CN115197915A - 恶性表型大细胞肺癌细胞株及其应用 - Google Patents

恶性表型大细胞肺癌细胞株及其应用 Download PDF

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CN115197915A CN202210918627.XA CN202210918627A CN115197915A CN 115197915 A CN115197915 A CN 115197915A CN 202210918627 A CN202210918627 A CN 202210918627A CN 115197915 A CN115197915 A CN 115197915A
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及恶性表型大细胞肺癌细胞株及其应用。本发明提供恶性表型大细胞肺癌细胞株，所述的细胞株包含：801D‑A10、801D‑F4、801D‑H10、801D‑E6、801D‑F10和801D‑F11中的任意一种。本发明建立的6种人大细胞肺癌细胞株，都可以成功传代至60代，能够稳定传代，且生长迅速。通过体内外实验证实801D‑A10、801D‑F4和801D‑H10细胞株的增殖和迁移侵袭能力强，通过体内外实验证实801D‑E6、801D‑F10和801D‑F11细胞株的增殖和迁移侵袭能力弱。

Description

恶性表型大细胞肺癌细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及恶性表型大细胞肺癌细胞株及其应用。
背景技术
肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。近50年来其发病率和死亡率均明显增加，男性发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确。而且50％以上的肺癌患者在确诊时已属晚期，而晚期肺癌患者的预后极差，5年生存率仅5％。预计未来20年，肺癌将成为我国社会负担和经济负担最重的疾病。尽管近年来靶向治疗和免疫治疗，显著延长了患者的生存时间，但靶向治疗耐药的时常发生和免疫治疗的不良反应使肺癌的治疗面临困境，因此，探讨肺癌发生发展的分子机制及分子治疗靶点仍然是迫切亟待解决的问题。
细胞是生物体结构和功能的基本单位，是生物体个体发育和系统发育的基础。肿瘤细胞具有无限增殖、失去接触抑制、细胞间粘着性减弱等特点，体外培养和建立人肺癌细胞系或细胞株对于研究肺癌癌变、侵袭转移、多药耐药的分子机理、生物学特征以及开发抗肺癌新药等均有十分重要的理论和临床意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种容易培养，传代稳定，易于推广，可以在传统的细胞生物学实验室使用的恶性表型大细胞肺癌细胞株。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
第一方面，本发明提供恶性表型大细胞肺癌细胞株，所述的细胞株包含：
保藏号为CGMCC NO:45140的801D-A10；
保藏号为CGMCC NO:45141的801D-F4；
保藏号为CGMCC NO:45139的801D-H10；
保藏号为CGMCC NO:45138的801D-E6；
保藏号为CGMCC NO:45142的801D-F10
和保藏号为CGMCC NO:45143的801D-F11中的任意一种。
在一种具体实施方式中，所述的细胞株中801D-A10、801D-F4和801D-H10细胞株增殖和迁移侵袭能力强，801D-E6、801D-F10和801D-F11细胞株增殖和迁移侵袭能力弱。
第二方面，本发明提供恶性表型大细胞肺癌细胞株的获取方法，所述的方法包括：
将人巨细胞性肺癌细胞801D接种在Transwell小室上层，癌细胞培养后被聚碳酸酯膜分离为3种，分别为：依附于聚碳酸酯膜贴壁生长的癌细胞801D膜、穿过聚碳酸酯膜没有贴壁生长落在孔板底的癌细胞801D下和未穿过聚碳酸酯膜的癌细胞801D上；
