CN1152043C - 从味精废料中提取核苷酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从味精废料中提取核苷酸的方法。其步骤是先从味精废料所含的谷氨酸棒杆菌内将核酸分解出来，然后对所分解出来的核酸进行沉淀，再利用磷酸二酯酶对所沉淀的核酸进行定向酶解，最后利用活性炭柱对所酶解的产物进行提纯而得到5′-核苷酸成品。该方法克服了目前谷氨酸棒杆菌自溶法提取核苷酸工艺所存在的提取率低等弊病，充分利用了味精废料中的有用资源，所提取的产品得率高、纯度好、成本低，适于工业化大批量生产。

Description

从味精废料中提取核苷酸的方法

                      技术领域

本发明涉及利用工业废料生产核苷酸的方法，具体地指一种从味精废料中提取核苷酸的方法。

                      背景技术

味精废料是指味精发酵液在提取完谷氨酸后，所产生的废水经粗滤而剩余的残渣。该残渣一般呈稀糊状，其固形物含量约占30～40％，主要成份为谷氨酸棒杆菌，其余为水。目前，这种生产味精所产生的下脚废料大都弃置未用，不仅极大地浪费了其中的有效资源，而且废料的排放还严重污染了环境。在环保意识日趋增强的当今，如何充分利用味精废料中的谷氨酸棒杆菌，使其转化为对人体健康有良好益处的营养物质，已成为人们关注的焦点。人们通过对细菌的深入研究发现，许多细菌在一定的温度范围和特定的碱性环境下，其体内的核酸类物质和多种核酸酶会发生酶解反应生成核苷酸，所生成的核苷酸包含一部分的5′-核苷酸，也含有一部分的3′-核苷酸、2′-核苷酸以及核苷等成份，这种现象即是菌体的自溶。谷氨酸棒杆菌也不例外，利用谷氨酸棒杆菌的自溶也可以提取核苷酸，其生产工艺主要是利用谷氨酸棒杆菌菌体自身的磷酸二酯酶在pH值为9～10的碱性环境、温度为50～70℃的条件下，酶解其中的核酸类物质，使其大部分转化为核苷酸，再利用阴离子交换树脂来提纯核苷酸。但由于该自溶法所需的谷氨酸棒杆菌菌体浓度很低，仅需2％左右，否则其pH值难以控制，因而其提取率很低；而且在碱性的条件下，谷氨酸棒杆菌内部存在很多不同性能的核酸酶，其自溶的产物成分很复杂，酶解转化率也很低，不适于定向制作5′-核苷酸；同时由于该自溶法采用了阴离子交换树脂来提纯核苷酸，阴离子交换树脂的吸附量较低，易受盐浓度的影响，所需设备庞大，而设备的利用率却很低，导致产品产量也过低；综上所述，该自溶法生产工艺所需设备投资太大，核苷酸提取率太低，不适合于大工业生产。

                      发明内容

本发明的目的就是要克服目前谷氨酸棒杆菌自溶法提取核苷酸工艺所存在的弊病，充分利用现有味精废料中的有用资源，提供一种产品得率高、纯度好、成本低、且适于工业化生产的从味精废料中提取核苷酸的方法。

为实现此目的，本发明所研制的从味精废料中提取核苷酸的方法，是先从味精废料所含的谷氨酸棒杆菌内将核酸分解出来，再利用磷酸二酯酶对所分解出的核酸进行定向酶解，最后利用活性炭柱对所酶解的产物进行提纯。该方法包括以下步骤：

1)核酸的提取：取固形物含量占30～40％的味精废料与2～3倍重量的水混合搅拌均匀，调节其pH值至3～4并保持25～35分钟；然后将pH值调至7～8，加入上述混合液体积量4～6％的食盐，待食盐溶解完毕后，升温至90～100℃，保持1～2小时；再将其温度降至40℃～50℃，pH值调至4～6，同时加入阴离子絮凝剂，直至混合液中的菌体絮凝成块后，对其进行分离，分离出的清液即为含有核酸的提取液，将此核酸提取液冷冻至8～12℃待用；

2)核酸的沉淀：预先准备好步骤1)所制核酸提取液体积量16～25％的浓度为3N的盐酸置于沉淀缸中，再加入步骤1)所得核酸提取液与其混合，使此核酸混合液的pH值处于1～2之间，恰好达到核酸的等电点，此时核酸即大量沉淀下来；核酸沉淀之后，将上层清液抽光，所得沉淀加水溶解成1～2％浓度的核酸稀溶液，再调节其pH值至4.8～5.2，升温至80～90℃待用；

3)磷酸二酯酶酶液的制备：取重量为步骤2)所得核酸稀溶液中纯核酸量2.8～3.2倍的利用桔青霉菌种发酵生产的麸皮霉，与9～10倍重量的水在40～50℃的温度下浸泡1～2小时，然后降温至20～30℃，滤除固体霉，再升温使清液在70℃保持4～6分钟后迅速降温至30℃，随后去除孢子，所得清液即为磷酸二酯酶酶液；

