伴随鼻内和肌内免疫诱导了更强的体液免疫应答。因此，本实验的结果证明，所开发的药剂可用于通过肌肉和鼻腔同时给药来诱导对SARS-CoV-2病毒的特异性免疫。
工业实用性
所有提供的实例证明了药剂的功效，确保了对SARS-CoV-2病毒的免疫反应的有效诱导和工业实用性。
序列表
<110> 俄罗斯联邦卫生部联邦国家预算机构“名誉院士 N. F. Gamaleya 国家流行病学和微
生物学研究中心”(FEDERAL STATE BUDGETARY INSTITUTION "NATIONALRESEARCH
CENTRE FOR EPIDEMIOLOGY AND MICROBIOLOGY NAMED AFTER THE HONORARY
ACADEMICIAN N.F. GAMALEYA" OF THE MINISTRY OF HEALTH OF THERUSSIAN
FEDERATION)
<120> 用于诱导对SARS-CoV-2的特异性免疫的液体形式的药剂（变体）
<130> LHB2267534P
<150> 2021103099
<151> 2021-02-09
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300
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gctgctgcag tacggcagct tctgcaccca gctgaataga gccctgacag ggatcgccgt 3540
ggaacaggac aagaacaccc aagaggtgtt cgcccaagtg aagcagatct acaagacccc 3600
tcctatcaag gacttcggcg gcttcaattt cagccagatt ctgcccgatc ctagcaagcc 3660
cagcaagcgg agcttcatcg aggacctgct gttcaacaaa gtgacactgg ccgacgccgg 3720
cttcatcaag cagtatggcg attgtctggg cgacattgcc gccagggatc tgatttgcgc 3780
ccagaagttt aacggactga cagtgctgcc accactgctg accgatgaga tgatcgccca 3840
gtacacatct gccctgctgg ccggcacaat cacaagcggc tggacatttg gagctggcgc 3900
cgctctgcag atcccctttg ctatgcagat ggcctaccgg ttcaacggca tcggagtgac 3960
ccagaatgtg ctgtacgaga accagaagct gatcgccaac cagttcaaca gcgccatcgg 4020
caagatccag gacagcctga gcagcacagc aagcgccctg ggaaagctgc aggacgtggt 4080
caaccagaat gcccaggcac tgaacaccct ggtcaagcag ctgtcctcca acttcggcgc 4140
catcagctct gtgctgaacg acatcctgag cagactggac aaggtggaag ccgaggtgca 4200
gatcgacaga ctgatcaccg gaaggctgca gtccctgcag acctacgtta cccagcagct 4260
gatcagagcc gccgagatta gagcctctgc caatctggcc gccaccaaga tgtctgagtg 4320
tgtgctgggc cagagcaaga gagtggactt ttgcggcaag ggctaccacc tgatgagctt 4380
ccctcagtct gcccctcacg gcgtggtgtt tctgcacgtg acatacgtgc ccgctcaaga 4440
gaagaatttc accaccgctc cagccatctg ccacgacggc aaagcccact ttcctagaga 4500
aggcgtgttc gtgtccaacg gcacccattg gttcgtgacc cagcggaact tctacgagcc 4560
ccagatcatc accaccgaca acaccttcgt gtctggcaac tgcgacgtcg tgatcggcat 4620
tgtgaacaat accgtgtacg accctctgca gcccgagctg gacagcttca aagaggaact 4680
ggataagtac tttaagaacc acacaagccc cgacgtggac ctgggcgaca tcagcggaat 4740
caatgccagc gtcgtgaaca tccagaaaga gatcgaccgg ctgaacgagg tggccaagaa 4800
tctgaacgag agcctgatcg acctgcaaga actggggaag tacgagcagt acatcaagtg 4860
gccctggtac atctggctgg gctttatcgc cggactgatt gccatcgtga tggtcacaat 4920
catgctgtgt tgcatgacca gctgctgtag ctgcctgaag ggctgttgta gctgtggcag 4980
ctgctgcaag ttcgacgagg acgattctga gcccgtgctc aaaggagtca aattacatta 5040
cacataagat ctagagtcgg ggcggccggc cgctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc 5100
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 5160
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 5220
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 5280
tagcaggcat gctggggatc cgagtgtcga taag 5314
<210> 4
<211> 4678
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360
gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420
tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480
aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540
ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccat 600
gtttgtgttc cttgtgttat tgccactagt ctctagtcag tgtgtgaacc tgaccacaag 660
aacccagctg cctccagcct acaccaacag ctttaccaga ggcgtgtact accccgacaa 720
ggtgttcaga tccagcgtgc tgcactctac ccaggacctg ttcctgcctt tcttcagcaa 780
cgtgacctgg ttccacgcca tccacgtgtc cggcaccaat ggcaccaaga gattcgacaa 840
ccccgtgctg cccttcaacg acggggtgta ctttgccagc accgagaagt ccaacatcat 900
cagaggctgg atcttcggca ccacactgga cagcaagacc cagagcctgc tgatcgtgaa 960
caacgccacc aacgtggtca tcaaagtgtg cgagttccag ttctgcaacg accccttcct 1020
gggcgtctac tatcacaaga acaacaagag ctggatggaa agcgagttcc gggtgtacag 1080
cagcgccaac aactgcacct tcgagtacgt gtcccagcct ttcctgatgg acctggaagg 1140
caagcagggc aacttcaaga acctgcgcga gttcgtgttc aagaacatcg acggctactt 1200
caagatctac agcaagcaca cccctatcaa cctcgtgcgg gatctgcctc agggcttctc 1260
tgctctggaa cccctggtgg atctgcccat cggcatcaac atcacccggt ttcagacact 1320
gctggccctg cacagaagct acctgacacc tggcgatagc agcagcggat ggacagctgg 1380
tgccgccgct tactatgtgg gctacctgca gcctagaacc ttcctgctga agtacaacga 1440
gaacggcacc atcaccgacg ccgtggattg tgctctggat cctctgagcg agacaaagtg 1500
caccctgaag tccttcaccg tggaaaaggg catctaccag accagcaact tccgggtgca 1560
gcccaccgaa tccatcgtgc ggttccccaa tatcaccaat ctgtgcccct tcggcgaggt 1620
gttcaatgcc accagattcg cctctgtgta cgcctggaac cggaagcgga tcagcaattg 1680
cgtggccgac tactccgtgc tgtacaactc cgccagcttc agcaccttca agtgctacgg 1740
cgtgtcccct accaagctga acgacctgtg cttcacaaac gtgtacgccg acagcttcgt 1800
gatccgggga gatgaagtgc ggcagattgc ccctggacag acaggcaaga tcgccgacta 1860
caactacaag ctgcccgacg acttcaccgg ctgtgtgatt gcctggaaca gcaacaacct 1920
ggactccaaa gtcggcggca actacaatta cctgtaccgg ctgttccgga agtccaatct 1980
gaagcccttc gagcgggaca tctccaccga gatctatcag gccggcagca ccccttgtaa 2040
cggcgtggaa ggcttcaact gctacttccc actgcagtcc tacggctttc agcccacaaa 2100
tggcgtgggc tatcagccct acagagtggt ggtgctgagc ttcgaactgc tgcatgcccc 2160
tgccacagtg tgcggcccta agaaaagcac caatctcgtg aagaacaaat gcgtgaactt 2220
caacttcaac ggcctgaccg gcaccggcgt gctgacagag agcaacaaga agttcctgcc 2280
attccagcag tttggccggg atattgccga taccacagac gccgtacgag atccccagac 2340
actggaaatc ctggacatca ccccttgcag cttcggcgga gtgtctgtga tcacccctgg 2400
caccaacacc agcaatcagg tggcagtgct gtaccaggac gtgaactgta ccgaagtgcc 2460
cgtggccatt cacgccgatc agctgacacc tacatggcgg gtgtactcca ccggcagcaa 2520
tgtgtttcag accagagccg gctgtctgat cggagccgag cacgtgaaca atagctacga 2580
gtgcgacatc cccatcggcg ctggcatctg tgccagctac cagacacaga caaacagccc 2640
cagacgggcc agatctgtgg ccagccagag catcattgcc tacacaatgt ctctgggcgc 2700
cgagaacagc gtggcctact ccaacaactc tatcgctatc cccaccaact tcaccatcag 2760
cgtgaccaca gagatcctgc ctgtgtccat gaccaagacc agcgtggact gcaccatgta 2820
catctgcggc gattccaccg agtgctccaa cctgctgctg cagtacggca gcttctgcac 2880
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gttcgcccaa gtgaagcaga tctacaagac ccctcctatc aaggacttcg gcggcttcaa 3000
tttcagccag attctgcccg atcctagcaa gcccagcaag cggagcttca tcgaggacct 3060
gctgttcaac aaagtgacac tggccgacgc cggcttcatc aagcagtatg gcgattgtct 3120