3种细胞分别培养，消化、重悬后单细胞培养并扩增，筛选得到801D-A10、801D-F4、801D-H10、801D-E6、801D-F10和801D-F11单克隆。
在一种具体实施方式中，所述的细胞株中：
801D-A10和801D-F4为801D穿过聚碳酸酯膜贴壁生长的单克隆；
801D-E6和801D-H10为801D未穿过聚碳酸酯膜的单克隆；
801D-F10和801D-F11为801D穿过聚碳酸酯膜落在孔板底的单克隆。
第三方面，本发明提供恶性表型大细胞肺癌细胞株在肺癌研究中的应用。
第四方面，本发明提供恶性表型大细胞肺癌细胞株在肺癌细胞增殖和迁移侵袭能力研究中的应用。
第五方面，本发明提供一种用于肺癌细胞增殖和转移研究的细胞模型，所述的细胞模型包含801D-A10、801D-F4、801D-H10、801D-E6、801D-F10和801D-F11细胞株中的任意一种。
在一种具体实施方式中，所述的细胞株中801D-A10、801D-F4和801D-H10细胞株的增殖和迁移侵袭能力强，
801D-E6、801D-F10和801D-F11细胞株的增殖和迁移侵袭能力弱。
本发明建立的6种人大细胞肺癌细胞株，分别为801D-A10、801D-F4、801D-H10、801D-E6、801D-F10和801D-F11细胞株。上述6种细胞都能够稳定传代，且生长迅速。通过体内外实验证实801D-A10、801D-F4和801D-H10细胞株的增殖和迁移侵袭能力强，通过体内外实验证实801D-E6、801D-F10和801D-F11细胞株的增殖和迁移侵袭能力弱。
本发明提供的6种人大细胞肺癌细胞株为肺癌增殖和转移相关研究提供良好的细胞模型。
与现有技术相比，本发明提供的恶性表型大细胞肺癌细胞株的优点在于：
(1)容易培养，易于推广。
(2)能够稳定传代。
细胞保藏信息：
本发明提供的恶性表型大细胞肺癌细胞株，是本发明的发明人自行筛选得到的，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，所述恶性表型大细胞肺癌细胞株的保藏名称为：人肺癌细胞株801D-E6、人肺癌细胞株801D-A10、人肺癌细胞株801D-F4、人肺癌细胞株801D-H10、人肺癌细胞株801D-F10、人肺癌细胞株801D-F11，保藏号为CGMCC NO.45138、CGMCC NO.45140、CGMCC NO.45141、CGMCC NO.45139、CGMCC NO.45142、CGMCC NO.45143。保藏日期为2022年03月30日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。恶性表型大细胞肺癌细胞株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心于2022年03月30日鉴定存活。
附图说明
图1为本发明提供的6种人大细胞肺癌细胞株的细胞形态。
图2为本发明提供的6种人大细胞肺癌细胞的生长曲线。
图3为本发明提供的6种人大细胞肺癌细胞株集落形成情况。
图4为本发明提供的6种人大细胞肺癌细胞株裸鼠移植瘤大体图片。
图5为本发明提供的6种人大细胞肺癌细胞株与不同细胞株裸鼠移植瘤瘤重。
图6为本发明提供的801D-A10细胞与其它细胞株转移能力的比较结果。
图7为本发明提供的801D-F4细胞与其它细胞株转移能力的比较结果。
图8为本发明提供的801D-H10细胞与其它细胞株转移能力的比较结果。
图9为本发明提供的801D-E6细胞与其它细胞株转移能力的比较结果。
图10为本发明提供的801D-F10细胞与其它细胞株转移能力的比较结果。
图11为本发明提供的801D-F11细胞与其它细胞株转移能力的比较结果。
图6～11中，左侧1、2、3图为不同细胞株肺转移图片；右侧1、2、3图为不同细胞株肺组织切片转移灶情况；左侧1、2、3图中箭头所指为出现恶液质的老鼠，右侧1、2、3图中箭头所指为转移灶。
具体实施方式
