CN115197157A - 还原响应型的核酸递送载体及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种还原响应型的核酸递送载体及其制备方法、应用，涉及核酸递送的技术领域，本发明的核酸递送载体为阳离子纳米粒子，主要由以下方法制备而成：胱胺、乙二胺与异氰尿酸三缩水甘油酯经氨基‑环氧开环聚合反应后得到核酸递送载体。本发明的制备方法简单高效，解决了阳离子纳米粒子的核酸递送载体功能单一的技术问题，达到了阳离子纳米粒子的核酸递送载体进一步地功能化，具有还原响应键，能够在细胞内特异性地释放核酸，而且能够在细胞内被降解，不仅能够加速释放核酸、提高转染率，还能够降低细胞毒性的技术效果。

Description

还原响应型的核酸递送载体及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及核酸递送的技术领域，尤其是涉及一种还原响应型的核酸递送载体及其制备方法、应用。

背景技术

骨肉瘤是最常见的骨组织原发恶性骨肿瘤，多发于儿童和青少年的股骨远端、胫骨近段或肱骨，因为发病初期的症状与生长痛类似，所以常导致确诊较晚。骨肉瘤的治疗模式一般为“化疗-肿瘤切除-术后辅助化疗”，能够使患者的五年生存率提高到60～70％。然而，骨肉瘤具有高度侵袭性，会转移到肺部及其他骨骼处，在发生转移后，病人的总体五年生存率不及20％。总之，骨肉瘤恶性程度高、好发于青少年，而且致残致死率高，而在目前的治疗模式下，肿瘤的耐药性问题却仍然非常棘手。因此，科研工作者们一直积极地寻求新的骨肉瘤疗法。

miRNA作为mRNA的表达调节剂，参与基本细胞过程，例如发育、分化、增殖、衰老和死亡等，人类基因组包含超过1000个miRNA，并且每个miRNA在特定条件下可调节数百个基因，因此癌症的发生也常常与miRNA的失调有关。Diao等人通过分析120名骨肉瘤患者和健康志愿者的血浆发现，骨肉瘤患者血浆中的miR-22表达水平显著低于健康组，并且在骨肉瘤患者中，miR-22的表达水平还与肿瘤大小、临床分期、肿瘤远处转移以及术前化疗的不良反应(例如化疗耐药)相关。针对miR-22治疗骨肉瘤的报道也是层出不穷，例如miR-22可以通过PI3K/AKT/mTOR途径抑制自噬，从而促进骨肉瘤对化疗药顺铂的敏感性；例如miR-22通过靶向HMGB1和抑制HMGB1介导的自噬抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移；例如miR-22通过诱导细胞周期停滞促进骨肉瘤细胞凋亡。因此，miR-22不仅有希望作为骨肉瘤的诊断标志物，还有很大的潜力成为骨肉瘤治疗的靶标。

递送载体是基因治疗中的一个关键环节，其中的病毒载体虽然转染效率高，但是却存在着细胞毒性大、免疫排异以及难以大规模制备等的缺点，而非病毒载体在递送载体领域却备受瞩目，特别是其中的阳离子聚合物基因载体，由于具备免疫原性低、分子结构设计灵活以及后修饰方便等的优点，受到了研究者的广泛关注。Duan等人通过“一锅法”，利用氨基与环氧基的开环反应制备了低毒、高效的多羟基阳离子聚合物基因载体TE，该方法的优点在于制备过程简易、原料价廉易得，但是此载体的功能单一，因此需对其进行进一步功能化，以满足更高的需求。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种还原响应型的核酸递送载体，具有还原响应键，能够在细胞内特异性地释放核酸，不仅能够在细胞内被降解，而且还能够加速释放核酸、提高转染效果，同时降低细胞毒性。

本发明的目的之二在于提供一种还原响应型的核酸递送载体的制备方法，工艺简单，高效。

本发明的目的之三在于提供一种还原响应型的核酸递送载体的应用，具有突出的核酸递送效果。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

