CN115161206B - 一种含植物组合物的裂褶菌培养基及其制备方法和应用 - Google Patents
一种含植物组合物的裂褶菌培养基及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基及其制备方法和应用。所述含植物组合物的裂褶菌培养基包括植物组合物和基础培养基；其中，所述植物组合物包括胡萝卜和草莓。本发明向改良的基础培养基中添加胡萝卜和草莓，在裂褶菌发酵的过程中，胡萝卜和草莓相互配合，协同增效，不仅在发酵过程中提高了裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量，而且还使得最终得到的裂褶菌发酵产物的抗氧化能力和保湿能力得到显著提升。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种含植物组合物的裂褶菌培养基及其制备方法和应用。
背景技术
裂褶菌(学名：Schizophyllum commune Fr.)是裂褶菌科、裂褶菌属真菌。子实体小，覆瓦状散生或丛生，扇形或肾形，无柄或短柄，盖面密生绒毛、白色至浅灰色；盖缘内卷，有条纹、多瓣裂，菌褶狭窄，沿褶缘纵裂向外反卷。
裂褶菌多糖是裂褶菌发酵得到的水溶性多糖，具有抑制肿瘤、抗菌消炎、抗辐射、提高机体免疫力等多种生理活性。目前，裂褶多糖的生产方法多采用单一食用菌液体发酵方式，再将发酵后的产物进行后处理，最终得到裂褶多糖。但发酵得到的裂褶多糖难于重新溶解、不利于生物吸收等特性，极大的限制了其应用。
CN112691125A公开了一种药物组合物及其制备方法、护肤品。药物组合物的制备方法，包括：在基础培养基中培养裂褶菌，再向所述基础培养基中加入甘草继续培养，然后收集发酵产物。在培养裂褶菌的过程中，在适当的时机加入甘草对裂褶菌进行培养，可以增加发酵产物的抗氧化性能以及抑制弹性蛋白酶、抑制酪氨酸酶的水平；可以扩展该药物组合物的用途，该裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量有待提高，抗氧化，抗衰老能力有待提高。
CN113337545A公开了一种裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品、裂褶菌培养基。裂褶菌发酵产物的制备方法，包括：在裂褶菌培养基中培养裂褶菌，然后收集发酵产物；其中，所述裂褶菌培养基中含有葛根。在培养基中加入葛根粉末培养裂褶菌，收集发酵产物。
因此，亟待开发一种能够进一步提高裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的培养基及制备方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基及其制备方法和应用。本发明向改良的基础培养基中添加胡萝卜和草莓，二者相互配合协同增效，在发酵过程中提高了裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基，所述含植物组合物的裂褶菌培养基包括植物组合物和基础培养基；
其中，所述植物组合物包括胡萝卜和草莓。
在本发明中，向改良的基础培养基中添加胡萝卜和草莓，在裂褶菌发酵的过程中，胡萝卜和草莓相互配合，协同增效，不仅在发酵过程中提高了裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量，而且还使得最终得到的裂褶菌发酵产物的抗氧化能力和保湿能力得到显著提升。
优选地，所述含植物组合物的裂褶菌培养基中胡萝卜的浓度为0.1-10g/L，例如可以是0.1g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等，优选为3-4g/L。
优选地，所述含植物组合物的裂褶菌培养基中草莓的浓度为0.1-10g/L，例如可以是0.1g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等，优选为0.1-3g/L。
优选地，所述基础培养基按质量百分含量计包括：葡萄糖5-10％、磷酸二氢钾0.05-0.2％、硫酸镁0.01-0.02％、胰蛋白胨0.1-1％、酵母提取物0.1-0.5％、水85-95％。
以所述基础培养基的总质量为100％计，葡萄糖的含量为5-10％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％等。
以所述基础培养基的总质量为100％计，磷酸二氢钾的含量为0.05-0.2％，例如可以是0.05％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％等。
以所述基础培养基的总质量为100％计，胰蛋白胨的含量为0.1-1％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％等。
以所述基础培养基的总质量为100％计，酵母提取物的含量为0.1-0.5％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％等。
以所述基础培养基的总质量为100％计，水的含量为85-90％，例如可以是85％、86％、87％、88％、89％、90％等。
优选地，所述基础培养基中还包括营养添加剂。