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。
说明：
细胞培养条件均为：37℃、5％CO2静置培养。
实施例中所用的基础培养基为：取无血清RPMI-1640培养基，加入胎牛血清至浓度为10％、加入青霉素至浓度为1％、加入链霉素至浓度为1％。0.2％BSA RPMI-1640培养基为：取无血清RPMI-1640培养基，加入牛血清白蛋白(BSA)至浓度为0.2％、加入青霉素至浓度为1％、加入链霉素至浓度为1％。
实施例1
细胞培养与穿过Matrigel胶包被Polycarbonate膜的不同细胞株分离
一、细胞培养、传代与接种
1、801D细胞接种于基础培养基中。
2、将生长90％汇合的细胞进行传代，加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞。
3、加入完全培养基吹打混匀，混匀后用Muse细胞计数仪进行计数。
4、在6孔板中接种801D细胞，每孔细胞数为50万，每种细胞接种3孔。
5、37℃、5％CO2静置培养过夜。
二、穿过Matrigel胶包被Polycarbonate膜的不同细胞株分离
1、6孔板接种细胞第二天进行观察，细胞汇合度约为30～40％。
2、吸掉各孔中上清液，换成0.2％BSARPMI-1640培养基继续37℃、5％CO2静置培养24h。
3、将Matrige胶和0.2％BSA RPMI-1640培养基以1:5比例包被孔径为8.0μm，直径为6.5mm的Transwell小室底部膜的上室面，37℃过夜使其凝固。
4、在Transwell小室上室中每孔加入100μl 0.2％BSA RPMI-1640培养基进行水化30min，下室加入基础培养基600ul。对细胞进行传代，加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞，加入完全培养基吹打混匀，混匀后用Muse细胞计数仪进行计数。
5、用0.2％BSA RPMI-1640重悬801D细胞，使细胞浓度为200万/ml。将Transwell小室中水化的100μl 0.2％BSA RPMI-1640培养基吸出，每孔中加入100μl的上述细胞悬液。37℃、5％CO2静置培养48～72h。
6、此时穿过Matrigel胶包被Polycarbonate膜的细胞会分为两部分，一种是依附于Polycarbonate膜并进行贴壁生长，一种是穿过Polycarbonate膜没有贴壁生长落在24孔板底的细胞。将依附于Polycarbonate膜贴壁生长的细胞用胰酶消化，继续培养；落在24孔板底的细胞继续培养。另外将Transwell小室上室里没有穿过Polycarbonate膜的细胞吸出继续培养，这样就得到3种细胞：即上室里的细胞、膜上贴壁的细胞和落在24孔板底的细胞，分别对其命名为：801D上、801D膜和801D下。
三、801D三种细胞单克隆细胞株筛选
1、801D上、801D膜和801D下三种细胞培养在基础培养基中，培养至70％到80％汇合度。
2、加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞。加入基础培养基，混匀，离心后弃上清。用基础培养基重悬，重悬后用Muse细胞计数仪进行计数。
3、根据计数结果进行稀释，最终稀释为10个细胞/ml。
4、混匀后接种96孔板，每孔细胞悬液100μl。
5、37℃、5％CO2静置培养，一周后观察。
6、选取每孔里只有一个细胞的孔，连续观察直至其能够进行传代，并进行扩增。
7、从801D上、801D膜和801D下筛选的单克隆中得到6个克隆，分别是：
801D上：801D-E6和801D-H10；
801D膜：801D-A10和801D-F4；
801D下：801D-F10和801D-F11。
实施例2
不同细胞株细胞增殖能力的比较
一、细胞生长曲线实验
1、所有细胞在基础培养基中，培养至70％-80％汇合度。
2、加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞。加入基础培养基中和，混匀，离心后弃上清。用基础培养基重悬，重悬后用Muse细胞计数仪进行计数。
