CN103555818A - B细胞转位基因2作为低剂量电离辐射生物剂量计的应用 - Google Patents

B细胞转位基因2作为低剂量电离辐射生物剂量计的应用 Download PDF

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钱甜甜
陈伟
王庆蓉
蒋定文
刘玉明
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Abstract

本发明属于电离辐射生物剂量计，具体涉及B细胞转位基因2(B cell translocation gene2，BTG2)作为电离辐射生物剂量计的应用。人淋巴母细胞受到低剂量电离辐射后，以及哺乳动物辐射后外周血淋巴细胞的BTG2基因mRNA水平表达的增加与受到的电离辐射剂量成正比，存在一定的剂量-效应关系，于照射后24h、48h和72h采用实时荧光定量PCR法即可快速简便地定量检测，因此，BTG2可作为低剂量电离辐射范围的生物剂量计，可以采用BTG2基因表达定量分析法对人体和哺乳动物受到低剂量电离辐射的剂量大小进行评估。

Description

B细胞转位基因2作为低剂量电离辐射生物剂量计的应用
1技术领域
本发明属于低剂量电离辐射生物剂量计，具体涉及B细胞转位基因2(B cell translocationgene2，BTG2)作为低剂量范围电离辐射生物剂量计的应用。
2背景技术
低剂量电离辐射暴露的人群和几率远比大剂量照射事件或事故大，如天然本底辐射、频繁的飞行活动、医学检查、不适当的居住环境、职业照射和空间活动等。低剂量电离辐射虽不足以引起临床可见的损伤，但对低剂量暴露人群若不及时采取监测、危害评价和防护措施，会对暴露人员带来远后效应的健康危害，还可能造成人员严重的心理损害等。作为辐射损伤救治和危害评价的重要依据，辐射剂量的准确估算对诊断和治疗有重要的指导作用。目前，辐射生物剂量计的研究已有了长足的发展，但在临床应用中仍存在耗时长、费用高、专业技术要求高等问题，且主要应用范围为较高剂量的辐射损伤。近年来，国内外相关实验室开展了一些新型生物剂量计的研究，也报道了适用于低剂量辐射的生物标志物，如CCNG1(cyclinG1)、FDXR(ferredoxin reductase)基因表达测定等。迄今为止，这些研究尚处于探索阶段，因此，有必要寻找新型、快速、可靠的低剂量电离辐射生物剂量指标。
B细胞转位基因2(B cell translocation gene2，BTG2)又名PC3(pheocromocytoma cell-3)、TIS21(TPA-induced sequence21)，是1991年Bradbury等从PC12细胞CDNA文库中筛选出可被神经生长因子诱导产生的一种分泌型蛋白，具有抗增殖特性，由此得名PC3基因。随后，Herschman等用肿瘤促进剂TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13)作用鼠的NIH3T3细胞株诱导产生了相同的基因序列，并命名为TIS21。1998年，Zhu等用p53和p73诱导表达了与PC3/TIS21同源的人类基因BTG2。BTG2是具有抗增殖作用特性的瞬时早期反应基因，参与了细胞分化、发育、凋亡、肿瘤细胞抑制等各种生理及病理过程并发挥着重要作用。电离辐射导致DNA损伤，诱导BTG2活化，继而抑制周期素D1使细胞周期停滞在G1期，DNA复制被抑制，使受损细胞得到充分修复，同时，抑制周期素D1可活化增殖细胞核抗原(PCNA)共同参与对损伤的DNA的修复。因此，BTG2被认为是联系细胞周期和DNA损伤修复的桥梁。最近有研究报道BTG2可以调节DNA双链断裂(DNA double strand breaks，DSBs)的修复和凋亡，BTG2表达可促进DSBs修复，并通过激活Mre11和PRMT1(protein argininemethyltransferase1)，阻碍磷酸化的ATM(S198)将损伤信号传导至Chk2(T68)和p53(S20)，从而减少细胞凋亡。
3发明内容
本发明目的是提供B细胞转位基因2(B cell translocation gene2，BTG2)作为低剂量电离辐射生物剂量计的应用。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：B细胞转位基因2(B cell translocation gene2，BTG2)作为低剂量电离辐射生物剂量计的应用。
一种检测人或动物所受低剂量范围辐射剂量的方法，包括如下步骤：
(1)按照常规方法培养细胞，将细胞置于已知辐射强度的环境中接受辐射，照后在三个以上时间点收集辐射后细胞，定量检测其B细胞转位基因2的mRNA表达水平，获得该细胞受到的电离辐射剂量和B细胞转位基因2表达水平关系的标准曲线；
(2)分离并收集接受了待测剂量辐射的动物外周血淋巴细胞，测定其中的B细胞转位基因2的mRNA表达水平，根据步骤-(1)获得的标准曲线计算得到该动物所受到的电离辐射剂量。
上述技术方案中，待测细胞可来自细胞株，如人淋巴母细胞，也可来自人或动物的组织细胞，如外周血淋巴细胞。
上述技术方案中，测定细胞中B细胞转位基因2的表达水平的方法是：采用实时荧光定量PCR法测定细胞中B细胞转位基因2的mRNA表达水平。
由于上述技术方案的运用；本发明与现有技术相比具有以下优点：
由于细胞株或动物受到低剂量电离辐射后，其中BTG2含量的增加与受到的电离辐射剂量正相关，存在一定的剂量-效应关系，且于照射后24h即可采用简便易行、定量准确、敏感度高的方法进行快速检测，因此，BTG2可作为低剂量电离辐射生物剂量计，定量检测人或动物受到低剂量电离辐射。
4附图说明
图1为实施例一中指数生长期的AHH-1细胞经不同剂量137Csγ射线照射后BTG2基因表达量随时间变化图；
图2为实施例一中指数生长期的AHH-1细胞经不同剂量137Csγ射线照射后24小时BTG2基因表达量的剂量-效应曲线；
图3为实施例一中指数生长期的AHH-1细胞经不同剂量137Csγ射线照射后48小时BTG2基因表达量的剂量-效应曲线；
图4为实施例一中指数生长期的AHH-1细胞经不同剂量137Csγ射线照射后72小时BTG2基因表达量的剂量-效应曲线。
5具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：不同低剂量电离辐射人淋巴母细胞中BTG2基因表达的剂量-效应关系
1.材料：人淋巴母细胞(AHH-1)由第二军医大学防原医学教研室惠赠；TRlzol reagent和M-MLV反转录酶为Invitrogen公司产品；SYBR Premix Ex Taq为Takara公司产品。
