CN115166085A - 一种测定软胶囊类保健食品中阿藿烯的方法 - Google Patents
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Abstract
一种测定软胶囊类保健食品中阿藿烯的方法，供试品以甲醇为提取和稀释溶剂，经Agilent ZORBAX Eclipse plus C18 R R HD色谱柱（3.0×50 mm，1.8μm）分离，以0.1%的甲酸溶液为流动相A，以乙腈:甲醇:异丙醇（2:3:5）为流动相B，50℃的柱温下梯度洗脱。质谱采用AJS ESI源正模式检测。以保留时间和离子比率进行定性分析，以定量离子对峰面积进行外标法定量分析。阿藿烯在2～400 ng/mL范围内线性相关系数为0.999，相关性较好；平均回收率为98.44%～102.07%，RSD为0.5%～1.0%；检出限为18 ng/g，定量限为54 ng/g。该方法专属性较好、灵敏度较高、检验快速准确，适应于保健食品中阿藿烯的监督检测及质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定软胶囊类保健食品中阿藿烯的方法,属于保健食品检测技术领域。
背景技术
阿藿烯是大蒜素的分解产物，在抗菌消炎、抗血栓、降血脂、抑制肿瘤细胞繁殖、诱导细胞凋亡等方面具有较好的生理功效，是一种天然高效的活性成分，同时，因其与大蒜素相比更为稳定，且无刺激性气味，所以阿藿烯在医药领域、保健食品领域具有更为广阔的应用前景。
大蒜素分解得到的阿藿烯有顺式和反式两种形式，分子式为C9H14OS3，相对分子质量为234.40。因阿藿烯在油中可以较为稳定的保存，所以，目前阿藿烯的口服产品多为软胶囊的形式。现有的研究多集中于如何采用大蒜素、大蒜辣素等分离制备阿藿烯组分，将制备、分离、纯化得到的产物通过红外光谱、核磁共振谱氢谱、碳谱数据进行鉴别，而含有复杂基质的保健食品成品中阿藿烯的提取及定性、定量检测方法未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种软胶囊类保健食品中阿藿烯定性、定量测定的高效液相色谱-串联四级杆质谱方法，为规范阿藿烯类保健食品的投料生产、加强产品中功效成分的监督检查提供技术支持。
供试品以甲醇为提取和稀释溶剂，经Agilent ZORBAX Eclipse plus C18 R R HD色谱柱（3.0×50 mm，1.8 μm）分离，以0.1%的甲酸溶液为流动相A，以乙腈:甲醇:异丙醇（2:3:5）为流动相B，50℃的柱温下梯度洗脱。质谱采用AJS ESI源正模式检测。以保留时间和离子比率进行定性分析，以定量离子对峰面积进行外标法定量分析。
为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：
一种测定软胶囊类保健食品中阿藿烯的方法，包括以下步骤：
S1样品溶液的制备
将软胶囊产品刺破囊壁，取内容物50mg至25 mL量瓶中，加入甲醇15mL，涡旋2min，用甲醇稀释至刻度，充分摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤即得样品溶液。
S2配置标准曲线溶液
用甲醇稀释标准溶液，得到系列标准曲线溶液。
S3 仪器检测
色谱条件
色谱柱采用Agilent ZORBAX Eclipse plus C18 RRHD（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）；流动相A相为0.1%甲酸水溶液；流动相B相为甲醇：乙腈：异丙醇（2:3:5）；流速：0.5 mL/min；进样量：5 μL；柱温：50℃；梯度洗脱（0~1.5 min：80%A→80%A；1.5~5 min：80%A→20%A；5~6.5 min：20%A→20%A；6.5~6.7 min：20%A→80%A；6.7~11min：80%A→80%A）。
质谱条件
质谱采用电喷雾离子源的正离子模式（ESI+），多反应监测（MRM）；碰撞气：高纯氮气；源参数中干燥气温度：300℃；干燥气流量：5L/min；雾化气压力：45 psi；鞘气温度：250℃；鞘气流量：11 L/min；毛细管电压：3000 V；喷嘴电压：500 V；235.0—111.0（m/z）为定量离子对，235.0—144.9（m/z）为定性离子对。
S4定性定量分析
以保留时间和离子比率进行定性分析，以定量离子对峰面积进行外标法定量分析。
