CN115160639A - 用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制法和应用，制法为：先将聚合物多孔膜浸没在含邻苯二酚类化合物、硫酸铜和双氧水的混合溶液A中，得到改性膜，再将改性膜浸没在含多胺化合物、1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺(或1‑羟基苯并三唑)的混合溶液C中，得到pH响应性亲和膜；应用：将pH响应性亲和膜用于核酸分离纯化，利用pH响应性亲和膜通过固相吸附法对核酸进行分离纯化时，核酸的回收效率为80％以上。本发明的方法工艺简单，本发明制得的pH响应性亲和膜具有高密度的核酸结合位点，具有高效分离回收DNA功能，核酸回收效率较高。

Description

用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制法和应用
技术领域
本发明属于高分子材料技术领域，具体涉及一种用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制法和应用。
背景技术
核酸作为生物体内携带有遗传信息的生物大分子，在生命科学的多领域均具有重要的研究意义。生命科学的快速发展离不开简捷高效的核酸分离纯化技术，然而传统核酸分离纯化技术存在的著多问题，使其不能满足生命科学发展的要求，新兴核酸分离纯化技术成为研究者关注的热点。
传统的核酸分离纯化技术及其存在的问题主要有：(1)利用苯酚、氯仿、十六烷基三甲基溴化铵等有机溶剂对核酸进行液相萃取的纯化方法。液相萃取中涉及有毒溶剂的大量使用，威胁生命健康，破坏生态环境；抽提、离心等复杂的纯化过程耗时费力，自动化生产无法实现。(2)利用硅胶膜、磁珠和纤维素等固相材料对核酸固有的亲和能力，通过吸附、洗涤、解吸附的连续化过程实现核酸分离纯化的方法。该方法具有操作简捷、易于自动化的优势，因而得到广泛应用，但在纯化过程中部分核酸片段易流失，产生回收效率低的后果，同时也存在着离液盐残留、交叉污染等风险。
亲和膜色谱法是近年兴起的一种新型分离技术，被认为是传统的柱色谱法的代替方法。亲和膜色谱技术结合膜分离技术高孔隙率、高渗透通量、低传质阻力与色谱法高分离能力的相关优势，以更高的流速、更小的处理压力、更少的处理时间对溶质分子进行分离它是根据生物大分子与特定的固载化配基之间的亲和力，即特异性的可逆结合和解离而使生物大分子得到分离。同时亲和膜分离过程具有操作简便、无污染、无相变等特点，目前在分离干扰素、克隆抗体、蛋白质、药物等领域取得突破，并有希望成为打破分离纯化核酸现状的前沿技术。
因此研究一种用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制法和应用以解决现有技术中核酸分离纯化回收效率低的问题，具有十分重要意义。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制法和应用。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，先将聚合物多孔膜浸没在含邻苯二酚类化合物、硫酸铜和双氧水的混合溶液A中，得到改性膜，再将改性膜浸没在含多胺化合物、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和X的混合溶液C中，得到用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜；
邻苯二酚类化合物含羧基；
X为N-羟基琥珀酰亚胺或1-羟基苯并三唑；
利用用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜通过固相吸附法对核酸进行分离纯化时，核酸的回收效率为80％以上(回收效率＝产出的核酸的量/投入的核酸的量×100％)；现有技术通过固相吸附法对核酸进行分离纯化时，核酸的回收效率很难超过70％，例如CN202011480478.0中提到未经纯化前的DNA浓度为83.12nm/L，使用玻璃纤维素膜或变性硅胶膜纯化后的DNA浓度为42.17nm/L，回收效率仅为50.7％；CN201080020635.8中采用磁珠法纯化DNA，投入DNA平均量为5.43μg，产出DNA平均量为1.24μg，回收效率仅为22.8％；CN201810136469.6中采用磁珠固相分离技术，对于小尺寸核酸的回收效率仅为65～70％左右。
本发明中利用硫酸铜、双氧水作为催化剂，加速邻苯二酚类化合物在聚合物多孔膜上的沉积。在邻苯二酚类化合物沉积过程中，硫酸铜作为氧化剂直接氧化邻苯二酚基团形成邻苯二醌基团，随后双氧水可产生大量活性氧ROS(ROS为引发多酚快速聚合所需的氧化剂，包括：羟基自由基、超氧自由基和单线态氧)加速邻苯二酚类化合物涂层的沉积，在聚合物多孔膜表面可获得高度均匀的涂层。
本发明中利用含羧基的邻苯二酚类化合物作为沉积原料，可在聚合物多孔膜表面引入大量可反应性羧基活性基团，为膜材料接枝多胺化合物提供可能。
本发明中采用的多胺化合物具有高密度、高数量的氨基，可为核酸分子的膜上吸附提供大量结合位点。
由于混合溶液C中含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和X，其作为酰胺化反应催化剂使得膜上引入的羧基与多胺化合物上伯氨基团之间发生酰胺化反应，在膜上接枝大量可发生质子化和去质子化转变的氨基，赋予膜材料pH响应性的电位变化，通过与呈负电的核酸分子之间的静电作用实现核酸分离纯化功能。
作为优选的技术方案：
如上所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，所述邻苯二酚类化合物为没食子酸、咖啡酸、原儿茶酸或3,4-二羟基苯基丙酸。
如上所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，所述多胺化合物为三乙烯四胺、四乙烯五胺、五乙烯六胺、六乙烯七胺、多乙烯多胺、聚乙烯亚胺或聚酰胺胺。
如上所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，所述聚合物多孔膜为聚醚砜膜、聚砜膜、聚苯砜膜、聚偏氟乙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚氯乙烯膜、乙烯-乙烯醇共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯膜或聚烯烃膜，包括但不限于此；所述聚合物多孔膜的平均孔径为0.01～5μm，厚度为20～2000μm，孔隙率为40％～85％。
如上所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，所述混合溶液A的制备过程为：先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为6.0～10.0的缓冲溶液中，得到浓度为0.1～5mg/ml的溶液，再向溶液中添加硫酸铜和双氧水得到混合溶液A。