2.细胞培养：AHH-1细胞培养于含10％小牛血清，谷氨酰胺及100万U/L青霉素和链霉素的RPMl1640培养基。细胞置于37℃、5％CO2孵箱中培养，2～3天传代1次，取对数生长期细胞用于辐照。
3.辐照：复旦大学放射医学研究所，Gamma cell40，137Cs(NORDION International Inc.CANADA)，剂量率为0.162Gy/min，剂量为0，0.1，0.2，0.5，0.8，1.0Gy。
4.Real-time PCR法测定人淋巴母细胞中BTG2基因表达的量：
4.1总RNA抽提及cDNA合成：实验组经照射后和未照射对照组细胞置于37℃、5％CO2孵箱中继续培养0h，4h，24h，48h，72h，168h，随后每组样品取1×106细胞，加1ml TRIzol，裂解后提取总RNA，Nanodrop ND-1000检测样品RNA浓度和纯度，进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。用Invitrogen公司的M-MLV反转录酶对抽提的人淋巴母细胞总RNA进行cDNA逆转录合成，逆转录总体积为20ul，总RNA为1ug，引物为OIigo(dT)18，具体操作依据产品说明书。
4.2引物设计：依据NCBI数据库中的β-actin和BTG2基因序列，用Primer premier5软件设计实时荧光定量PCR的相应引物，由上海捷瑞生物工程有限公司(GENEray)合成。
4.3实时荧光定量PCR：采用SYBR实时荧光定量PCR方法，用Chromo4(BIO-RAD公司)实时荧光PCR检测仪，按照用户手册操作。PCR反应程序为：95℃3min；95℃10s；60℃30s；共40个循环。每个样品重复做3个平行样，每次反应结束后进行熔解曲线分析，排除非特异性PCR产物的影响。以β-actin为内参，同时设置空白对照组。
4.4定量方法和统计分析：采用相对定量法，以看家基因β-actin为内参，采用MJOptionMonitor Analysis Software V3.1和Excel软件对结果进行分析。
如图1所示，照射后24h，与未照射组比较，0.1Gy照射组BTG2基因上调2.61倍，0.2Gy照射组BTG2基因上调3.06倍，0.5Gy照射组BTG2基因上调4.41倍，0.8Gy照射组BTG2基因上调5.10倍，1.0Gy照射组BTG2基因上调6.36倍；照射后48h，与未照射组比较，0.1Gy照射组BTG2基因上调2.09倍，0.2Gy照射组BTG2基因上调2.37倍，0.5Gy照射组BTG2基因上调2.92倍，0.8Gy照射组BTG2基因上调3.51倍，1.0Gy照射组BTG2基因上调4.44倍；照射后72h，与未照射组比较，0.1Gy照射组BTG2基因上调2.07倍，0.2Gy照射组BTG2基因上调2.44倍，0.5Gy照射组BTG2基因上调2.83倍，0.8Gy照射组BTG2基因上调3.58倍，1.0Gy照射组BTG2基因上调4.01倍。
结果表明，低剂量电离辐射后24h，受照细胞BTG2基因表达上调，并随照射剂量增加而增加，与照射剂量正相关，呈现出一定的剂量-效应关系(图2)，拟合剂量-效应曲线方程为：y＝4.612x+1.757，R2＝0.939。随着时间的延长，受照细胞BTG2基因表达开始下调，在48h和72h时处于平台期，但仍显著高于未照射组，并与照射剂量正相关，呈现出一定的剂量-效应关系(图3和图4)，拟合剂量-效应曲线方程分别为：y＝2.847x+1.487，R2＝0.928；y＝2.559x+1.545，R2＝0.910。其中Y为BTG2基因在mRNA水平的相对表达量，X为照射剂量(Gy)。
实施例二：不同低剂量电离辐射BaIb/c小鼠外周血淋巴细胞中BTG2基因表达的剂量-效应关系
1.材料：肝素钠；小鼠淋巴细胞分离液为达科为生物技术有限公司产品；TRlzol reagent和M-MLV反转录酶为Invitrogen公司产品；SYBR Premix ExTaq为Takara公司产品。
2.动物分组及处理：20只雄性Balb/c小鼠，体重20±2g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。动物随机分为4组，分别为未照射组、0.1Gy照射组、0.5Gy照射组和1.0Gy照射组，每组5只。各照射组在海军医学研究所辐照室进行照射，放射源为60Co，单次照射，剂量率为0.5Gy/h。
3.分离淋巴细胞：于照射结束后24h，收集照射组和未照射组小鼠的抗凝血，分离淋巴细胞，具体操作依据说明书的操作步骤。
4.Real-time PCR法测定小鼠外周血淋巴细胞中BTG2基因表达的量：
4.1总RNA抽提及cDNA合成：取1×106细胞，加1ml TRIzol，裂解后提取总RNA，Nanodrop ND-1000检测样品RNA浓度和纯度，进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。用Invitrogen公司的M-MLV反转录酶对抽提的外周血淋巴细胞总RNA进行cDNA逆转录合成，逆转录总体积为20ul，总RNA为1ug，引物为OIigo(dT)18，具体操作依据产品说明书。
4.2引物设计：依据NCBI数据库中的β-actin和BTG2基因序列，用Primer premier5软件设计实时荧光定量PCR的相应引物，由上海捷瑞生物工程有限公司(GENEray)合成。
4.3实时荧光定量PCR：采用SYBR实时荧光定量PCR方法，用Chromo4(BIO-RAD公司)实时荧光PCR检测仪，按照用户手册操作。PCR反应程序为：95℃3min；95℃10s；60℃30s；共40个循环。每个样品重复做3个平行样，每次反应结束后进行熔解曲线分析，排除非特异性PCR产物的影响。以β-actin为内参，同时设置空白对照组。
4.4定量方法和统计分析：采用相对定量法，以看家基因β-actin为内参，采用MJOptionMonitor Analysis Software V3.1和Excel软件对结果进行分析。
如表1所示，照射后24h，与未照射组比较，0.1Gy照射组BTG2基因平均上调倍数为2.35，0.5Gy照射组BTG2基因平均上调倍数为3.97，1.0Gy照射组BTG2基因平均上调倍数为6.82；根据上调倍数和实施例一中照射后24h的拟合剂量-效应曲线方程：y＝4.612x+1.757，计算得到各组动物受照射剂量分别为0.129Gy，0.480Gy和1.098Gy。
结果表明，小鼠在低剂量电离辐射后24h，外周血淋巴细胞中BTG2基因表达上调，与照射剂量正相关，呈现一定的剂量-效应关系，根据剂量-效应曲线计算得到的理论受照剂量接近实际受照剂量
表1不同剂量60Coγ射线照射后动物外周血淋巴细胞中BTG2基因表达变化

