CN115181788A - 一种rna水平的抗辐射药物筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种RNA水平的抗辐射药物筛选方法，在筛选待检测药物时，提取经辐射后用药的细胞RNA，进行逆转录PCR，通过PCR产物电泳结果是否出现非特异性条带作为判断该药物是否具有抗辐射作用的依据，如果没有出现非特异性条带，则说明该药物具有抗辐射作用；如果出现非特异性条带，则说明该药物没有抗辐射作用。本发明从RNA水平检测抗辐射药物的作用，更加敏感；能够瞬间锁定处理因素带来的细胞状态的改变，操作难度低，重复性强；且结果判定简单明确，避免主观因素，判定非常客观；可为新的抗辐射药物的研发提供有力支撑。
Description
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种RNA水平的抗辐射药物筛选方法，通过提取细胞RNA，进行反转录PCR，然后通过电泳就能判断出该药物是否具有抗辐射功能。
背景技术：
随着科技的发展，核技术在军事、医疗、民用领域中的应用愈加广泛，带来巨大福利的同时，也伴随着潜在的威胁。机体如果在短时间内接受大剂量的辐射，会引发急性放射病。对于突发性核辐射事故，治疗原则是初期给予抗辐射药物，之后给予造血为中心的综合性对症治疗。然而由于缺乏有效的对抗辐射、减少辐射对机体的损害的急救性药物，目前基本上限于对症治疗和支持治疗。近年来也发现了一些抗放药物，如氨磷汀(WR2721)、5-雄烯二醇(5-AED)、染料木黄酮(BIO300)等，均存在有效时窗窄、副作用严重、防护效果有限、需要其它复杂医疗措施支持等缺点，因此仍需要研发安全有效的急救性药物。
大剂量辐射对机体的早期作用是引发生物大分子的损伤，其中核酸(DNA和RNA)是最为敏感部分。对于辐射导致的细胞损伤以及抗辐射药物作用的观察，最快速和直接的是针对核酸损伤和修复程度的检测。如果药物在辐射初期能够逆有效转核酸的损伤，则可以作为备选的抗辐射药物进行进一步测试。
目前核酸损伤层面的检测多集中在DNA断裂检测方面。主要包括单细胞凝胶电泳技术(SCGE)和免疫荧光法检测γH2AX焦点技术。
单细胞凝胶电泳技术(SCGE)：一种在单细胞水平检测DNA损伤程度的方法。在载玻片上用少量琼脂糖凝胶包埋单个分散细胞，细胞经裂解、解旋和电泳后，断裂的DNA在电场力作用下向阳极移动，经荧光染料染色，在荧光显微镜下观察彗星样图像。该方法存在操作复杂，技术较难掌握，成功率低，检测周期长，重复性差等缺点，实验过程中对细胞DNA频繁操作，加大了DNA链断裂的风险，难以真实反映处理因素所对应的DNA损伤情况。
免疫荧光法检测γH2AX焦点技术：它是根据DNA双链断裂(double strandbreaks，DSBs)可以诱生γH2AX(组蛋白H2A家族成员X的第139位丝氨酸磷酸化即为γH2AX)，并且γH2AX的量和DSBs的量存在相关关系这一事实，利用γH2AX的特异性荧光抗体和荧光显微镜，检测γH2AX焦点形成情况进而对DNA损伤情况进行分析判定。该方法结果判定客观性差。因为焦点大小和荧光强度在不同条件下会发生变化；同时在分析结果时，不仅要分析焦点的多少，同时也要充分考虑焦点的大小及强度；而且，如果焦点较多会出现重叠，很难数清焦点数量。结果判断依赖主观因素较多，难以做到绝对客观。
以上均是对DNA水平的检测。在生物体内，DNA、RNA、多肽作为中心法则的元素，任何一种元素的损伤与修复，都应从其它元素找出相应的变化。RNA种类繁多，功能多样，即可传递遗传信息，也可调控基因表达和细胞功能；而DNA只负责携带遗传信息；相比较而言，RNA对环境的剧烈变化反应更加迅速。本发明从RNA水平检测抗辐射药物的作用，效果更加敏感。
发明内容：
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点，提供一种RNA水平的抗辐射药物筛选方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种RNA水平的抗辐射药物筛选方法，在筛选待检测药物时，提取经辐射后用药的细胞总RNA,进行反转录PCR，通过观察PCR产物电泳结果是否出现非特异性条带作为判断该药物是否具有抗辐射作用的依据，如果没有出现非特异性条带，说明该药物具有逆转核酸损伤的能力，具有抗辐射作用；如果出现非特异性条带，则说明该药物不能有效修复核酸损伤，没有抗辐射作用；具体步骤为：