优选地，所述营养添加剂占所述基础培养基总质量的0.01-0.2％，例如可以是0.01％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％等。
在本发明中，基础培养基灭菌条件，所述灭菌的温度为120℃以上，例如可以是120℃、121℃、122℃等，灭菌的时间为20-30min，例如可以是20min、22min、24min、26min、28min、30min等等。
优选地，所述营养添加剂包括谷氨酸、谷胱甘肽、烟酰胺、γ-聚谷氨酸钠、透明质酸钠或甘露糖醇中的任意一项或至少两种的组合，优选为谷氨酸、谷胱甘肽和烟酰胺的组合。
优选地，所述谷氨酸、谷胱甘肽和烟酰胺的质量比为(5-9):(1-5):(0.1-1)；
其中，“5-9”例如可以是5、6、7、8、9等；
其中，“1-5”例如可以是1、2、3、4、5等；
其中，“0.1-1”例如可以是0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1等。
第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述含植物组合物的裂褶菌培养基的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(a)将胡萝卜和草莓先进行冻干处理后，分别进行粉碎过筛，得到胡萝卜粉和草莓粉；将基础培养基中各组分溶解，得到培养基混合液；
(b)将胡萝卜粉、草莓粉和培养基混合液混合搅拌，得到所述含植物组合物的裂褶菌培养基。
优选地，步骤(a)中，所述冻干处理的温度为-30～-20℃，例如可以是-30℃、-28℃、-25℃、-22℃、-20℃等，所述冻干处理的时间为10-15h，例如可以是10h、11h、12h、13h、14h、15h等。
优选地，步骤(a)中，所述胡萝卜粉和草莓粉的粒径各自独立地为100-500目，例如可以是100目、200目、300目、400目、500目等。
优选地，步骤(a)中，所述溶解的步骤为：将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、胰蛋白胨、酵母提取物和水混合后，先以3-5℃/min(例如可以是3℃/min、3.5℃/min、4℃/min、4.5℃/min、5℃/min等)的升温速率、300-500rpm(例如可以是300rpm、350rpm、400rpm、450rpm、500rpm等)的转速升温至30-35℃(例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃等)，然后以2-3℃/min(例如可以是2℃/min、2.2℃/min、2.4℃/min、2.6℃/min、2.8℃/min、3℃/min等)的升温速率、100-300rpm(例如可以是100rpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm等)的转速升温至35-40℃(例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等)，最后在35-40℃(例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等)下保持1-3min(例如可以是1min、1.5min、2min、2.5min、3min等)。
优选地，步骤(b)中，所述混合搅拌的转速为500-1000rpm，例如可以是500rpm、600rpm、700rpm、800rpm、900rpm、1000rpm等，所述混合搅拌的时间为5-20min，例如可以是5min、6min、8min、10min、12min、14min、16min、18min、20min等。
第三方面，本发明提供一种第一方面所述含植物组合物的裂褶菌培养基在裂褶菌发酵中的应用。
第四方面，本发明提供一种裂褶菌发酵的方法，所述裂褶菌发酵的方法包括以下步骤：将活化后的裂褶菌接种于所述含植物组合物的裂褶菌培养基中，进行发酵培养后，得到裂褶菌发酵产物。
优选地，所述发酵培养在搅拌下进行，发酵培养的转速为150-200rpm，例如可以是150rpm、160rpm、170rpm、180rpm、200rpm等，发酵培养的温度为25-30℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等，发酵培养的时间60-80h；
优选地，所述活化后的裂褶菌通过以下步骤活化得到：
将裂褶菌菌种通过斜面培养基活化，在25-30℃(如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等)，条件下培养5-7天(例如可以是5天、6天、7天等)直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基，扩大培养3-4天(例如可以是3天、3.5天、4天等)，得到活化后的裂褶菌种子液。
优选地，所述斜面培养基为PDA斜面培养基。
优选地，所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖1-5％、磷酸二氢钾0.05-0.2％、硫酸镁0.01-0.02％、酵母浸粉0.1-0.2％，余量为水。
以所述液体培养基的总质量为100％计，所述葡萄糖的含量为1-5％，例如可以是1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％等。