如上所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，所述混合溶液A中硫酸铜的浓度为0.1～8mM，过氧化氢的浓度为0.1～30mM。
如上所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，所述聚合物多孔膜在混合溶液A中浸没的时间为1～60min，温度为20～60℃，所述聚合物多孔膜与所述混合溶液A的质量体积比为0.1～10mg:20～100ml。
如上所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，混合溶液C的制备过程为：先将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和X溶解在pH值为3.0～6.0的缓冲溶液中，得到混合溶液B，再向混合溶液B中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液C。
如上所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，混合溶液B中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为1～50mM，X的浓度为1～50mM；混合溶液C中多胺化合物的浓度为0.1～20mg/ml。
如上所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，所述改性膜在混合溶液C中浸没的时间为0.1～12h，温度为20～60℃，所述改性膜与所述混合溶液C的质量体积比为0.1～10mg:20～100ml。
本发明还提供采用如上任一项所述的制备方法制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的应用，步骤如下：
(1)将1～15张的pH响应性亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(2)向纯化柱中加入含有核酸的样品溶液与吸附缓冲液的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的30～100％，3000～9000g离心过滤20～240s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为4.0～7.0；
(3)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的30～100％，3000～9000g离心过滤20～240s，去除收集管中溶液；所述洗涤缓缓冲液为含有水溶性有机溶剂的溶液；
(4)向纯化柱中加入回收缓冲液，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的2～10％，3000～9000g离心过滤20～240s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为8.0～12.0，且高于洗涤缓冲液的pH值。
本发明通过使含有核酸的样品溶液与吸附缓冲液的混合溶液与所述亲和膜接触，使得所述核酸吸附到所述亲和膜上；通过使洗涤缓冲液与所述膜接触来洗涤该亲和膜，在此期间所述核酸仍吸附在该亲和上；通过使回收缓冲液与所述亲和膜接触，使得所述核酸从该亲和膜释放；通过合理控制各缓冲液的pH值保证其能够发挥相应的功能。
作为优选的技术方案：
如上所述的应用，步骤(2)中，所述含有核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为100bp～30kp，浓度为1～200ng/μl；所述含有核酸的样品溶液与所述吸附缓冲液的体积比为1:1～1:10；步骤(3)中，所述水溶性有机溶剂为C1～C3的醇类。
有益效果
(1)本发明的方法工艺简便，操作方便；
(2)本发明的方法采用的硫酸铜、双氧水的催化体系，可提高邻苯二酚类化合物的沉积涂覆效率，使得涂层具有均匀稳定的特点；
(3)本发明制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜，具有pH响应性，可实现正负电位的转变，可控制实现核酸分子的吸附、释放；
(4)本发明制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜，具有高密度的核酸结合位点，具有高效分离回收DNA功能，核酸回收效率为80％以上。
附图说明
图1为实施例1中聚醚砜亲和膜pH响应性测试结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以下各实施例和对比例中使用NanoDrop微量分光光度计测定纯化核酸溶液A260吸光度，表征纯化核酸溶液浓度及核酸回收效率，NanoDrop为表征核酸浓度的专用仪器，其测试原理为通过测定核酸溶液的A260吸光度给出核酸浓度。
实施例1
用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备；
混合溶液A：先将咖啡酸溶解在pH值为8.5的缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液)中，得到浓度为2mg/ml的溶液，再向溶液中添加硫酸铜和双氧水得到混合溶液A；其中，混合溶液A中硫酸铜的浓度为4mM，过氧化氢的浓度为20mM；
混合溶液C：先将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在pH值为5的缓冲溶液(磷酸盐缓冲液)中，得到混合溶液B，再向混合溶液B中添加聚酰胺胺，完全溶解得到混合溶液C；其中，混合溶液B中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为20mM，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为20mM；混合溶液C中聚酰胺胺的浓度为5mg/ml；
聚合物多孔膜为聚醚砜膜；其中，聚合物多孔膜的平均孔径为0.22μm，厚度为200μm，孔隙率为80％；
(2)按照0.1mg:20ml的质量体积比先将聚合物多孔膜浸没在温度为30℃的混合溶液A中30min，得到改性膜，再按照0.1mg:20ml的质量体积比将改性膜浸没在温度为30℃的混合溶液C中12h，得到用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜。
使用AntonPaarSurPASS3固体表面Zeta电位分析仪测试不同pH下的用于核酸分离纯化的pH响应性聚醚砜亲和膜的电位变化，其中pH测试范围为4.0～10.0，测试结果见附图1，在pH测试范围内，聚醚砜膜恒为负电位，而聚醚砜亲和膜伴随着pH值的减小发生了负电位向正电位的转变。