(1)获取细胞，将其随机分为3组，第一组为无处理组，不对细胞进行任何处理；第二组为辐射组，对细胞进行辐射；第三组为辐射+用药组，对细胞进行辐射后加入待检测药物；
(2)处理后的3组细胞分别提取总RNA，进行反转录PCR；
(3)将PCR产物进行凝胶电泳，无处理组不出现非特异性扩增条带；辐射组会出现>2Kb的非特异性条带；辐射+用药组如果和无处理组一致，没有非特异性条带，说明该药物具有抗辐射能力。
所述细胞为动物细胞株，或动物体内分离细胞。
所述辐射是指进行高能X-ray或240nm-280nm波长紫外线辐射。
所述X-ray辐射的条件和参数：6MV X-ray，照射距离100cm，剂量率6Gy/min，总剂量3.5Gy；紫外线辐射的条件和参数：波长253.7nm，照射距离50cm，照射强度360μw/cm2，照射时间20s。
所述第三组完成辐射后1h加入药物，然后药物作用时间为1h-2h。
所述反转录PCR，可以设计引物扩增β-actin或其他管家基因，作为PCR反应体系和反应条件无误的指示；PCR产物长度控制在350bp-600bp之间。
所述PCR反应体系包括模板和PCR试剂；PCR循环次数为17-24个循环。
所述模板为反转录得到的cDNA，当PCR反应体系25μl时，模板量为0.2μl-1.5μl。
所述PCR反应体系可以不包括引物。
所述PCR循环条件当中，每一个循环包含的延伸时间为30s。
除了上述条件，所述PCR反应的其它反应条件(包括体系用量和循环条件)根据PCR试剂的不同而调整。
在本发明技术方案的基础上，在反转录PCR时，可以设计引物用来扩增待检测药物可能会影响的基因，观察该基因表达受药物的影响。
本发明与现有技术相比，从RNA水平检测抗辐射药物的作用，更加敏感；能够瞬间锁定处理因素带来的细胞状态的改变，操作难度低，重复性强；且结果判定简单明确，避免主观因素，判定非常客观；该方法具备高度的敏感性、客观性、简便性和可重复性，可为新的抗辐射药物的研发提供有力支撑。
附图说明：
图1为本发明涉及的实施例1小鼠巨噬细胞RAW264.7经过高能X-ray辐射后各组细胞的RT-PCR产物电泳结果示意图，其中A表示非特异性条带。
图2为本发明涉及的实施例2经辐射后的小鼠巨噬细胞RAW264.7的反转录PCR产物电泳结果的非特异性条带来源分析示意图；其中A表示非特异性条带；B表示特异性条带。
图3为本发明涉及的实施例3KM小鼠腹腔巨噬细胞经过紫外线辐射后各组细胞RT-PCR产物电泳结果示意图，其中A表示非特异性条带。
图4为本发明涉及的实施例4C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞经过X-ray辐射后各组细胞RT-PCR产物电泳结果示意图，其中A表示非特异性条带。
具体实施方式：
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例涉及RNA水平的抗辐射药物筛选方法，具体步骤如下：
(1)细胞和试剂
小鼠巨噬细胞株RAW264.7由中国科学院干细胞库提供。细胞培养液为DMEM高糖培养基(Gibco)，含有10％胎牛血清(Gibco)以及1％hepes(索莱宝)。反转录PCR所用主要试剂包括总RNA提取试剂TRIzolTMReagent(Invitrogen)、反转录试剂PrimeScriptTMRT reagentKit with gDNA Eraser(Takara)、PCR试剂2×Hieff
Master Mix(with dye)(YEASEN)。
(2)细胞准备
自-80℃冰箱拿出一支冻存细胞，复苏后传代至状态良好，接种6孔板，接种密度1.25*105个/cm2。在37℃、5％CO2环境下用细胞培养液培养3h；细胞随机分为3组：1)无处理组，不辐射不用药；2)辐射组，只辐射，不用药；3)辐射+用药组，辐射后加入抗辐射药物，所述药物为重组小鼠白细胞介素-12(rmIL-12)；
(3)高能X射线辐射及用药
X射线辐射参数：6MV X射线，照射距离100cm，剂量率6Gy/min，照射剂量3.5Gy；在辐射后1h，辐射+用药组加入待测试的药物：重组小鼠白细胞介素12(rmIL-12)至终浓度1ng/ml，其他两组加入相同体积0.1％BSA PBS溶剂；三组分别处理结束后，继续放置到37℃、5％CO2环境中培养1h；