以所述液体培养基的总质量为100％计，所述磷酸二氢钾的含量为0.05-0.2％，例如可以是0.05％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％等。
以所述液体培养基的总质量为100％计，所述硫酸镁的含量为0.01-0.02％，例如可以是0.01％、0.012％、0.014％、0.016％、0.018％、0.02％等。
以所述液体培养基的总质量为100％计，酵母浸粉的含量为0.1-0.2％，例如可以是0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％等。
优选地，所述活化后的裂褶菌在所述含植物组合物的裂褶菌培养基中的接种量为1-5vol％，例如可以是1vol％、1.5vol％、2vol％、2.5vol％、3vol％、3.5vol％、4vol％、4.5vol％、5vol％等。
第五方面，本发明提供一种裂褶菌发酵产物，所述裂褶菌发酵产物由权所述的裂褶菌发酵的方法制备得到。
优选地，所述裂褶菌发酵产物中裂褶多糖的含量为5-15mg/mL，例如可以是5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL。
第六方面，本发明提供一种裂褶菌发酵产物在制备化妆品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明向改良的基础培养基中添加胡萝卜和草莓，在裂褶菌发酵的过程中，胡萝卜和草莓相互配合，协同增效，不仅在发酵过程中提高了裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量(裂褶多糖的含量在4.14mg/mL以上)，而且还使得最终得到的裂褶菌发酵产物的抗氧化能力和保湿能力得到显著提升；
(2)本发明制备得到的裂褶菌发酵产物对于超氧阴离子自由基清除率在39.86％以上，对羟自由基清除率在37.90％以上，对于DPPH自由基抑制率在74.98％以上；使用本发明的制备的裂褶菌发酵产物试验的第14天皮肤水分含量在35.82％以上，第28天皮肤水分含量在43.08％以上，第14天皮肤水分流失在27.20g/(m2h)以下，第28天皮肤水分流失在22.59g/(m2h)以下；本发明提供的裂褶菌发酵产物对弹性蛋白酶的抑制率在53.73％以上，对胶原蛋白酶抑制率在27.38％以上。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
制备例1
本制备例提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基，所述含植物组合物的裂褶菌培养基包括胡萝卜、草莓和基础培养基；
其中，胡萝卜的浓度为3g/L、草莓的浓度为2g/L；
其中，所述基础培养基按质量百分含量计由以下组分组成：葡萄糖6％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.01％、胰蛋白胨0.4％、酵母提取物0.2％、营养添加剂0.05％、余量为水；其中，所述营养添加剂为质量比为6:4:0.2的谷氨酸、谷胱甘肽和烟酰胺的组合。
所述含植物组合物的裂褶菌培养基的制备方法包括以下步骤：
(a)将胡萝卜和草莓先在-80℃下冷冻干燥15h后，分别进行粉碎过筛，得到200目的胡萝卜粉和200目的草莓粉；同时按上述比例将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、胰蛋白胨、酵母提取物和水混合后，先以4℃/min的升温速率、400rpm的转速升温至32℃，然后以2.5℃/min的升温速率、200rpm的转速升温至37℃，最后在37℃下保持2min，得到培养基混合液；
(b)将胡萝卜粉、草莓粉和培养基混合液混合，以600rpm的转速搅拌10min，灭菌备用；
(c)于无菌条件下，将营养添加剂添加入含植物组合物的裂褶菌培养基，过0.22μm滤膜后备用，得到所述含植物组合物的裂褶菌培养基。
制备例2
本制备例提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基，所述含植物组合物的裂褶菌培养基包括胡萝卜、草莓和基础培养基；
其中，胡萝卜的浓度为4g/L、草莓的浓度为1g/L；
其中，所述基础培养基按质量百分含量计由以下组分组成：葡萄糖5％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.02％、胰蛋白胨0.6％、酵母提取物0.2％、营养添加剂0.04％、余量为水；其中，所述营养添加剂为质量比为8:2:0.1的谷氨酸、谷胱甘肽和烟酰胺的组合。
所述含植物组合物的裂褶菌培养基的制备方法包括以下步骤：
(a)将胡萝卜和草莓先在-80℃下冷冻干燥10h后，分别进行粉碎过筛，得到300目的胡萝卜粉和300目的草莓粉；同时按上述比例将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、胰蛋白胨、酵母提取物和水混合后，先以3℃/min的升温速率、300rpm的转速升温至30℃，然后以2℃/min的升温速率、100rpm的转速升温至35℃，最后在35℃下保持1min，得到培养基混合液；
(b)将胡萝卜粉、草莓粉和培养基混合液混合，以600rpm的转速搅拌10min，灭菌备用；