采用如上所述的制备方法制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将10张的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，9000g离心过滤30s，去除收集管中溶液；其中，吸附缓冲液的pH值为4；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小尺寸为400bp，浓度为100ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:5；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，9000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，9000g离心过滤60s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为10。
核酸的回收效率为87％。
对比例1
一种国产SiO2膜纯化柱的应用过程，具体步骤如下：
(I)准备一个市售的国产SiO2膜纯化柱(SanPrep Column PCR ProductPurification Kit，由生工生物工程(上海)股份有限公司生产)；
(II)向国产SiO2膜纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为国产SiO2膜纯化柱容量的80％，9000g离心过滤30s，去除收集管中溶液；其中，吸附缓冲液的pH值为4；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小尺寸为400bp，浓度为100ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:5；
(III)向国产SiO2膜纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为国产SiO2膜纯化柱容量的90％，9000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，pH值为7；
(IV)向国产SiO2膜纯化柱中加入回收缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为国产SiO2膜纯化柱容量的10％，9000g离心过滤60s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为10。
核酸的回收效率为55％。
与实施例1相比，对比例1的核酸的回收效率远低于实施例1的，这是因为实施例1中的聚醚砜亲和膜所具有的高密度、高数量的氨基为核酸分子的膜上吸附提供更强的结合能力；同时实施例1中的聚醚砜亲和膜基于氨基提供的pH响应性正负电位变化，可以提高核酸分子的释放效率。
实施例2
用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备；
混合溶液A：先将咖啡酸溶解在pH值为9.0的缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液)中，得到浓度为2mg/ml的溶液，再向溶液中添加硫酸铜和双氧水得到混合溶液A；其中，混合溶液A中硫酸铜的浓度为1mM，过氧化氢的浓度为5mM；
混合溶液C：先将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在pH值为5的缓冲溶液(磷酸盐缓冲液)中，得到混合溶液B，再向混合溶液B中添加聚乙烯亚胺，完全溶解得到混合溶液C；其中，混合溶液B中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为10mM，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为20mM；混合溶液C中聚乙烯亚胺的浓度为10mg/ml；
聚合物多孔膜为聚砜膜；其中，聚合物多孔膜的平均孔径为0.45μm，厚度为150μm，孔隙率为76％；
(2)按照0.5mg:30ml的质量体积比先将聚合物多孔膜浸没在温度为40℃的混合溶液A中5min，得到改性膜，再按照0.5mg:30ml的质量体积比将改性膜浸没在温度为40℃的混合溶液C中1h，得到用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜。
使用AntonPaarSurPASS3固体表面Zeta电位分析仪测试不同pH下的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的电位变化，其中pH测试范围为4.0～10.0，用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜伴随着氨基的质子化发生了负电向正电位的转变。
采用如上所述的制备方法制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将12张的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，9000g离心过滤30s，去除收集管中溶液；其中，吸附缓冲液的pH值为5.5；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小尺寸为3kb，浓度为1ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:4；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，9000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，9000g离心过滤60s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为8.5。
核酸的回收效率为82％。
实施例3
用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备；
混合溶液A：先将咖啡酸溶解在pH值为10.0的缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液)中，得到浓度为1mg/ml的溶液，再向溶液中添加硫酸铜和双氧水得到混合溶液A；其中，混合溶液A中硫酸铜的浓度为4mM，过氧化氢的浓度为20mM；