第一方面，一种还原响应型的核酸递送载体，所述核酸递送载体为阳离子纳米粒子，结构如下：

第二方面，一种核酸递送载体的制备方法，包括以下步骤：

胱胺、乙二胺与异氰尿酸三缩水甘油酯经氨基-环氧开环聚合反应后得到所述核酸递送载体。

进一步的，所述制备方法包括以下步骤：

胱胺与异氰尿酸三缩水甘油酯的部分环氧基反应后，再加入乙二胺与剩余的环氧基反应，将反应封端，得到所述核酸递送载体。

进一步的，所述制备方法还包括以下步骤：

反应结束后，将反应物加入水中，之后透析截留，再干燥，得到所述核酸递送载体；

优选地，所述干燥包括冷冻干燥。

进一步的，胱胺与异氰尿酸三缩水甘油酯反应的温度为30-50℃，优选为40℃。

进一步的，乙二胺与异氰尿酸三缩水甘油酯的反应温度为50-70℃，优选为60℃。

进一步的，所述反应的溶剂包括DMSO。

第三方面，一种还原响应型的核酸递送载体在递送miRNA中的应用。

进一步的，所述miRNA包括miR-22。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

本发明提供的还原响应型的核酸递送载体，为阳离子纳米粒子，具有双硫键，其为还原响应键，能够在细胞内高浓度GSH的作用下被还原，因此可以在细胞内特异性地释放核酸；同时，本发明特定结构的核酸递送载体，不仅能够在细胞内被降解，加速释放核酸、提高转染效果，而且还能够降低细胞毒性。

本发明提供的还原响应型的核酸递送载体的制备方法，工艺简单，高效。

本发明提供的还原响应型的核酸递送载体的应用，具有突出的核酸递送效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一种实施方式提供的还原响应型的核酸递送载体的合成反应式图；

图2为本发明对比例1提供的核酸递送载体的合成反应式图；

图3为本发明试验例1得到的核酸递送载体TC和TH的¹H NMR谱图；

图4为本发明试验例2得到TEM图像；

图5为本发明试验例3得到琼脂糖凝胶电泳图

图6为本发明试验例4得到的不同质量比的TC/NAs和TH/NAs在Saos-2细胞系和MC3T3-E1细胞系中的细胞毒性示意图；

图7为本发明试验例5得到的不同质量比下的PEI/pDNA和TC/pDNA在Saos-2和MC3T3-E1细胞中的转染效率示意图；

图8为本发明试验例6得到的核酸递送载体TC介导miRNA进入细胞后的荧光图；

图9为本发明试验例7得到的细胞克隆形成结果图；

图10为本发明试验例7得到的CCK-8实验的结果图；

图11为本发明试验例7得到的不同组处理Saos-2细胞后的细胞凋亡实验的结果图；

图12为本发明试验例7得到的细胞凋亡率的统计结果图；

图13为本发明试验例7得到的细胞划痕实验的结果图；

图14为本发明试验例7得到的细胞划痕愈合率的统计结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的第一个方面，提供了一种还原响应型的核酸递送载体，为阳离子纳米粒子，结构如下：

本发明提供的还原响应型的核酸递送载体，为阳离子纳米粒子，具有双硫键，其为还原响应键，能够在细胞内高浓度谷胱甘肽(GSH)的作用下被还原，因此可以在细胞内特异性地释放核酸；同时，本发明特定结构的核酸递送载体，不仅能够在细胞内被降解，加速释放核酸、提高转染效果，而且还能够降低细胞毒性。

根据本发明的第二个方面，提供了一种还原响应型的核酸递送载体的制备方法，包括以下步骤：

胱胺、乙二胺与异氰尿酸三缩水甘油酯经氨基-环氧开环聚合反应后得到核酸递送载体。

本发明提供的制备方法，工艺简单，高效。

在一种优选的实施方式中，本发明的制备方法包括以下步骤：

胱胺与异氰尿酸三缩水甘油酯的部分环氧基反应后，再加入乙二胺与剩余的环氧基反应，将反应封端，得到核酸递送载体。

本发明的制备方法还包括以下步骤：

反应结束后，将反应物加入水中，之后透析截留，再干燥，得到核酸递送载体；

其中，干燥包括但不限于冷冻干燥。

本发明提供的核酸递送载体制备方法，反应的操作工艺简单，而且后处理便捷高效，不仅能够成功制备出目标产物，而且产率高。

在一种优选的实施方式中，胱胺与异氰尿酸三缩水甘油酯反应的温度为30-50℃，其典型但非限制性的温度例如为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，可以优选为40℃；乙二胺与异氰尿酸三缩水甘油酯的反应温度为50-70℃，其典型但非限制性的温度例如为50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，可以优选为60℃。

本发明中所优选的反应温度更有利于提高氨基-环氧开环聚合的反应效果，提高目标产物的产率，得到核酸递送载体。

本发明中，氨基-环氧开环聚合反应对反应的溶剂不作特别限制，只要是能够达到溶解反应物的效果均可使用，例如可以为二甲基亚砜(DMSO)，但不限于此。

一种还原响应型的核酸递送载体的典型制备方法，如图1所示，包括以下步骤：

S1:胱胺以胱胺二盐酸盐的形式存在，反应前应先进行脱盐处理，包括以下步骤：

在烧瓶中先加入二甲基亚砜(DMSO)，然后加入胱胺(Cystaminedihydrochloride)与三乙胺进行反应，之后将混合物转移至离心管中，室温下进行离心分离，取下层澄清液体，即为胱胺的DMSO溶液；