3、根据计数结果进行稀释，最终稀释为3万个细胞/ml。
4、混匀后接种96孔板，每组细胞接种5板，每个时间点每种细胞5孔，每孔细胞悬液3000个/100μl，37℃、5％CO2静置培养。
5、分别与0h、24h、48h、72h和96h后，用CCK8检测细胞活力：其中0h时每孔直接加入10μl CCK8，37℃孵育两h后，酶标仪测定450nm处的吸光度；其余四个时间段按照100μl基础培养基加入10μl CCK8的比例配制工作液，37℃孵育两h后，酶标仪测定450nm处的吸光度。
6、根据5个时间点的吸光度值绘制细胞生长曲线，结果如图2所示。
与801D-E6和801D-F11细胞比较，801D-A10细胞与801D-F4细胞生长速度相近，生长速度均明显升高，有统计学差异(p<0.05)。
与801D-E6和801D-F11细胞比较，801D-F4细胞与801D-H10细胞生长速度相近，生长速度均明显升高，有统计学差异(p<0.05)。
与801D-F4和801D-H10细胞比较，801D-E6细胞与801D-F10细胞生长速度相近，生长速度均明显减慢，有统计学差异(p<0.05)。
与801D-E6和801D-F11细胞比较，801D-H10细胞与801D-A10细胞生长速度相近，生长速度均明显升高，有统计学差异(p<0.05)。
与801D-F4和801D-H10细胞比较，801D-F10细胞与801D-F11细胞生长速度相近，生长速度均明显减慢，有统计学差异(p<0.05)。
与801D-F4和801D-A10细胞比较，801D-F11细胞与801D-F10细胞生长速度相近，生长速度均明显减慢，有统计学差异(p<0.05)。
二、集落形成实验
1、所有细胞在基础培养基中，培养至70％到80％汇合度。
2、加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞。加入基础培养基，混匀，离心后弃上清。用基础培养基重悬，重悬后用Muse细胞计数仪进行计数。
3、根据计数结果进行稀释，最终稀释为3000个细胞/ml。
4、混匀后接种于6孔板，每种细胞三孔，含有基础培养基300个/2ml/孔。
5、37℃、5％CO2静置培养，7～9天后观察。
6、弃去细胞培养上清，用PBS洗涤2次，加入2ml 2％龙胆紫染液，染色30min。
7、自来水缓慢冲洗，洗去多余的龙胆紫染液，空气干燥，如图3所示。
8、显微镜下对大于50个细胞的集落进行计数，结果显示：
801D-A10和801D-F4细胞集落数明显多于801D-E6和801D-F11细胞，有统计学差异(P<0.05)。
801D-F4和801D-H10细胞集落数明显多于801D-E6和801D-F11细胞，有统计学差异(P<0.05)。
801D-F4和801D-H10细胞集落数明显多于801D-E6和801D-F10细胞，有统计学差异(P<0.05)。
801D-H10和801D-A10细胞集落数明显多于801D-E6和801D-F11细胞，有统计学差异(P<0.05)。
801D-F4和801D-H10细胞集落数明显多于801D-F10和801D-F11细胞，有统计学差异(P<0.05)。
801D-F4和801D-A10细胞集落数明显多于801D-F11和801D-F10细胞，有统计学差异(P<0.05)。
三、BALB/c裸鼠皮下成瘤实验
1、将不同细胞在基础培养基中，培养至70％到80％汇合度。
2、加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞。加入基础培养基，混匀，离心后弃上清。用基础培养基重悬，重悬后用Muse细胞计数仪进行计数。
3、根据计数结果进行稀释，最终稀释为1.0×107/ml。
4、准备相应数量的BALB/c雌性裸鼠，周龄4-6周。
5、细胞悬液混匀后，接种于裸鼠腋下，每个部位注射细胞悬液200万/200ul细胞，每种细胞接种5～6只。
6、每隔3天或4天观察裸鼠腋下成瘤情况，并测量其长径和短径，计算其体积。