(c)于无菌条件下，将营养添加剂添加入含植物组合物的裂褶菌培养基，过0.22μm滤膜后备用，得到所述含植物组合物的裂褶菌培养基。
制备例3
本制备例提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基，所述含植物组合物的裂褶菌培养基包括胡萝卜、草莓和基础培养基；
其中，胡萝卜的浓度为3.5g/L、草莓的浓度为1.5g/L；
其中，所述基础培养基按质量百分含量计由以下组分组成：葡萄糖8％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.02％、胰蛋白胨0.6％、酵母提取物0.2％、营养添加剂0.06％、余量为水；其中，所述营养添加剂为质量比为5:5:0.5的谷氨酸、谷胱甘肽和烟酰胺的组合。
所述含植物组合物的裂褶菌培养基的制备方法包括以下步骤：
(a)将胡萝卜和草莓先在-80℃下冷冻干燥12h后，分别进行粉碎过筛，得到200目的胡萝卜粉和200目的草莓粉；同时按上述比例将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、胰蛋白胨、酵母提取物和水混合后，先以3℃/min的升温速率、300rpm的转速升温至30℃，然后以2℃/min的升温速率、100rpm的转速升温至35℃，最后在35℃下保持1min，得到培养基混合液；
(b)将胡萝卜粉、草莓粉和培养基混合液混合，以600rpm的转速搅拌10min，灭菌备用；
(c)于无菌条件下，将营养添加剂添加入含植物组合物的裂褶菌培养基，过0.22μm滤膜后备用，得到所述含植物组合物的裂褶菌培养基。
制备例4
本制备例提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基，与制备例1的区别仅在于，所述含植物组合物的裂褶菌培养基中，胡萝卜的浓度为2g/L，草莓的浓度3g/L。
制备例5
本制备例提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基，与制备例1的区别仅在于，所述含植物组合物的裂褶菌培养基中，所述胡萝卜的浓度为5g/L，草莓的浓度0.05g/L。
制备例6
本制备例提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基，与制备例1的区别仅在于，所述营养添加剂为质量比为6:4的谷氨酸和谷胱甘肽的组合。
制备例7
本制备例提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基，与制备例1的区别仅在于，所述营养添加剂为质量比为4:0.1的谷胱甘肽和烟酰胺的组合。
制备例8
本制备例提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基，与制备例1的区别仅在于，所述营养添加剂为质量比为6:0.1的谷氨酸和烟酰胺的组合。
制备例9
本制备例提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基，与制备例1的区别仅在于，所述营养添加剂为质量比为6:4:0.1的谷氨酸、谷胱甘肽和γ-聚谷氨酸钠的组合。
制备例10
本制备例提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基，与制备例1的区别仅在于，所述营养添加剂为质量比为6:4:0.1的谷胱甘肽、甘露糖醇和γ-聚谷氨酸钠的组合。
对比制备例1
本制备例提供一种含葛根的裂褶菌培养基，所述含葛根的裂褶菌培养基包括葛根和基础培养基，葛根的浓度为1g/L，所述基础培养基按质量百分含量计包括：葡萄糖6％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.015％、酵母浸粉0.5％、酵母浸膏0.15％，余量为水。
所述含葛根的裂褶菌培养基的制备方法包括以下步骤：
(a)将葛根粉碎过筛，得到粒径为200目的葛根粉；将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母浸粉、酵母浸膏和水混合后，先以4℃/min的升温速率、400rpm的转速升温至32℃，然后以2.5℃/min的升温速率、200rpm的转速升温至37℃，最后在37℃下保持2min，得到培养基混合液；
(b)将葛根粉和培养基混合液混合，以600rpm的转速搅拌10min，得到所述含葛根的裂褶菌培养基。
对比制备例2
本制备例提供一种含甘草的裂褶菌培养基，所述含甘草的裂褶菌培养基包括甘草和基础培养基，甘草的浓度为1g/L，所述基础培养基按质量百分含量计包括：葡萄糖6％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.015％、酵母浸粉0.5％、酵母浸膏0.15％，余量为水。
所述含甘草的裂褶菌培养基的制备方法包括以下步骤：
(a)将甘草粉碎过筛，得到粒径为200目的葛根粉；将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母浸粉、酵母浸膏和水混合后，先以4℃/min的升温速率、400rpm的转速升温至32℃，然后以2.5℃/min的升温速率、200rpm的转速升温至37℃，最后在37℃下保持2min，得到培养基混合液；
(b)将甘草粉和培养基混合液混合，以600rpm的转速搅拌10min，得到所述含甘草的裂褶菌培养基。
对比制备例3