S2:异氰尿酸三缩水甘油酯(TGIC)的环氧基与氨基发生开环聚合形成阳离子纳米粒子，通过一锅反应(One-pot reaction)制备，包括以下步骤：

在圆底烧瓶中，加入胱胺的DMSO溶液和异氰尿酸三缩水甘油酯，充分溶解后，排气，封口膜封口，之后40℃下进行反应；

反应进行一段时间后，将反应温度上升至60℃，同时加入过量的乙二胺进行反应以除去多余的环氧基，将反应封端，同时还可以增加羟基的数目，提高阳离子纳米粒子的水溶性；

上述反应结束后，冷却，之后将其滴加至水中，然后转移至透析膜中，透析，再冷冻干燥，得到阳离子纳米粒子TC，即为还原响应型的核酸递送载体。

本发明提供的核酸递送载体制备方法，反应的操作工艺简单，后处理便捷高效，能够成功地制备得到还原响应型的核酸递送载体。

根据本发明的第三个方面，提供了一种还原响应型的核酸递送载体在递送miRNA中的应用。

miRNA(MicroRNA)，中文名称为微小核糖核酸，在动物和植物中广泛表达，具有抑制靶mRNA转录、翻译或者能够剪切靶mRNA并促进其降解的功能，在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。

本发明提供的还原响应型的核酸递送载体的应用，具有突出的核酸递送效果。

在本发明中，miRNA包括但不限于miR-22。

miR-22可以通过PI3K/AKT/mTOR途径抑制自噬，从而促进骨肉瘤对化疗药物的敏感性，例如miR-22通过靶向HMGB1和抑制HMGB1介导的自噬抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移，miR-22通过诱导细胞周期停滞促进骨肉瘤细胞凋亡。

本发明的还原响应型的核酸递送载体能够递送miR-22到肿瘤细胞中，具有特异性释放强、生物相容性好以及递送效率高的特点。

其中，本发明的还原响应型的核酸递送载体能够介导miR-22转染骨肉瘤细胞(Saos-2细胞)，具有特异性释放、转染效率高以及细胞毒性低的优势；本发明的核酸递送载体介导miR-22转染骨肉瘤细胞，能够取得出色的抗肿瘤效果，不仅能够抑制肿瘤细胞增殖和迁移，还能够促进肿瘤细胞凋亡，并且可以联合抗癌药物例如Volasertib进行治疗，达到增强疗效的目的，有望应用于体内抗肿瘤的治疗。

下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。

实施例1

一种还原响应型的核酸递送载体，为阳离子纳米粒子，记为TC，结构如下：

实施例2

本实施例为实施例1的还原响应型的核酸递送载体的制备方法，包括以下步骤：

A、胱胺以胱胺二盐酸盐的形式存在，反应前先进行脱盐处理，具体为：

在50mL烧瓶中加入7.4mL的二甲基亚砜(DMSO)，然后加入1g胱胺(Cystaminedihydrochloride)与5mL三乙胺，反应4h后，将混合物转移至50mL的离心管中，室温，3000rpm下离心2min，取下层澄清液体，为胱胺的DMSO溶液，浓度为0.6mmol/L；

B、异氰尿酸三缩水甘油酯(TGIC)的环氧基与氨基开环聚合形成阳离子纳米粒子，通过一锅反应(One-pot reaction)制备，包括以下步骤：

反应时将环氧基与氨基的物质的量之比控制为1:1，因此在50mL圆底烧瓶中，依次加入5mL胱胺的DMSO溶液(0.6mmol/L)，2mmol异氰尿酸三缩水甘油酯(594mg)，待其充分溶解后，用氮气鼓泡排气7～8min，封口膜封口，40℃下搅拌反应48h，然后将反应温度上升至60℃，用注射器加入过量的乙二胺(1mL)，反应一小时以除去多余的环氧基，将反应封端，同时还可以增加羟基的数目，提高阳离子纳米粒子的水溶性；反应物冷却后，用滴管缓慢地将其滴加至去离子水中，然后转移至透析膜(MWCO＝3500Da)中，透析48h，再冷冻干燥，得到阳离子纳米粒子TC，即为还原响应型的核酸递送载体。