gggcgacatt gccgccaggg atctgatttg cgcccagaag tttaacggac tgacagtgct 3180
gccaccactg ctgaccgatg agatgatcgc ccagtacaca tctgccctgc tggccggcac 3240
aatcacaagc ggctggacat ttggagctgg cgccgctctg cagatcccct ttgctatgca 3300
gatggcctac cggttcaacg gcatcggagt gacccagaat gtgctgtacg agaaccagaa 3360
gctgatcgcc aaccagttca acagcgccat cggcaagatc caggacagcc tgagcagcac 3420
agcaagcgcc ctgggaaagc tgcaggacgt ggtcaaccag aatgcccagg cactgaacac 3480
cctggtcaag cagctgtcct ccaacttcgg cgccatcagc tctgtgctga acgacatcct 3540
gagcagactg gacaaggtgg aagccgaggt gcagatcgac agactgatca ccggaaggct 3600
gcagtccctg cagacctacg ttacccagca gctgatcaga gccgccgaga ttagagcctc 3660
tgccaatctg gccgccacca agatgtctga gtgtgtgctg ggccagagca agagagtgga 3720
cttttgcggc aagggctacc acctgatgag cttccctcag tctgcccctc acggcgtggt 3780
gtttctgcac gtgacatacg tgcccgctca agagaagaat ttcaccaccg ctccagccat 3840
ctgccacgac ggcaaagccc actttcctag agaaggcgtg ttcgtgtcca acggcaccca 3900
ttggttcgtg acccagcgga acttctacga gccccagatc atcaccaccg acaacacctt 3960
cgtgtctggc aactgcgacg tcgtgatcgg cattgtgaac aataccgtgt acgaccctct 4020
gcagcccgag ctggacagct tcaaagagga actggataag tactttaaga accacacaag 4080
ccccgacgtg gacctgggcg acatcagcgg aatcaatgcc agcgtcgtga acatccagaa 4140
agagatcgac cggctgaacg aggtggccaa gaatctgaac gagagcctga tcgacctgca 4200
agaactgggg aagtacgagc agtacatcaa gtggccctgg tacatctggc tgggctttat 4260
cgccggactg attgccatcg tgatggtcac aatcatgctg tgttgcatga ccagctgctg 4320
tagctgcctg aagggctgtt gtagctgtgg cagctgctgc aagttcgacg aggacgattc 4380
tgagcccgtg ctcaaaggag tcaaattaca ttacacataa gatatcgcgg ccgctcgagt 4440
ctagataact gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 4500
acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 4560
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 4620
aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatctta 4678

Claims (8)

1.一种用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂，呈液体形式，其含有单一活性组分，包含基于人腺病毒血清型26的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失且ORF6-Ad26区被ORF6-Ad5取代，整合表达盒选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。
2.一种用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂，呈液体形式，其含有单一活性组分，包含基于人腺病毒血清型5的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。
3.一种用于诱导对严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV-2的特异性免疫的药剂，呈液体形式，其含有单一活性组分，包含基于猿腺病毒血清型25的重组株基因组的表达载体，其中E1和E3区缺失，整合表达盒选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。
4.根据权利要求1至3中任一项所呈现的药剂，其特征在于，所述药剂另外含有缓冲溶液，所述缓冲溶液包含以下质量％：
Figure FDA0003547633980000011
5.根据权利要求1至3中所呈现的药剂用于诱导对SARS-CoV-2病毒的免疫应答的用途，其中要求所述药剂用于鼻内或肌内给药，或伴随鼻内和肌内给药。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述药剂要求以5*1010至5*1011病毒颗粒的剂量鼻内给药。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述药剂要求以5*1010至5*1011病毒颗粒的剂量肌内给药。
8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，对于伴随的鼻内和肌内给药，所述药剂以5*1010至5*1011病毒颗粒的剂量肌内给药和以5*1010至5*1011病毒颗粒的剂量鼻内给药。
CN202180005353.9A 2021-02-09 2021-04-30 用于诱导对sars-cov-2特异性免疫的药剂 Pending CN115210378A (zh)

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