本发明的优点和技术效果：
1. 选用既可溶解阿藿烯又可溶解油状样品的甲醇：乙腈：异丙醇（2:3:5）作为流动相B，同时将色谱柱的柱温设为50℃，对可能进入色谱柱中的少量的油状样品进行洗脱，增强对色谱柱的保护。
2. 当阿藿烯浓度为50 ng/mL、基质含量为2mg/mL时，基质效应百分比为99.46%，即呈现极轻微的基质抑制，该基质效应在可接受范围内。
3. 定性离子对和定量离子对的2个通道中均未见有干扰色谱峰，方法的专属性较好。
4.在2～400 ng/mL的线性范围内相关性较好，相关系数为0.999；以235.0—111.0（m/z）的3倍信噪比计算的检出限为16 ng/g；以235.0—111.0（m/z）的10倍信噪比计算的定量限为54 ng/g，灵敏度较高。
4. 平均回收率为98.44%～102.07%，回收率较高；每个水平连进6针的相对标准偏差为0.5%～1.0%，精密度均较好。
附图说明
图1阿藿烯对照品（a）、含有阿藿烯的样品（b）、空白基质（c）、基质加标溶液（d）的提取离子色谱图
其中1（a）为阿藿烯对照品提取离子色谱图，1（b）为含有阿藿烯的样品提取离子色谱图，1（c）为空白基质提取离子色谱图，1（d）为基质加标溶液提取离子色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施例并结合附图对本发明进一步解释和说明。
1 试验部分
1.1 仪器与试剂
Agilent1260 prime-G6470A高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪；ME 204T/02型电子天平；Milli-Q超纯水系统。
对照品储备溶液：精密量取阿藿烯对照品溶液（乙酸乙酯中E/Z-阿藿烯溶液，First Standard提供，批号S105715，浓度100μg/mL）100μL至25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得到400ng/mL的阿藿烯对照品溶液。
标准曲线溶液：分别精密量取400ng/mL的阿藿烯对照品溶液0.5、1、1.25、2、2.5、5、7.5、10 mL至10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线溶液4、5、6、7、8、9、10、11；取标准曲线溶液4，分别精密量取1、2.5、5mL至10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线溶液1、2、3；即得到浓度分别为2、5、10、20、40、50、80、100、200、300、400ng/mL的系列标准曲线溶液。
样品为含有阿藿烯的软胶囊产品。空白基质选用维生素A维生素D软胶囊的内容物。试剂甲醇、乙腈、异丙醇、乙醇、正己烷均为色谱纯，试验用水为超纯水。
1.2 仪器工作条件
1.2.1 色谱条件
色谱柱采用Agilent ZORBAX Eclipse plus C18 RRHD（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）；流动相A相为0.1%甲酸水溶液；流动相B相为甲醇：乙腈：异丙醇（2:3:5）；流速：0.5 mL/min；进样量：5 μL；柱温：50℃；梯度洗脱（0~1.5 min：80%A→80%A；1.5~5 min：80%A→20%A；5~6.5 min：20%A→20%A；6.5~6.7 min：20%A→80%A；6.7~11min：80%A→80%A）。
1.2.2 质谱条件
质谱采用电喷雾离子源的正离子模式（ESI+），多反应监测（MRM）；碰撞气：高纯氮气；源参数中干燥气温度：300℃；干燥气流量：5L/min；雾化气压力：45 psi；鞘气温度：250℃；鞘气流量：11 L/min；毛细管电压：3000 V；喷嘴电压：500 V；阿藿烯的其它参数见表1，其中“*”代表定量离子。
表1 阿藿烯的母离子、子离子、碎裂电压和碰撞能量
Table 1 Precursor ions, product ions, fragmentor and collision energyof ajoene
1.3 试验方法
1.3.1 样品溶液的制备
将软胶囊产品刺破囊壁，取内容物50mg至25 mL量瓶中，加入甲醇15mL，涡旋2min，用甲醇稀释至刻度，充分摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤即得样品溶液。