对比例1

本对比例提供的核酸递送载体，为阳离子纳米粒子，结构如下：

本对比例提供的核酸递送载体的合成过程，如图2所示；

本对比例的制备方法与实施例2的区别在于，本对比例将实施例2中的具有双硫键的胱胺替换成己二胺，其他步骤及参数参考实施例2，得到不带双硫键的阳离子纳米粒子TGIC-HMDA(记为TH)，为核酸递送载体。

试验例1

对实施例1和对比例1提供的核酸递送载体TC和TH分别进行核磁表征，得到¹H NMR谱图(核磁频率400MHz)，见图3。

图3中，δ＝2.5～3.3内出现的信号峰说明胱胺与TGIC成功地发生了开环反应，δ＝1.2～1.7内出现的两个信号峰也证明了己二胺与TGIC的成功反应。

对实施例1和对比例1提供的核酸递送载体TC和TH分别进行有机元素的分析，见表1，可见实施例1提供的阳离子纳米粒子TC中的S元素含量为9.15％，证明了胱胺与TGIC的成功反应；对比例1提供的阳离子纳米粒子TH中的C元素含量为46.69％，并且高于阳离子纳米粒子TC中的C元素含量37.49％，也证明了己二胺与TGIC的成功反应。

表1

试验例2

实施例1提供的阳离子纳米粒子TC及其被还原后产物的TEM图像，见图4。

具体的，TC的TEM图像：对未透析的TC进行TEM观察(图4中的a)，发现TGIC与CA在DMSO溶液中反应完成后，TC便形成了聚合物纳米粒子，这可能是由于胱胺的二硫键不稳定，在DMSO溶液中发重排，二硫键断裂形成巯基，然后与其他巯基再重新形成二硫键，聚合物便交联成了纳米粒子；

在透析完成后，将冻干的TC溶于水中，利用透射电镜观察其形态(图4中的b)，发现聚合物TC在水溶液中的形态也是球状纳米粒子，粒径在150nm左右；

由于TC可以响应肿瘤细胞内部的还原环境，因此利用DTT(终浓度为10mmol/L)模拟还原环境，在加入DTT后，通过TEM可以观察到其球状形貌被破坏，聚合物纳米粒子破裂(图4中的c)。

试验例3

琼脂糖凝胶电泳图，见图5，可证明实施例1提供的阳离子纳米粒子TC的还原响应性，具体方法如下：

采用琼脂糖凝胶电泳法测试了实施例1和对比例1提供的阳离子纳米粒子TC和TH对DNA和miRNA的压缩能力，其琼脂糖凝胶电泳图见图5；

由于TC能够响应肿瘤细胞内的GSH环境，因此与核酸络合后，加入DTT再次检测其络合能力；

TC和TH在质量比为1.5时都能够完全抑制核酸的电泳迁移，随后在加入DTT后，TC的双硫键被破坏，电位降低，TC在质量比为4时都不能完全抑制核酸的电泳迁移；

TH由于不具备双硫键，因此在加入DTT后，其络合核酸的能力并未受到影响。

试验例4

以“国际金标”PEI(25kDa)作为对照，对实施例1和对比例1提供的阳离子纳米粒子TC和TH分别进行细胞毒性分析，结果见图6，其表示的是不同质量比的TC/NAs和TH/NAs在Saos-2细胞系和MC3T3-E1细胞系中的细胞毒性。

由图6可知，对比例1提供的阳离子纳米粒子TH在成骨细胞(MC3T3-E1细胞)和骨肉瘤细胞(Saos-2细胞)中均显示出了很高的细胞毒性，这是由于TH碳链长且不易降解；而实施例1提供的阳离子纳米粒子TC几乎没有细胞毒性，一方面是由于TC丰富的羟基屏蔽掉了一部分正电荷，另一方面是因为TC具有优异的降解性能，在被降解后，纳米粒子破裂，分子量变小，很容易被排出细胞，因此对细胞造成的影响小。

由此可知，实施例1提供的阳离子纳米粒子TC具有低的细胞毒性，因此能够作为一种有前景的核酸递送载体。

试验例5

转染效率是评价核酸递送载体递送能力的关键因素之一。

本试验例用pRL-CMV(pDNA)作为报告基因，测试了PEI和实施例1提供的阳离子纳米粒子TC在骨肉瘤细胞(Saos-2细胞)和成骨细胞(MC3T3-E1细胞)中的转染能力。

在Saos-2细胞和MC3T3-E1细胞中，首先测试了PEI的转染能力，结果见图7中的a(不同氮磷比下的PEI/pDNA在Saos-2和MC3T3-E1细胞中的转染效率)，结果显示：PEI在两种细胞系中的最佳转染氮磷比都为10。