4)混合酶解：将步骤2)所得的核酸稀溶液和步骤3)所得的磷酸二酯酶酶液相混合，在65～75℃、pH值4.8～5.5的条件下水解1～2小时，再将其pH值调至7.2～7.8，并升温至90℃，保持12～15分钟后，迅速降温至30～40℃，去除其中的不溶物，所得清液即为需要提纯的核苷酸粗液；

5)活性炭柱提纯：将步骤4)所得核苷酸粗液的pH值调节至1.5～3.0后上活性炭柱，以每毫升炭柱每分钟0.03～0.05毫升流出液的流速上柱完毕，然后以同样的流速用软水洗脱去杂，再以同样的流速换用由40～60％的酒精和0.5～1％的氨水组成的洗脱液进行洗脱，保持炭柱在50～70℃恒温下洗脱，直至流出液经酒精检测无白色浑浊为止，所得洗脱液即为浓度3～5％的核苷酸精液；保持此核苷酸精液的温度为50～70℃，在真空条件下浓缩回收其中的酒精，使其中核苷酸的浓度提高至9～12％；再调节此高浓度核苷酸液的pH值至2.5～3.5，加入其体积量3～5倍的95％以上的酒精即得核苷酸沉淀；将此沉淀真空干燥即得核苷酸成品。

本发明的优点在于：方法中采用了先将谷氨酸棒杆菌内的核酸提取出来，再利用磷酸二酯酶对所提取出的核酸进行定向酶解的工艺路线。而参与核酸提取的谷氨酸棒杆菌的菌体浓度可达10％左右，约为自溶法生产工艺中菌体浓度的5倍，这样大幅增加了每次生产过程中谷氨酸棒杆菌的用量，既提高了反应设备的利用率，又为最终核苷酸收得率的提高打下了良好的基础。所采用的磷酸二酯酶对核酸的酶解作用具有很强的定向性，其酶解生成的产物绝大多数为5′-核苷酸，而不会是包含有各种复杂成分的自溶产物，这样所得产品成份一致，纯度极高。同时方法中使用了活性炭柱来提纯核苷酸，活性炭吸附核苷酸的量大，且不受盐浓度的影响，使得所用设备的规模可大幅减小，设备利用率进一步提高，所提取的核苷酸产量也得以大幅度提高。从而本方法能适应大批量工业化生产的需要。另外，由于本发明使用了酵母的替代原料---味精废料，使得生产成本大幅下降，不仅变废为宝，而且缓解了味精废料排放所带来的环境污染问题。

                    具体实施方式

以下是本发明所提出的从味精废料中提取核苷酸的方法的一种具体实施例，该方法包括以下步骤：

1)核酸的提取：取固形物含量占35％左右的味精废料与2倍重量的水混合搅拌均匀，加入浓度为6N的氢氧化钠溶液调节其pH值至3.5并保持30分钟。然后再用浓度为6N的氢氧化钠溶液将pH值调至7.2，加入上述混合液体积量4％的食盐，待食盐溶解完毕后，打入提取缸。将其在提取缸内升温至94～96℃，此时混合液发生反应开始析出核酸，在此温度下保持40分钟后，用分光光度计开始取样监测混合液的OD₂₆₀指标，直至其不再升高后停止提取，此过程约需1～1.5小时。再通过换热器将其温度降至40℃～50℃，用浓度为3N的盐酸溶液将pH值调至4.2～4.5，同时加入已溶解成0.1％浓度的聚丙烯酰胺阴离子絮凝剂溶液，直至混合液中的菌体絮凝成块后，利用OD₄₂₄高速分离机对其进行分离，分离出的清液即为含有核酸的提取液，将此核酸提取液置于冷冻缸中冷冻至8～12℃待用；

2)核酸的沉淀：预先准备好步骤1)所制核酸提取液体积量20％的浓度为3N的盐酸溶液置于沉淀缸中，再抽真空吸入步骤1)所得核酸提取液与其混合，使此核酸混合液的pH值立即处于1～2之间，恰好达到核酸的等电点，此时核酸即大量沉淀下来。这里需要注意的是核酸提取液与盐酸溶液的混合方式，将核酸提取液吸入到盐酸溶液中，其pH值将先低后高，正好促使核酸沉淀；如果将盐酸溶液吸入到核酸提取液中，其pH值将先高后低，反而会使一些蛋白质沉淀下来，影响核酸的提取率和提纯度。核酸沉淀之后，将上层清液抽光，所得沉淀加水溶解成1～2％浓度的核酸稀溶液，再用浓度为6N的氢氧化钠溶液调节其pH值至5.0，升温至85℃左右待用；