本对比制备例提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基，所述含植物组合物的裂褶菌培养基包括胡萝卜和基础培养基；
其中，胡萝卜的浓度为5g/L；
其中，所述基础培养基按质量百分含量计由以下组分组成：葡萄糖6％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.01％、胰蛋白胨0.4％、酵母提取物0.2％、营养添加剂0.05％、余量为水；其中，所述营养添加剂为质量比为6:4:0.2的谷氨酸、谷胱甘肽和烟酰胺的组合。
所述含植物组合物的裂褶菌培养基的制备方法包括以下步骤：
(a)将胡萝卜先在-80℃下冷冻干燥15h后，分别进行粉碎过筛，得到200目的胡萝卜粉；同时按上述比例将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、胰蛋白胨、酵母提取物和水混合后，先以4℃/min的升温速率、400rpm的转速升温至32℃，然后以2.5℃/min的升温速率、200rpm的转速升温至37℃，最后在37℃下保持2min，得到培养基混合液；
(b)将胡萝卜粉和培养基混合液混合，以600rpm的转速搅拌10min，灭菌备用；
(c)于无菌条件下，将营养添加剂添加入含植物组合物的裂褶菌培养基，过0.22μm滤膜后备用，得到所述含植物组合物的裂褶菌培养基。
对比制备例4
本对比制备例提供一种含植物组合物的裂褶菌培养基，所述含植物组合物的裂褶菌培养基包括草莓和基础培养基；
其中，草莓的浓度为5g/L；
其中，所述基础培养基按质量百分含量计由以下组分组成：葡萄糖6％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.01％、胰蛋白胨0.4％、酵母提取物0.2％、营养添加剂0.05％、余量为水；其中，所述营养添加剂为质量比为6:4:0.2的谷氨酸、谷胱甘肽和烟酰胺的组合。
所述含植物组合物的裂褶菌培养基的制备方法包括以下步骤：
(a)将草莓先在-80℃下冷冻干燥15h后，分别进行粉碎过筛，得到200目的草莓粉；同时按上述比例将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、胰蛋白胨、酵母提取物和水混合后，先以4℃/min的升温速率、400rpm的转速升温至32℃，然后以2.5℃/min的升温速率、200rpm的转速升温至37℃，最后在37℃下保持2min，得到培养基混合液；
(b)将草莓粉和培养基混合液混合，以600rpm的转速搅拌10min，灭菌备用；
(c)于无菌条件下，将营养添加剂添加入含植物组合物的裂褶菌培养基，过0.22μm滤膜后备用，得到所述含植物组合物的裂褶菌培养基。
实施例1
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将裂褶菌菌种通过PDA斜面培养基活化，在27℃，160rpm条件下培养6天直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基(所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖3％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.01％、酵母浸膏0.1％，余量为水)，扩大培养3天，得到活化后的裂褶菌种子液；
(2)将活化后的裂褶菌种子液以2vol％的接种量接种于制备例1提供的含植物组合物的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述培养在搅拌下进行，培养的转速为160rpm，培养的温度为27℃，培养的时间72h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例2
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含植物组合物的裂褶菌培养基替换为制备例2提供的含植物组合物的裂褶菌培养基。
实施例3
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含植物组合物的裂褶菌培养基替换为制备例3提供的含植物组合物的裂褶菌培养基。
实施例4
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含植物组合物的裂褶菌培养基替换为制备例4提供的含植物组合物的裂褶菌培养基。
实施例5
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含植物组合物的裂褶菌培养基替换为制备例5提供的含植物组合物的裂褶菌培养基。
实施例6
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含植物组合物的裂褶菌培养基替换为制备例6提供的含植物组合物的裂褶菌培养基。
实施例7
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含植物组合物的裂褶菌培养基替换为制备例7提供的含植物组合物的裂褶菌培养基。
实施例8
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含植物组合物的裂褶菌培养基替换为制备例8提供的含植物组合物的裂褶菌培养基。