1.3.2 基质效应和方法专属性的考察
精密称取空白基质50mg至25 mL量瓶中，加标后按照1.3.1制备得到50 ng/mL的基质加标溶液，将其与50 ng/mL的标准曲线用溶液均上机测定，计算两种溶液中阿藿烯的响应值百分比以考察基质效应[13-14]。
精密称取空白基质50mg，按1.3.1方法制备得到空白基质溶液，上机测定，考察方法专属性。
1.3.3 方法的线性、检出限和定量限
将1.1中标准曲线溶液按1.2方法上机测定，以阿藿烯质量浓度（ng/mL）为横坐标，以235.0—111.0（m/z）的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。以235.0—111.0（m/z）的3倍信噪比计算检出限，以235.0—111.0（m/z）的10倍信噪比计算定量限[10]。
1.3.4 方法的回收率和精密度
取空白基质，按照1.3.1的方法精密称取6份至25 mL量瓶中；取其中2份，分别精密加入0.42、0.52mL的 80 ng/mL的标准曲线溶液，另外4份分别精密加入0.33、0.66、1.35、2.7 mL的 400 ng/mL的标准曲线溶液；将上述6个量瓶中各加入甲醇15mL，涡旋2min，用甲醇稀释至刻度，充分摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤即得回收溶液1、2、3、4、5、6，加标水平分别为0.672、0.832、2.64、5.28、10.8、21.6 μg/g；每份回收溶液上机测定6次，计算平均回收率和相对标准偏差。
2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化
实验选用400ng/mL的阿藿烯对照品溶液上机进行质谱参数优化。通过比较ESI源正、负模式下的一级质谱全扫结果，确定采用ESI源正模式下的235.0（m/z）为母离子；通过观察235.0（m/z）在不同碎裂电压下的响应强度，选择最优碎裂电压为70V；在此碎裂电压下进行235.0（m/z）的二级质谱全扫，得到响应强度最大的的2个碎片离子分别为144.9和111.0（m/z）；最优碰撞能量依次为3和6；在各自的最优碰撞能量下235.0—111.0（m/z）较235.0—144.9（m/z）响应略强，因此选择235.0—111.0（m/z）为定量离子对，235.0—144.9（m/z）为定性离子对。
通过比较定量离子对在不同源参数条件下的响应强度，得到最优的源参数条件见1.2.2。综上建立阿藿烯MRM质谱方法，其定量离子对的提取离子色谱图见图1（a）。
2.2溶剂的优化
试验选用液质法的常用溶剂尝试溶解、提取软胶囊的油类内容物中阿藿烯。单独采用甲醇、乙腈、乙醇溶解时，油类内容物在三种溶剂中都会出现明显的分层现象，无法得到均一溶液；采用正己烷可以很好地溶解油状样品，得到均一的溶液；经过溶剂间的互配使甲醇：乙腈：异丙醇（2:3:5）作为溶剂时，也可以很好地溶解油类样品，得到均一的溶液。
为进一步考察油状样品中阿藿烯成分是否可以被溶剂充分提取，平行称取3份软胶囊内容物50mg至25 mL量瓶中，分别采用甲醇、正己烷、甲醇：乙腈：异丙醇（2:3:5）作为溶剂，按照1.3.1的方法制备后上机测定。结果发现，上述3种溶剂条件下测得的阿藿烯成分含量分别为58.6、57.4、58.7μg/g，结果较为一致，这表明，虽然甲醇作为溶剂时，油状样品与甲醇分层，但阿藿烯成分可以被甲醇从油状样品中提取出来。
考虑到正己烷对反相色谱柱使用寿命的影响，暂不选用正己烷；甲醇：乙腈：异丙醇（2:3:5）可与油状样品形成均一的溶液，所以也会将油状样品溶解后带入到色谱柱中，为尽量减少除阿藿烯外的油状样品对色谱柱使用寿命的影响，选择在提取溶解阿藿烯的同时能与油状样品分层的甲醇作为溶剂。
2.3色谱条件的优化
考虑到甲酸可显著提高大部分化合物的电离效果，增强质谱响应强度，本文采用0.1%甲酸溶液作为流动相A相；基于2.2中溶剂选择过程中的实验结果，在甲醇作为溶剂时，虽然油状样品与甲醇分层，但也可能有极少量的油状样品溶解于甲醇，从而进入到色谱柱中，该类物质采用甲醇等常规流动相较难洗脱，易对色谱柱造成累计性损伤，因此，本文选用既可溶解阿藿烯又可溶解油状样品的甲醇：乙腈：异丙醇（2:3:5）作为流动相B，同时将色谱柱的柱温设为50℃，对可能进入色谱柱中的少量的油状样品进行洗脱，增强对色谱柱的保护。
2.4 基质效应和方法专属性