Claims (6)

1.B细胞转位基因2作为低剂量电离辐射生物剂量计的应用。
2.权利要求1中B细胞转位基因2作为一种快速检测辐射剂量的生物指标，其特征在于，一定时间范围内B细胞转位基因2mRNA表达量与辐射剂量相关。
3.权利要求2中所述辐照剂量特征为低剂量电离辐射。
4.B细胞转位基因2作为低剂量电离辐射生物剂量计的应用，包括如下步骤：
(1)按照常规方法培养离体细胞或饲养哺乳动物，将细胞或动物置于已知辐射强度的环境中接受辐射，照后在三个以上时间点收集辐射后细胞或采集哺乳动物外周血淋巴细胞，定量检测其B细胞转位基因2的mRNA表达水平，获得该细胞或哺乳动物受到的电离辐射剂量和B细胞转位基因2表达水平关系的标准曲线；
(2)收集接受了待测剂量的辐射照射的离体细胞，或将哺乳动物置于待测剂量的环境中接受辐射，照后分离外周血淋巴细胞，测定其B细胞转位基因2的mRNA表达水平，根据步骤(1)获得的标准曲线计算得到该细胞或动物所受的辐射剂量。
5.权利要求4中所述B细胞转位基因2含量也可以联合其他指标，共同估算辐射剂量。
6.权利要求4中所述离体细胞可以来源于细胞株，如人淋巴母细胞，也可来自离体细胞，如人或哺乳动物的外周血淋巴细胞。
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