3)磷酸二酯酶酶液的制备：利用中国科学院微生物研究所生产的标号为AS3.2788的桔青霉菌种发酵生产的麸皮霉，重量为步骤2)所得核酸稀溶液中纯核酸量的3倍，与10倍重量的水在45℃的温度下浸泡1小时，然后降温至20℃，用80目丝网滤除固体霉，再升温使清液在70℃左右保持5分钟后迅速降温至30℃左右，随后经管式分离机去除孢子，所得清液即为磷酸二酯酶酶液；

4)混合酶解：将步骤2)所得的核酸稀溶液和步骤3)所得的磷酸二酯酶酶液相混合，在70℃左右、pH值5.0～5.2的条件下水解2小时，再用浓度为6N的氢氧化钠溶液将其pH值调至7.2～7.4，并升温至90℃左右，保持15分钟后，迅速降温至30℃左右，用板框过滤去除其中的不溶物，所得清液即为需要提纯的核苷酸粗液；

5)活性炭柱提纯：将步骤4)所得核苷酸粗液的pH值用浓度为3N的盐酸溶液调节至1.5后上活性炭柱，以每毫升炭柱每分钟0.03～0.05毫升流出液的流速上柱完毕，然后以同样的流速用软水洗脱约6小时去杂，再以同样的流速换用由50％的酒精和1％的氨水组成的洗脱液进行洗脱，保持炭柱在60℃的恒温下洗脱，直至流出液经酒精检测无白色浑浊为止，所得洗脱液即为浓度4％的核苷酸精液。保持此核苷酸精液的温度为50℃，在真空条件下浓缩回收其中的酒精，使其中核苷酸的浓度提高至9～12％。再用浓度为3N的盐酸溶液调节此高浓度核苷酸液的pH值至3.0，加入其体积量5倍的95％以上的酒精即得核苷酸沉淀，最后将此沉淀置于真空干燥柜内烘干即得核苷酸成品。

Claims (1)

1.一种从味精废料中提取核苷酸的方法，包括以下步骤：

1)核酸的提取：取固形物含量占30～40％的味精废料与2～3倍重量的水混合搅拌均匀，调节其pH值至3～4并保持25～35分钟；然后将pH值调至7～8，加入上述混合液体积量4～6％的食盐，待食盐溶解完毕后，升温至90～100℃，保持1～2小时；再将其温度降至40℃～50℃，pH值调至4～6，同时加入阴离子絮凝剂，直至混合液中的菌体絮凝成块后，对其进行分离，分离出的清液即为含有核酸的提取液，将此核酸提取液冷冻至8～12℃待用；

2)核酸的沉淀：预先准备好步骤1)所制核酸提取液体积量16～25％的浓度为3N的盐酸置于沉淀缸中，再加入步骤1)所得核酸提取液与其混合，使此核酸混合液的pH值处于1～2之间，恰好达到核酸的等电点，此时核酸即大量沉淀下来；核酸沉淀之后，将上层清液抽光，所得沉淀加水溶解成1～2％浓度的核酸稀溶液，再调节其pH值至4.8～5.2，升温至80～90℃待用；

3)磷酸二酯酶酶液的制备：取重量为步骤2)所得核酸稀溶液中纯核酸量2.8～3.2倍的利用桔青霉菌种发酵生产的麸皮霉，与9～10倍重量的水在40～50℃的温度下浸泡1～2小时，然后降温至20～30℃，滤除固体霉，再升温使清液在70℃保持4～6分钟后迅速降温至30℃，随后去除孢子，所得清液即为磷酸二酯酶酶液；

4)混合酶解：将步骤2)所得的核酸稀溶液和步骤3)所得的磷酸二酯酶酶液相混合，在65～75℃、pH值4.8～5.5的条件下水解1～2小时，再将其pH值调至7.2～7.8，并升温至90℃，保持12～15分钟后，迅速降温至30～40℃，去除其中的不溶物，所得清液即为需要提纯的核苷酸粗液；

5)活性炭柱提纯：将步骤4)所得核苷酸粗液的pH值调节至1.5～3.0后上活性炭柱，以每毫升炭柱每分钟0.03～0.05毫升流出液的流速上柱完毕，然后以同样的流速用软水洗脱去杂，再以同样的流速换用由40～60％的酒精和0.5～1％的氨水组成的洗脱液进行洗脱，保持炭柱在50～70℃恒温下洗脱，直至流出液经酒精检测无白色浑浊为止，所得洗脱液即为浓度3～5％的核苷酸精液；保持此核苷酸精液的温度为50～70℃，在真空条件下浓缩回收其中的酒精，使其中核苷酸的浓度提高至9～12％；再调节此高浓度核苷酸液的pH值至2.5～3.5，加入其体积量3～5倍的95％以上的酒精即得核苷酸沉淀；将此沉淀真空干燥即得核苷酸成品。