实施例9
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含植物组合物的裂褶菌培养基替换为制备例9提供的含植物组合物的裂褶菌培养基。
实施例10
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含植物组合物的裂褶菌培养基替换为制备例10提供的含植物组合物的裂褶菌培养基。
对比例1
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含植物组合物的裂褶菌培养基替换为对比制备例1提供的培养基。
对比例2
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含植物组合物的裂褶菌培养基替换为对比制备例2提供的培养基。
对比例3
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含植物组合物的裂褶菌培养基替换为对比制备例3提供的培养基。
对比例4
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，将制备例1提供的含植物组合物的裂褶菌培养基替换为对比制备例4提供的培养基。
试验例1
裂褶多糖含量含量测定
测试样品：实施例1-10提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-4提供的裂褶菌发酵产物；
测试原理：裂褶多糖含量也可作为发酵产物的重要衡量指标，计算方法：裂褶多糖含量＝总糖含量-还原糖含量；
测试方法：
I.采用硫酸-苯酚法测定发酵产物总糖含量，多糖在浓硫酸的作用下，先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚反应生成橙黄色溶液，在490nm处有最大吸收。以葡萄糖标准品，测定发酵产物总糖含量，具体操作步骤如下：
(1)于10.0mL具塞试管中，添加稀释一定倍数待测液1.0mL；
(2)加入5％苯酚溶液1.0mL，再迅速垂直液面加入5.0mL浓硫酸，静置10min。使用旋涡振荡器使反应液充分混合，然后将具塞试管放置于30℃水浴反应20min。
(3)以相应试剂进行空白调零，于490nm处测定吸光度。
计算公式：总糖含量(mg/mL)＝吸光度对应葡萄糖浓度×稀释倍数N；
II.采用DNS法测定发酵产物还原糖含量，还原糖在碱性条件下可被氧化成糖酸及其他产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸则被还原成棕红色的3-氨基-5硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅成正比关系，利用分光光度计在550nm处测定其吸光度。以葡萄糖为标准品，测定发酵产物还原糖含量，具体操作步骤如下：
(1)于10mL具塞试管中，添加稀释一定倍数待测液1.0mL；
(2)加入DNS溶液3.0mL，沸水浴5min后显色；待冷却后用水定容至25.0mL，充分摇匀；
(3)以相应试剂进行空白调零，于550nm处测定吸光度。
计算公式：还原糖含量(mg/mL)＝吸光度对应葡萄糖浓度×稀释倍数N；
具体测试结果如表1所示：
表1
由表1测试结果可知，本发明制备得到的裂褶菌发酵产物中总糖的含量在5～10mg/mL，还原糖的含量在0.57～0.83mg/mL以上，裂褶多糖的含量在4.14mg/mL以上。由此说明，本发明向改良的基础培养基中添加胡萝卜和草莓，从而提高了裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量。
试验例2
抗氧化能力测试
测试样品：实施例1-10提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-4提供的裂褶菌发酵产物；
测试方法：
1、对超氧阴离子自由基清除能力评价
取0.05mol/LpH＝8.2的Tris-HCl缓冲液4.5mL，于25℃水浴锅中预热20min。再加入1mL试样和0.4mL 25mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后，于25℃水浴中反应5min，加入8mol/L的HCl 1.0mL终止反应。以Tris-HCl缓冲液作参比，在299nm处测吸光度值。空白对照用1mL试样的溶剂来替代样品。
超氧阴离子自由基清除率(％)＝[1-(A2/A1)]×100％；式中A1为空白对照的吸光度值；A2为样品的吸光度值。
2、对羟自由基的清除能力评价
在25mL比色管中依次加入2mmol/LFeSO43 mL，1mmol/L H2O23 mL，摇匀，接着加入6mmol/L水杨酸3mL，摇匀，于37℃水浴加热15min后取出，测其吸光度；分别加入一定浓度的待测液，摇匀，继续水浴加热15min，取出测其吸光度。下式为待测液对羟自由基(·OH)的清除率：
羟自由基清除率(％)＝[A1-A2-(A1-A3)]/A1×100％；式中A1为未加药品前反应体系的吸光度值；A2为样品清除·OH后体系的吸光度值；A3为空白对照清除·OH后体系的吸光度值；
3、对DPPH自由基的清除能力评价