7、当皮下瘤块体积接近1000mm3时，对小鼠采用脱颈致死后，解剖出瘤块，进行称重和拍照。
8、根据肿瘤体积和瘤重进行数据分析。
图4和图5所示，与801D-E6和801D-F11细胞比较，801D-A10和801D-F4细胞移植瘤的生长速度显著升高(P<0.05)，皮下成瘤能力明显增强(P<0.05)。
与801D-E6和801D-F11细胞比较，801D-F4和801D-H10细胞移植瘤的生长速度显著升高(P<0.05)，皮下成瘤能力明显增强(P<0.05)。
与801D-H10和801D-F4细胞比较，801D-F10和801D-E6细胞移植瘤的生长速度显著减慢(P<0.05)，皮下成瘤能力明显降低(P<0.05)。
与801D-E6和801D-F11细胞比较，801D-H10和801D-A10细胞移植瘤的生长速度显著升高(P<0.05)，皮下成瘤能力明显增强(P<0.05)。
与801D-H10和801D-F4细胞比较，801D-F10和801D-F11细胞移植瘤的生长速度显著减慢(P<0.05)，皮下成瘤能力明显降低(P<0.05)。
与801D-A10和801D-F4细胞比较，801D-F11和801D-F10细胞移植瘤的生长速度显著减慢(P<0.05)，皮下成瘤能力明显降低(P<0.05)。
实施例3
6种人大细胞肺癌细胞转移能力的评价
1、将不同细胞在基础培养基中，培养至70％到80％汇合度。
2、加入胰酶消化液，37℃消化约5min，直到细胞完全消化为单个细胞。加入基础培养基，混匀，离心后弃上清。用基础培养基重悬，重悬后用Muse细胞计数仪进行计数。
3、用PBS洗涤细胞3次，根据计数结果进行稀释，最终用PBS稀释为1.0×107/ml。
4、准备相应数量的NOD/SCID雌小鼠，周龄4～6周。
5、细胞悬液混匀后，经尾静脉接种肺癌细胞，每只小鼠注射细胞悬液0.2ml(200万)细胞，每组接种5只。
6、每隔7天，按照150mg/kg剂量腹腔注射荧光素酶，15分钟后，用小动物活体成像系统观察小鼠肺转移情况。
7、于1.5～2个月时，对小鼠采用脱颈致死后，解剖肺组织，进行拍照和福尔马林固定，HE染色观察肺转移情况。
如图6所示，小动物活体成像可见801D-A10和801D-F4组均有4只小鼠出现转移灶，801D-E6和801D-F11组中均未见转移灶。801D-F4组在第28天时，有1只老鼠出现恶液质，左侧大腿出现肿瘤。HE染色显示801D-A10和801D-F4组肺内均出现多个转移灶，801D-E6、801D-F11组中均未见转移灶。由此可见与801D-E6和801D-F11细胞比较，801D-A10和801D-F4细胞转移能力均增强。
如图7所示，小动物活体成像可见801D-F4和801D-H10组均有4只小鼠出现转移灶，801D-E6和801D-F11均未见转移灶。801D-F4组在第28天时，有1只老鼠出现恶液质，左侧大腿出现肿瘤。HE染色显示801D-F4和801D-H10组肺内均出现多个转移灶，801D-E6、801D-F11均未见转移灶。由此可见与801D-E6和801D-F11细胞比较，801D-F4和801D-F11细胞转移能力均减弱。
如图8所示，小动物活体成像可见801D-F4和801D-H10组均有4只小鼠出现转移灶，801D-E6和801D-F10组中，801D-F10有1只小鼠出现转移灶，其它均未见转移灶。801D-F4组在第28天时，有1只老鼠出现恶液质，左侧大腿出现肿瘤。HE染色显示801D-F4和801D-H10组肺内均出现多个转移灶，801D-E6、801D-F10组中，801D-F10有1只小鼠出现转移灶，其它均未见转移灶。由此可见与801D-H10和801D-F4细胞比较，801D-E6和801D-F10细胞转移能力均减弱。
如图9所示，小动物活体成像可见801D-H10、801D-A10组均有4只小鼠出现转移灶，801D-E6和801D-F11中均未见转移灶。HE染色显示801D-H10和801D-A10组肺内均出现多个转移灶。由此可见与801D-E6和801D-F11细胞比较，801D-H10和801D-A10细胞转移能力均增强。