混合溶液C：先将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑溶解在pH值为4的缓冲溶液(磷酸盐缓冲液)中，得到混合溶液B，再向混合溶液B中添加多乙烯多胺，完全溶解得到混合溶液C；其中，混合溶液B中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为5mM，1-羟基苯并三唑的浓度为5mM；混合溶液C中多乙烯多胺的浓度为0.5mg/ml；
聚合物多孔膜为聚苯砜膜；其中，聚合物多孔膜的平均孔径为0.6μm，厚度为120μm，孔隙率为65％；
(2)按照5mg:40ml的质量体积比先将聚合物多孔膜浸没在温度为25℃的混合溶液A中15min，得到改性膜，再按照0.5mg:40ml的质量体积比将改性膜浸没在温度为25℃的混合溶液C中3h，得到用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜。
使用AntonPaarSurPASS3固体表面Zeta电位分析仪测试不同pH下的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的电位变化，其中pH测试范围为4.0～10.0，用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜伴随着氨基的质子化发生了负电向正电位的转变。
采用如上所述的制备方法制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将10张的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，9000g离心过滤30s，去除收集管中溶液；其中，吸附缓冲液的pH值为6；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小尺寸为4.8kb，浓度为200ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:4；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，9000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，9000g离心过滤60s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为11。
核酸的回收效率为80％。
实施例4
用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备；
混合溶液A：先将没食子酸溶解在pH值为7.0的缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液)中，得到浓度为4mg/ml的溶液，再向溶液中添加硫酸铜和双氧水得到混合溶液A；其中，混合溶液A中硫酸铜的浓度为0.5mM，过氧化氢的浓度为2.5mM；
混合溶液C：先将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑溶解在pH值为6的缓冲溶液(磷酸盐缓冲液)中，得到混合溶液B，再向混合溶液B中添加聚酰胺胺，完全溶解得到混合溶液C；其中，混合溶液B中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为30mM，1-羟基苯并三唑的浓度为30mM；混合溶液C中聚酰胺胺的浓度为10mg/ml；
聚合物多孔膜为聚偏氟乙烯膜；其中，聚合物多孔膜的平均孔径为1μm，厚度为150μm，孔隙率为75％；
(2)按照2mg:60ml的质量体积比先将聚合物多孔膜浸没在温度为50℃的混合溶液A中40min，得到改性膜，再按照2mg:60ml的质量体积比将改性膜浸没在温度为50℃的混合溶液C中7h，得到用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜。
使用AntonPaarSurPASS3固体表面Zeta电位分析仪测试不同pH下的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的电位变化，其中pH测试范围为4.0～10.0，用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜伴随着氨基的质子化发生了负电向正电位的转变。
采用如上所述的制备方法制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将10张的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，9000g离心过滤30s，去除收集管中溶液；其中，吸附缓冲液的pH值为4.5；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小尺寸为6kb，浓度为120ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:5；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，9000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，9000g离心过滤60s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为11。
核酸的回收效率为84％。
实施例5
用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备；
混合溶液A：先将没食子酸溶解在pH值为8.5的缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液)中，得到浓度为3mg/ml的溶液，再向溶液中添加硫酸铜和双氧水得到混合溶液A；其中，混合溶液A中硫酸铜的浓度为6mM，过氧化氢的浓度为30mM；
混合溶液C：先将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在pH值为3的缓冲溶液(磷酸盐缓冲液)中，得到混合溶液B，再向混合溶液B中添加六乙烯七胺，完全溶解得到混合溶液C；其中，混合溶液B中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为45mM，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为45mM；混合溶液C中六乙烯七胺的浓度为10mg/ml；
聚合物多孔膜为聚丙烯膜；其中，聚合物多孔膜的平均孔径为4μm，厚度为1500μm，孔隙率为60％；
(2)按照8mg:80ml的质量体积比先将聚合物多孔膜浸没在温度为30℃的混合溶液A中30min，得到改性膜，再按照8mg:80ml的质量体积比将改性膜浸没在温度为30℃的混合溶液C中9h，得到用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜。