以PEI的最佳转染氮磷比作为对照，测试阳离子纳米粒子TC在两种细胞系中的转染效率，结果见图7中的b(以N/P＝10的PEI/pDNA作对照，不同质量比下的TC/pDNA在Saos-2和MC3T3-E1细胞中的转染效率)，结果显示：随着质量比的增大，TC在两种细胞系中的转染效率先上升后下降，在Saos-2细胞中，最佳质量比为10。转染效率变化的原因为：随着质量比的增大，阳离子纳米粒子TC与pDNA络合的更加紧密，更有利于细胞内吞，然而当质量比增大到一定程度时，复合物表面多余的正电荷也会增加，不仅会增大pDNA的释放难度，也会增大细胞毒性，因此导致转染效率随之下降。

值得一提的是在两种细胞转染效率的比较中，N/P＝10的PEI/pDNA复合物的转染效率在同一数量级，然而在最佳质量比下TC/pDNA复合物的转染效率却有显著性差异，其在Saos-2细胞中的转染效率比在MC3T3-E1中的转染效率要高两个数量级还多，推测是因为Saos-2细胞作为癌细胞，其GSH含量是MC3T3-E1细胞的五倍多(见图7中的c，Saos-2细胞和MC3T3-E1细胞中的GSH含量比较)，因此具有双硫键的TC在Saos-2细胞中更易被还原，被还原的TC电位降低，进而能够更快、更彻底地释放pDNA，因此在Saos-2细胞中的转染效率更高。

试验例6

利用qRT-PCR技术计算在实施例1提供的递送载体阳离子纳米粒子TC的介导下，进入Saos-2细胞的miR-22的含量，结果见图8(质量比为10时，TC/miRNA转染后的Saos-2细胞内的miR-22的相关含量)，结果显示，相比于未处理的细胞(Control)和TC/miR-NC组，TC/miR-22组在TC介导下，细胞内的miR-22含量是两个对照组的200多倍，说明TC成功将miR-22递送进了细胞内，成功构建了过表达miR-22的Saos-2细胞。

试验例7

本试验例在体外利用实施例1提供的核酸递送载体TC递送miR-22开展抗肿瘤实验，具体方法如下：

首先进行了细胞克隆形成实验，如图9的细胞克隆形成结果所示，当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆，克隆形成率反应了细胞群体依赖性和增殖能力两个重要形状；经过10天的克隆后，结果显示，TC/miR-22组的结晶紫聚集明显减少，说明TC介导miR-22转染Saos-2细胞能够有效抑制骨肉瘤细胞的增殖；

CCK-8实验也验证了这一点，如图10所示，结果显示，在转染细胞的第72h，miR-22组在450nm处的吸光度低于所有对照组；

随后的细胞凋亡实验，如图11(不同组处理Saos-2细胞后的细胞凋亡实验)所示和图12(细胞凋亡率的统计结果)所示，也验证了这一点，TC/miR-22在转染细胞72h后结果显示，与对照组相比，细胞凋亡率明显升高，达到了8.77％；

最后，细胞划痕实验，如图13(细胞划痕实验)和图14(划痕愈合率统计结果)所示，表征miR-22抑制Saos-2细胞运动的能力，结果显示，miR-22在转染细胞48h后，Saos-2细胞的运动能力受到了明显抑制。

以上结果表明，使用实施例1的核酸递送载体TC介导miR-22转染骨肉瘤细胞，取得了良好的抗肿瘤效果，不仅能抑制肿瘤细胞增殖和迁移，还能促进肿瘤细胞凋亡。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种还原响应型的核酸递送载体，其特征在于，所述核酸递送载体为阳离子纳米粒子，结构如下：

2.一种权利要求1所述的核酸递送载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

胱胺、乙二胺与异氰尿酸三缩水甘油酯经氨基-环氧开环聚合反应后得到所述核酸递送载体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

胱胺与异氰尿酸三缩水甘油酯的部分环氧基反应后，再加入乙二胺与剩余的环氧基反应，将反应封端，得到所述核酸递送载体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：

反应结束后，将反应物加入水中，之后透析截留，再干燥，得到所述核酸递送载体；

优选地，所述干燥包括冷冻干燥。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，胱胺与异氰尿酸三缩水甘油酯反应的温度为30-50℃，优选为40℃。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，乙二胺与异氰尿酸三缩水甘油酯的反应温度为50-70℃，优选为60℃。

7.根据权利要求2-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述反应的溶剂包括DMSO。

8.一种权利要求1所述的还原响应型的核酸递送载体在递送miRNA中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述miRNA包括miR-22。

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