如图10所示，小动物活体成像可见801D-F4和801D-H10组均有4只小鼠出现转移灶，801D-F10和801D-F11组中，801D-F10有1只小鼠出现转移灶，其它均未见转移灶。801D-F4组在第28天时，有1只老鼠出现恶液质，左侧大腿出现肿瘤。HE染色显示801D-F4和801D-H10组肺内均出现多个转移灶，801D-F10、801D-F11组中，801D-F10有1只小鼠出现转移灶，其它均未见转移灶。由此可见与801D-H10和801D-F4细胞比较，801D-F10和801D-F11细胞转移能力均减弱。
如图11所示，小动物活体成像可见801D-F4和801D-A10组均有4只小鼠出现转移灶，801D-E6和801D-F11组中均未见转移灶。801D-F4组在第28天时，有1只老鼠出现恶液质，左侧大腿出现肿瘤。HE染色显示801D-F4和801D-A10组肺内均出现多个转移灶，801D-F11、801D-F10组中均未见转移灶。由此可见与801D-H10和801D-F4细胞比较，801D-F11和801D-F10细胞转移能力均减弱。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (8)

1.恶性表型大细胞肺癌细胞株，其特征在于所述的细胞株中801D-A10、801D-F4和801D-H10细胞株增殖、迁移和侵袭能力强，801D-E6、801D-F10和801D-F11细胞株增殖、迁移和侵袭能力弱。所述的细胞株包含：
保藏号为CGMCC NO:45140的801D-A10；
保藏号为CGMCC NO:45141的801D-F4；
保藏号为CGMCC NO:45139的801D-H10；
保藏号为CGMCC NO:45138的801D-E6；
保藏号为CGMCC NO:45142的801D-F10
和保藏号为CGMCC NO:45143的801D-F11中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的恶性表型大细胞肺癌细胞株，其特征在于：所述的细胞株中801D-A10、801D-F4和801D-H10细胞株增殖和迁移侵袭能力强，801D-E6、801D-F10和801D-F11细胞株增殖和迁移侵袭能力弱。
3.根据权利要求1所述的恶性表型大细胞肺癌细胞株，其特征在于，所述的细胞株的获取方法包括：
将人巨细胞性肺癌细胞801D接种在Transwell小室上层，癌细胞培养后被聚碳酸酯膜分离为3种，分别为：依附于聚碳酸酯膜贴壁生长的癌细胞801D膜、穿过聚碳酸酯膜没有贴壁生长落在24孔板底的癌细胞801D下和未穿过聚碳酸酯膜的癌细胞801D上；
3种细胞分别培养，消化、重悬后单细胞培养并扩增，筛选得到801D-A10、801D-F4、801D-H10、801D-E6、801D-F10和801D-F11单克隆。
4.根据权利要求1所述的恶性表型大细胞肺癌细胞株，其特征在于，所述的细胞株中：
801D-A10和801D-F4为801D附于聚碳酸酯膜贴壁生长的单克隆；
801D-E6和801D-H10为801D未穿过聚碳酸酯膜的单克隆；
801D-F10和801D-F11未801D穿过聚碳酸酯膜没有贴壁生长落在24孔板底的单克隆。
5.恶性表型大细胞肺癌细胞株在肺癌研究中的应用。
6.恶性表型大细胞肺癌细胞株在肺癌细胞增殖和迁移侵袭能力研究中的应用。
7.一种用于肺癌细胞增殖和转移研究的细胞模型，其特征在于：所述的细胞模型包含801D-A10、801D-F4、801D-H10、801D-E6、801D-F10和801D-F11细胞株中的任意一种。
8.根据权利要求7所述的细胞模型，其特征在于：所述的细胞株中801D-A10、801D-F4和801D-H10细胞株的增殖和迁移侵袭能力强，
801D-E6、801D-F10和801D-F11细胞株的增殖和迁移侵袭能力弱。
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