试验参照Larrauri JA中规定的方法，配制20mmol/L的DPPH溶液；受试样品溶液：采用超纯水稀释实施例1-10提供的裂褶多糖组合物和对比例1-5提供的组合物，得到质量浓度为0.1％的溶液。取受试样品溶液2.0mL及20mmol/L的DPPH溶液2.0mL于试管之中，混匀后反应30min，于517nm下测定吸光度值，无水乙醇为空白对照，根据吸光度值计算DPPH抑制率。
DPPH自由基抑制率(％)＝[1-(A1-A2)/A3]×100％；其中，A1为2.0mL的DPPH溶液与2.0mL受试样品溶液的吸光度，A2为2.0mL受试样品溶液与2.0mL无水乙醇的吸光度，A3为2.0mL的DPPH溶液与2.0mL无水乙醇的吸光度，平行测试三次取平均值；
具体测试结果如表2所示：
表2
由表2测试数据可知，本发明制备得到的裂褶菌发酵产物具有很好的抗氧化和清除DPPH自由基的能力，对于超氧阴离子自由基清除率在39.86％以上，对羟自由基清除率在37.90％以上，对于DPPH自由基抑制率在74.98％以上。说明本发明所述含植物组合物的裂褶菌培养基能够促进裂褶菌发酵，得到的裂褶菌发酵产物能进一步对于DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用，可增强皮肤组织的抗氧化能力，降低皮肤组织自由基含量。
试验例3
保湿性能测试
测试样品：实施例1-10提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-2提供的裂褶菌发酵产物；
测试方法：
选取干性肌肤人群，年龄在20-45岁，随机分成14组，每组10名。受试部位前15天不能使用任何产品(化妆品、外用药品、内服保健品)。试验前，要求受试者清洗颜面部并在清洗后2h进入气候控制室(22±1℃，相对湿度50％)静坐20min以上，并保持放松状态。
试验中按随机表进行半边脸测试，选取志愿者的左右鼻唇沟部分进行皮肤水分含量(％)及水分流失(TEWL)([g/(m2h)])测试，取3个值的平均值作为左右鼻唇沟水分含量数据(d0)及鼻唇沟皮肤水分流失(TEWL)的数据(d0)。测试结束后，志愿者需按要求使用，连续使用28天，并要求试验者在试验的第14天(d14)及第28天(d28)进行回访。试验结果如表3所示：
表3
由表3测试结果可知，本发明的实施例1-10制备的裂褶菌发酵产物较于对比例1-4裂褶菌发酵产物对皮肤具有良好的保湿效果，其能够明显的增加皮肤角质层水分含量，减少皮肤对外的水分流失，具体表现为试验的第14天皮肤水分含量在35.82％以上，第28天皮肤水分含量在43.08％以上，第14天皮肤水分流失在27.20g/(m2h)以下，第28天皮肤水分流失在22.59g/(m2h)以下。
试验例4
抗衰能力测试
测试样品：实施例1-10提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-4提供的裂褶菌发酵产物；
测试方法：
(1)弹性蛋白酶抑制率
将50μL样品与100μL 0.9U/mL弹性蛋白酶和100μL Tris-HCl缓冲液于25℃孵育20min；随后加入50μL MAAPVN溶液以启动反应，对于样品空白对照，则加入50μL Tris-HCl缓冲液替代MAAPVN。在25℃孵育60min后，在410nm处测定吸光值。
式中：A1：添加样品，添加MAAPVN；A2：添加样品，没有添加MAAPVN；B1:没有添加样品，添加MAAPVN；B2：没有添加样品，没有添加MAAPVN，T'为对应样品对弹性蛋白酶抑制率(％)。
(2)对胶原蛋白酶的抑制活性
对2mL试管中，实验组分别加入25μL的胶原蛋白酶(1mg/mL)、50mM的TES缓冲液和样品(2mg/mL)；空白组包含75μL TES缓冲液，阴性对照组包含25μL的蛋白酶和50μLTES缓冲液；阳性对照组分别包含25μL的蛋白酶，TES缓冲液和EDTA(1mg/mL)；溶剂对照组T分别包含25μL的蛋白酶，TES缓冲液和溶解样品的溶剂。在37℃培养箱中培养20min后，各加入100μL的FALGPA并在37℃下继续培养1h。然后，各试管中加入100μL的200mM柠檬酸盐缓冲液和100μL的茚三酮溶液。所有的试管在100℃的水浴锅中浴5分min，冷却到室温，各加入200μL的50％的异丙醇溶液。混合均匀后，将试管中的溶液各取200μL转移到96孔板中，用多功能荧光酶标仪在540nm处测吸光度A。一式三份。计算得到弹性蛋白酶抑制率。
胶原蛋白酶抑制率(％)＝(Ac–At/Ac)×100％。
此处Ac为溶剂对照组的吸光值，At为阳性对照或实验组的吸光值。实验结果取平均值。
具体测试结果如表4所示：
表4
| 测试样品 | 弹性蛋白酶抑制率/％ | 胶原蛋白酶抑制率/％ |
| 实施例1 | 66.24±0.08 | 54.77±1.16 |
| 实施例2 | 65.36±0.83 | 54.53±0.46 |
| 实施例3 | 64.93±0.48 | 51.07±1.42 |
| 实施例4 | 59.11±0.89 | 48.73±0.55 |
| 实施例5 | 60.10±0.33 | 45.69±1.28 |
| 实施例6 | 57.10±0.36 | 43.61±0.24 |
| 实施例7 | 56.88±0.06 | 38.40±0.32 |
| 实施例8 | 55.39±0.04 | 39.02±5.90 |
| 实施例9 | 53.92±0.10 | 33.60±0.51 |
| 实施例10 | 53.73±0.19 | 27.38±0.62 |