大多数化合物离子化过程中都会与基质中的组分产生竞争或干扰，从而出现一定程度的基质增强或基质抑制效应，本文的试验中，当阿藿烯浓度为50 ng/mL、基质含量为2mg/mL时，基质效应百分比为99.46%，即呈现极轻微的基质抑制，该基质效应在可接受范围内。
按照1.3.2方法考察方法的专属性，结果发现定性离子对和定量离子对的2个通道中均未见有干扰色谱峰，其中定量离子对的色谱图见图1（c），方法的专属性较好。
2.5 方法的线性、检出限和定量限
按照1.3.3方法得到的标准曲线、检出限和定量限结果见表2。在2～400 ng/mL的线性范围内相关性较好，相关系数为0.999；以235.0—111.0（m/z）的3倍信噪比计算的检出限为16 ng/g；以235.0—111.0（m/z）的10倍信噪比计算的定量限为54 ng/g，灵敏度较高。
表2标准曲线、检出限和定量限结果
Table 2 Results of liner equations, detection limit and quantitylimit
| 线性方程 | 相关系数 | 检出限（ng﹒g<sup>-1</sup>） | 定量限（ng﹒g<sup>-1</sup>） |
| Y=1.27×10<sup>2</sup>X-112.959893 | 0.999 | 16 | 54 |
2.6 方法的回收率和精密度
按1.3.4方法制备得到的六水平基质加标溶液上机测定后，带入标准曲线，经计算得到平均回收率为98.44%～102.07%，见表3，回收率较高；每个水平连进6针的相对标准偏差为0.5%～1.0%，精密度均较好；其中，第5水平添加回收的定量离子对提取色谱图见图1（d）。
表3回收试验结果
Table 3 Results of test for recovery
2.7 样品测定
2.5项中标准曲线溶液测定时，阿藿烯的保留时间为4.6min，定性离子对与定量离子对的离子比率为92.4%～98.2%。将1.3.1中样品溶液上机测定后出现的色谱峰保留时间、定性离子对与定量离子对的离子比率与对照品比较来定性，将定量离子对峰面积带入2.5项标准曲线，采用外标法来定量。结果发现样品中检出阿藿烯，含量为58.6μg/g，样品中阿藿烯的定量离子对提取离子色谱图见图1（b）。
上述实施例验证了，本发明提供的一种测定软胶囊类保健食品中阿藿烯的高效液相色谱-串联四级杆质谱方法，通过将样品中化合物的保留时间、定性离子对和定量离子对离子比率信息与对照品的相比较来定性，多种定性方式并存，定性的准确性更强；定量所采用的定量离子对通过专属通道进行检测，不易受样品中基质杂质峰的干扰，更有利于保障定量测定结果的准确性；该方法的选择性好、专属性强、灵敏度高、精密度好，检验快速、准确，为保健食品中阿藿烯的监管检测及质量控制提供了有力的技术支持。
Claims (1)
1.一种测定软胶囊类保健食品中阿藿烯的方法，其特征在于，该测定方法包括以下步骤：
S1样品溶液的制备
将软胶囊产品刺破囊壁，取内容物50mg至25 mL量瓶中，加入甲醇15mL，涡旋2min，用甲醇稀释至刻度，充分摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤即得样品溶液；
S2配置标准曲线溶液
用甲醇稀释标准溶液，得到系列标准曲线溶液；
S3 仪器检测
色谱条件：色谱柱采用Agilent ZORBAX Eclipse plus C18 RRHD；流动相A相为0.1%甲酸水溶液；流动相B相为甲醇、乙腈、异丙醇比例为2:3:5；流速：0.5 mL/min；进样量：5 μL；柱温：50℃；梯度洗脱：0~1.5 min：80%A→80%A；1.5~5 min：80%A→20%A；5~6.5 min：20%A→20%A；6.5~6.7 min：20%A→80%A；6.7~11min：80%A→80%A；
质谱条件：质谱采用电喷雾离子源的正离子模式ESI+，多反应监测模式；碰撞气：高纯氮气；源参数中干燥气温度：300℃；干燥气流量：5L/min；雾化气压力：45 psi；鞘气温度：250℃；鞘气流量：11 L/min；毛细管电压：3000 V；喷嘴电压：500 V；质荷比235.0—111.0为定量离子对，质荷比235.0—144.9为定性离子对；
S4：定性定量分析
以保留时间和离子比率进行定性分析，以定量离子对峰面积进行外标法定量分析。
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