(4)RT-PCR
用TRIzolTMReagent提取每组细胞的总RNA：冰上操作，倒出培养液，滤纸上吸干剩余培养液，倒入TRIzolTMReagent1ml，注意操作要快速，以保证每组同步进行；其余按照说明操作提取总RNA，最终溶解在25μl无RNA酶纯水中；反转录除了延伸时间改为1h，其它完全参照反转录试剂说明书进行，得到cDNA。由于巨噬细胞受到不同刺激，会发生不同极化方式，不同极化方式伴随TNF、IL-6等基因的表达改变，据此设计引物(见表1)对各组cDNA进行PCR扩增，观察相关TNF、IL-6基因表达情况，以β-actin作为参照基因；PCR反应体系为：模板0.2μl(cDNA)、上下游引物各10pM或者0pM、2xHieff PCR Master Mix 12.5μl、加水补齐至25μl。循环条件：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、19个循环；72℃延伸10min。
表1引物序列及扩增片段长度
(5)琼脂糖凝胶电泳结果
PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：PCR产物2μl上样，60V，40min，结果见图1(图中1：Takara DL5000 DNA marke；2-5为辐射+用药组(2为不加引物，3为加入TNF引物，4为加入IL-6引物，5为加入β-actin引物)；6-9为辐射组(6为不加引物，7为加入TNF引物，8为加入IL-6引物，9为加入β-actin引物)；10-13为无处理组(10为不加引物，11为加入TNF引物，12为加入IL-6引物，13为加入β-actin引物)；14.Takara DL2000.DNA marker)。
从图1可见，无处理组(泳道10-13)除了特异性条带之外并无非特异性条带；而辐射组(泳道6-9)均能扩增出非特异性条带；而且有没有引物不影响非特异性条带的形成。辐射+用药组(泳道2-5)经过rmIL-12处理后，非特异性条带消失，说明rmIL-12具有核酸修复能力，具有抗辐射作用。所以，在筛选待检测药物时，PCR产物电泳结果是否出现非特异性条带作为判断该药物是否具有抗辐射作用的依据，如果没有出现非特异性条带，则说明该药物具有抗辐射作用；如果出现非特异性条带，则说明该药物没有抗辐射作用。
图1中的特异性条带是由加入的引物产生的，对判断待测药物是否具有抗辐射作用没有任何影响。
实施例2：
本实施例涉及经辐射后的细胞的反转录PCR产物电泳结果非特异性条带来源分析，具体步骤如下：
(1)细胞和试剂
小鼠巨噬细胞株RAW264.7由中国科学院干细胞库提供。细胞培养液为DMEM高糖培养基(Gibco)，含有10％胎牛血清(Gibco)以及1％hepes(索莱宝)。反转录PCR所用主要试剂包括总RNA提取试剂TRIzolTMReagent(Invitrogen)、反转录试剂PrimeScriptTMRT reagentKit with gDNA Eraser(Takara)、PCR试剂2×Hieff
Master Mix(with dye)(YEASEN)。
(2)细胞准备
自-80℃冰箱拿出一只冻存细胞，复苏后传代至状态良好，接种6孔板，接种密度1.25*105个/cm2。37℃、5％CO2培养3h；
(3)高能X-ray辐射
6MV X射线，辐射距离100cm，剂量率6Gy/min，照射剂量3.5Gy，继续放置到37℃、5％CO2培养1h；
(4)RT-PCR
用TRIzolTMReagent提取经过辐射的细胞的总RNA：冰上操作，倒出培养液，滤纸上吸干剩余培养液，倒入TRIzolTMReagent1ml。其余按照说明操作，最终溶解在25μl无RNA酶纯水中。反转录除了延伸时间改为1h，其它完全参照反转录试剂说明书进行，得到cDNA。设计引物(表2)以受辐射细胞的cDNA为模板对β-actin进行PCR扩增。设计不同的PCR反应体系及不同的循环条件进行PCR扩增，目的确定非特异性条带来源及特性。设计3种反应体系，反应体系A为：模板0.4μl(cDNA)、上下游引物各10pM、2xHieff PCR Master Mix12.5μl、加水补齐至25μl；反应体系B为：模板0.4μl(cDNA)、2xHieff PCR Master Mix 12.5μl、加水补齐至25μl(不含引物)；反应体系C为：模板0.4μl(cDNA)，加水补齐至25μl(只有模板)。设计3种循环条件，循环条件A为：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、24个循环；72℃延伸10min；B为：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、21个循环；72℃延伸10min；循环条件C为：室温放置。