| 对比例1 | 46.08±1.05 | 14.03±0.65 |
| 对比例2 | 32.98±4.78 | 21.86±3.59 |
| 对比例3 | 44.47±0.10 | 28.43±1.18 |
| 对比例4 | 39.73±0.02 | 29.94±1.40 |
由表4测试结果可知，本发明提供的裂褶菌发酵产物对弹性蛋白酶的抑制率在53.73％以上，对胶原蛋白酶抑制率在27.38％以上，说明说明本发明所述含植物组合物的裂褶菌培养基能够促进裂褶菌发酵，得到的裂褶菌发酵产物，够被激活并促进肌肤自身合成胶原蛋白，刺激神经酰胺的合成，能够有效提高的弹性蛋白酶抑制率和胶原蛋白酶抑制率。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的含植物组合物的裂褶菌培养基及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (17)
1.一种含植物组合物的裂褶菌培养基在裂褶菌发酵中的应用，其特征在于，所述含植物组合物的裂褶菌培养基包括植物组合物和基础培养基；
其中，所述植物组合物为胡萝卜和草莓；
所述含植物组合物的裂褶菌培养基中胡萝卜的浓度为3-4 g/L；
所述含植物组合物的裂褶菌培养基中草莓的浓度为0.1-3 g/L；
所述基础培养基包括营养添加剂；
所述营养添加剂为谷氨酸、谷胱甘肽和烟酰胺的组合；
所述含植物组合物的裂褶菌培养基的制备方法包括以下步骤：
（a）将胡萝卜和草莓先进行冻干处理后，分别进行粉碎过筛，得到胡萝卜粉和草莓粉；将基础培养基中各组分溶解，得到培养基混合液；
（b）将胡萝卜粉、草莓粉和培养基混合液混合搅拌，得到所述含植物组合物的裂褶菌培养基。
2.根据权利要求1所述的含植物组合物的裂褶菌培养基在裂褶菌发酵中的应用，其特征在于，所述基础培养基按质量百分含量计包括：葡萄糖5-10%、磷酸二氢钾0.05-0.2%、硫酸镁0.01-0.02%、胰蛋白胨0.1-1%、酵母提取物0.1-0.5%、水85-90%。
3.根据权利要求1所述的含植物组合物的裂褶菌培养基在裂褶菌发酵中的应用，其特征在于，所述营养添加剂占所述基础培养基总质量的0.01-0.2%。
4.根据权利要求1所述的含植物组合物的裂褶菌培养基在裂褶菌发酵中的应用，其特征在于，所述谷氨酸、谷胱甘肽和烟酰胺的质量比为(5-9):(1-5):(0.1-1)。
5.根据权利要求1所述的含植物组合物的裂褶菌培养基在裂褶菌发酵中的应用，其特征在于，步骤（a）中，所述冻干处理的温度为-30~-20℃，所述冻干处理的时间为10-15 h。
6.根据权利要求1所述的含植物组合物的裂褶菌培养基在裂褶菌发酵中的应用，其特征在于，步骤（a）中，所述胡萝卜粉和草莓粉的粒径各自独立地为100-500目。
7.根据权利要求1所述的含植物组合物的裂褶菌培养基在裂褶菌发酵中的应用，其特征在于，步骤（a）中，所述溶解的步骤为：将葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、胰蛋白胨、酵母提取物和水混合后，先以3-5℃/min的升温速率、300-500 rpm的转速升温至30-35℃，然后以2-3℃/min的升温速率、100-300 rpm的转速升温至35-40℃，最后在35-40℃下保持1-3min。
8.根据权利要求1所述的含植物组合物的裂褶菌培养基在裂褶菌发酵中的应用，其特征在于，步骤（b）中，所述混合搅拌的转速为500-1000 rpm，所述混合搅拌的时间为5-20min。
9.一种裂褶菌发酵的方法，其特征在于，所述裂褶菌发酵的方法包括以下步骤：将活化后的裂褶菌接种于权利要求1-8中任一项所述含植物组合物的裂褶菌培养基中，进行发酵培养后，得到裂褶菌发酵产物。
10.根据权利要求9所述的裂褶菌发酵的方法，其特征在于，所述发酵培养在搅拌下进行，发酵培养的转速为150-200 rpm，发酵培养的温度为25-30℃，发酵培养的时间60-80 h。
11.根据权利要求9所述的裂褶菌发酵的方法，其特征在于，所述活化后的裂褶菌通过以下步骤活化得到：
将裂褶菌菌种通过斜面培养基活化，在25-30℃条件下培养5-7天直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基，扩大培养3-4天，得到活化后的裂褶菌种子液。
12.根据权利要求11所述的裂褶菌发酵的方法，其特征在于，所述斜面培养基为PDA斜面培养基。
13.根据权利要求11所述的裂褶菌发酵的方法，其特征在于，所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖1-5%、磷酸二氢钾0.05-0.2%、硫酸镁0.01-0.02%、酵母浸粉0.1-0.2%，余量为水。
14.根据权利要求11所述的裂褶菌发酵的方法，其特征在于，所述活化后的裂褶菌在所述含植物组合物的裂褶菌培养基中的接种量为1-5 vol%。
15.一种裂褶菌发酵产物，其特征在于，所述裂褶菌发酵产物由权利要求9-14中任一项所述的裂褶菌发酵的方法制备得到。
16.根据权利要求15所述的裂褶菌发酵产物，其特征在于，所述裂褶菌发酵产物中裂褶多糖的含量为5-15 mg/mL。
17.一种根据权利要求15或16所述的裂褶菌发酵产物在制备化妆品中的应用。
Priority Applications (2)
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