(5)琼脂糖凝胶电泳结果
PCR产物2μl上样，进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：60V，40min，结果见图2，图2中1为Takara DL5000 DNA marker；2为反应体系A+循环条件A；3为反应体系A+循环条件B；4为反应体系B+循环条件B；5为反应体系B+循环条件C；6为反应体系C+循环条件B；7为反应体系C+循环条件C；8为Takara DL2000 DNA marker。
从图2可见，非特异性条带不是来自模板(cDNA)(泳道6、7)，是在PCR试剂参与下、通过PCR循环形成的(泳道4与泳道5对比可知)，分子量>2kb，且不需要引物参与(泳道4)。而且，非特异性条带位置不是固定的，随着特异性产物的生成、特异性条带的增强而逐渐下移(泳道2和3和4对比可知)。
图2中的特异性条带是由加入的引物产生的，对判断待测药物是否具有抗辐射作用没有任何影响。
实施例3：
本实施例涉及RNA水平的抗辐射药物筛选方法，具体步骤如下：
(1)试剂
细胞培养液为DMEM高糖培养基(Gibco)，含有10％胎牛血清(Gibco)以及1％hepes(索莱宝)；反转录PCR所用主要试剂包括总RNA提取试剂TRIzolTMReagent(Invitrogen)、反转录试剂PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(takara)、PCR试剂；2×Hieff
Master Mix(with dye)(YEASEN)；
(2)分离培养小鼠腹腔巨噬细胞
小鼠为济南昆鹏提供的SPF级KM小鼠，8周龄；小鼠断颈处死，加入75％酒精浸泡10s，沥干后用钉子固定到泡沫板上，加入6mlNS，腹部按摩2min，吸出5ml，4℃200g10min后，去上清，加入1ml细胞培养液重悬细胞，计数并接种6孔板，接种密度2*105个/cm2；37℃、5％CO2培养箱培养4h后，加入37℃预热无钙镁hanks液2ml洗涤2次之后，加入3ml细胞培养液；换完液后，放入37℃、5％CO2培养箱培养1h；细胞随机分为3组：1)无处理组，不辐射不用药；2)辐射组，只辐射，不用药；3)辐射+用药组，辐射后加入抗辐射药物rmIL-12；
(3)紫外线辐射
253.7nm波长UVC紫外线为杀菌用紫外线，这一波段紫外线对细菌和细胞中的DNA和RNA分子结构具有巨大杀伤力，因此也可以用来观察对细胞的遗传物质的损伤以及修复药物的作用。照射条件：波长253.7nm，照射距离50cm，照射强度360μw/cm2，照射时间20s。照射完毕，放入孵箱，继续培养1h；
(4)加入待测试药物
辐射完成后，辐射+用药组加入药物rmIL-12至终浓度10ng/ml；辐射组和无处理组分别加入相同体积的0.1％BSA PBS；三组继续培养2h；
(5)RT-PCR
用TRIzolTMReagent提取每组细胞的总RNA：冰上操作，倒出培养液，滤纸上吸干剩余培养液，倒入TRIzolTMReagentzol1ml，注意操作要快速，以保证每组同步进行；其余按照说明操作提取总RNA，最终溶解在25μl无RNA酶水中；
总RNA反转录成为cDNA，反转录延伸时间改为1h，其它完全参照反转录试剂说明书进行；
由于巨噬细胞受到不同刺激，会发生不同极化方式，不同极化方式伴随NOS2、Arg1、TNF等基因的表达改变，据此设计引物(表3)对各组cDNA进行PCR扩增，观察上述基因的表达情况，以β-actin作为参照基因；反应体系为：模板1.5μl(cDNA)，上下游引物各10pM，2xHieff PCR Master Mix 12.5μl，加水补齐至25μl；循环条件：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、19个循环；72℃延伸10min。
表3引物序列及扩增片段长度
(6)琼脂糖凝胶电泳结果
PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：PCR产物2μl上样，60V，40min，结果见图3(图中1为.Takara DL5000 DNA marker；2-5为无处理组(2为TNF引物，3为NOS2引物，4为Arg1引物，5为βactin引物)；6-9为辐射组(6为TNF引物，7为NOS2引物，8为Arg1引物，9为βactin引物)；10-13为:辐射+用药组(10为TNF引物，11为NOS2引物，12为Arg1引物，13为βactin引物)；14为Takara DL2000 DNA marker)。
从图3可以看出，无处理组(泳道2-5)没有非特异条带；辐射组(泳道6-9)无论能否扩增出特异条带，均显示有分子量>2kb的非特异条带，且特异性条带的位置随着特异性扩增产物的出现和增强而下移；辐射+用药组(泳道10-13)经过rmIL-12处理后，不再出现非特异条带，和无处理组结果一致，说明rmIL-12有逆转核酸辐射损伤的作用，具有抗辐射能力。
图3中的特异性条带是由加入的引物产生的，对判断待测药物是否具有抗辐射作用没有任何影响。
实施例4：
本实施例涉及RNA水平的抗辐射药物筛选方法，具体步骤如下：
(1)试剂
细胞培养液为DMEM高糖培养基(Gibco)，含有10％胎牛血清(Gibco)以及1％hepes(索莱宝)。反转录PCR所用主要试剂包括总RNA提取试剂RNAiso Plus(Takara)、反转录试剂PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(takara)。PCR试剂：高保真酶
GXL DNA Polymerase(Takara)；
(2)分离培养小鼠腹腔巨噬细胞
小鼠为济南昆鹏提供的SPF级C57BL/6小鼠，8周龄。小鼠断颈处死，加入75％酒精浸泡10s，沥干后用钉子固定到泡沫板上，加入5mlNS，腹部按摩2min，吸出4.5ml，4℃200g10min后，去上清，加入1ml细胞培养液重悬细胞，计数并接种6孔板，接种密度2*105个/cm2。37℃、5％CO2培养箱培养2h后，加入37℃预热无钙镁hanks液2ml洗涤2次之后，加入3ml培养液。换完液后，放入37℃、5％CO2培养箱培养1h。细胞随机分为3组：1)无处理组，不辐射不用药；2)辐射组，只辐射，不用药；3)辐射组+用药组，加入抗辐射药物rmIL-12；
(3)高能X-ray辐射及用药
辐射条件：6MV X射线，辐射距离100cm，剂量率6Gy/min，总剂量3.5Gy。辐射后1h，辐射+用药组加入rmIL-12至终浓度为1ng/ml，其它两组组加入相应体积的含有0.1％BSAPBS对照；三组继续37℃、5％CO2培养1h；
(4)RT-PCR
用RNAiso Plus提取每组细胞的总RNA：冰上操作，倒出培养液，滤纸上吸干剩余培养液，倒入RNAiso Plus1ml，注意操作要快速，以保证每组同步进行。其余按照说明操作提取总RNA，最终溶解在25μl无RNA酶纯水中；
总RNA反转录成cDNA按照反转录试剂说明书操作。由于巨噬细胞受到不同刺激，会发生不同极化方式，而不同极化方式伴随IL-1β等基因的表达改变，同时为了观察药物对放射导致细胞凋亡的影响。设计引物(表4)对各组cDNA进行PCR扩增，观察极化方式相关基因IL-1β以及凋亡相关基因Caspase3、Caspase8的表达情况，以β-actin作为参照基因。反应体系为：模板1.5μl(cDNA)，上下游引物各10pM，5×PrimeSTAR GXL buffer 5μl，dNTPMixture 2μl，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase0.5μl，加水补齐至25μl；循环条件：98℃预变性5min；98℃变性10s、60℃退火15s、68℃延伸30s、17个循环；72℃延伸10min。
表4引物序列及扩增片段长度
(5)琼脂糖凝胶电泳结果
PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：PCR产物2μl上样，70V，30min，结果见图4(图中，1为Takara DL5000 DNAmarker；2-5为辐射+用药组(2为加入IL-1β引物，3为加入caspase8引物，4为加入caspase 3引物，5为加入β-actin引物)；6-9为辐射组(6为加入IL-1β引物，7为加入caspase8引物，8为加入caspase 3引物，9加入为β-actin引物)；10-13为未处理组(10为加入IL-1β引物，11为加入caspase8引物，12为加入caspase3引物，13为加入β-actin引物)；14为Takara DL2000 DNAmarker)。
从图4可以看出，辐射组(泳道6-9)无论能否扩增出特异性条带，均显示有>2kb的非特异性条带；辐射+用药组(泳道2-5)，辐射后经过rmIL-12作用后，非特异性条带消失，电泳结果与无处理组(泳道10-13)一致。说明rmIL-12能够修复辐射损伤的核酸，具有抗辐射作用。
图4中的特异性条带是由加入的引物产生的，对判断待测药物是否具有抗辐射作用没有任何影响。
上述实施例1-4说明，用RNA筛选抗辐射药物时，不受引物的影响，无论有无引物，均能判断待测药物是否具有抗辐射作用。本发明用RNA筛选抗辐射药物的方法，其药物是否具有抗辐射作用的判断依据只与非特异性条带有关。
Claims (10)
1.一种RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，在筛选待检测药物时，提取经辐射后用药的细胞RNA，进行反转录PCR，通过PCR产物电泳结果是否出现非特异性条带作为判断该药物是否具有抗辐射作用的依据，如果没有出现非特异性条带，则说明该药物具有抗辐射作用；如果出现非特异性条带，则说明该药物没有抗辐射作用。
2.根据权利要求1所述的RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)获取细胞，将其随机分为3组，第一组为无处理组，不对细胞进行任何处理；第二组为辐射组，对细胞进行辐射；第三组为辐射+用药组，对细胞进行辐射后加入待检测药物；
(2)处理后的3组细胞分别提取总RNA，进行反转录PCR；
(3)将PCR产物进行凝胶电泳，电泳结果显示，无处理组不出现非特异性扩增条带；辐射组会出现>2Kb的非特异性条带；如果辐射+用药组没有出现非特异性条带，则说明该药物具有抗辐射能力。
3.根据权利要求2所述的RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，所述细胞为动物细胞株或动物体内分离细胞。
4.根据权利要求2所述的RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，所述辐射是指进行高能X-ray或240nm-280nm波长紫外线辐射。
5.根据权利要求4所述的RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，所述X-ray辐射的条件和参数：6MV X-ray，照射距离100cm，剂量率6Gy/min，总剂量3.5Gy；紫外线辐射的条件和参数：波长253.7nm，照射距离50cm，照射强度360μw/cm2，照射时间20s。
6.根据权利要求2所述的RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，所述第三组完成辐射后1h加入药物，然后药物作用时间为1h-2h。
7.根据权利要求1或2任一所述的RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，所述反转录PCR时，设计引物扩增管家基因，作为PCR反应体系和反应条件无误的指示；PCR产物长度控制在350-600bp之间。
8.根据权利要求1或2任一所述的RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，所述PCR反应体系包括模板和PCR试剂；PCR循环次数为17-24个循环，每一个循环包含的延伸时间为30s。
9.根据权利要求1或2任一所述的RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，所述PCR反应体系不包括引物。
10.根据权利要求8所述的RNA水平的抗辐射药物筛选方法，其特征在于，所述模板为反转录得到的cDNA，当PCR反应体系25μl时，模板量为0.2μl-1.5μl。
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