使用AntonPaarSurPASS3固体表面Zeta电位分析仪测试不同pH下的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的电位变化，其中pH测试范围为4.0～10.0，用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜伴随着氨基的质子化发生了负电向正电位的转变。
采用如上所述的制备方法制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将1张的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，9000g离心过滤30s，去除收集管中溶液；其中，吸附缓冲液的pH值为6.5；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小尺寸为12kb，浓度为50ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:3；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，9000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，9000g离心过滤60s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为11.5。
核酸的回收效率为87％。
实施例6
用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备；
混合溶液A：先将原儿茶酸溶解在pH值为7.5的缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液)中，得到浓度为2mg/ml的溶液，再向溶液中添加硫酸铜和双氧水得到混合溶液A；其中，混合溶液A中硫酸铜的浓度为6mM，过氧化氢的浓度为25mM；
混合溶液C：先将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑溶解在pH值为6的缓冲溶液(磷酸盐缓冲液)中，得到混合溶液B，再向混合溶液B中添加聚乙烯亚胺，完全溶解得到混合溶液C；其中，混合溶液B中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为15mM，1-羟基苯并三唑的浓度为30mM；混合溶液C中聚乙烯亚胺的浓度为20mg/ml；
聚合物多孔膜为聚四氟乙烯膜；其中，聚合物多孔膜的平均孔径为2μm，厚度为1000μm，孔隙率为55％；
(2)按照0.1mg:20ml的质量体积比先将聚合物多孔膜浸没在温度为20℃的混合溶液A中20min，得到改性膜，再按照0.1mg:20ml的质量体积比将改性膜浸没在温度为20℃的混合溶液C中6h，得到用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜。
使用AntonPaarSurPASS3固体表面Zeta电位分析仪测试不同pH下的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的电位变化，其中pH测试范围为4.0～10.0，用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜伴随着氨基的质子化发生了负电向正电位的转变。
采用如上所述的制备方法制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将2张的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，9000g离心过滤30s，去除收集管中溶液；其中，吸附缓冲液的pH值为4；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小尺寸为8kb，浓度为30ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:3；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，9000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，9000g离心过滤60s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为7.5。
核酸的回收效率为90％。
实施例7
用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备；
混合溶液A：先将原儿茶酸溶解在pH值为8的缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液)中，得到浓度为4mg/ml的溶液，再向溶液中添加硫酸铜和双氧水得到混合溶液A；其中，混合溶液A中硫酸铜的浓度为4mM，过氧化氢的浓度为20mM；
混合溶液C：先将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑溶解在pH值为5的缓冲溶液(磷酸盐缓冲液)中，得到混合溶液B，再向混合溶液B中添加聚氯乙烯膜，完全溶解得到混合溶液C；其中，混合溶液B中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为3mM，1-羟基苯并三唑的浓度为6mM；混合溶液C中聚氯乙烯膜的浓度为10mg/ml；
聚合物多孔膜为聚氯乙烯膜；其中，聚合物多孔膜的平均孔径为0.05μm，厚度为200μm，孔隙率为70％；
(2)按照4mg:75ml的质量体积比先将聚合物多孔膜浸没在温度为35℃的混合溶液A中3min，得到改性膜，再按照4mg:75ml的质量体积比将改性膜浸没在温度为35℃的混合溶液C中12h，得到用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜。
使用AntonPaarSurPASS3固体表面Zeta电位分析仪测试不同pH下的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的电位变化，其中pH测试范围为4.0～10.0，用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜伴随着氨基的质子化发生了负电向正电位的转变。
采用如上所述的制备方法制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将6张的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，9000g离心过滤30s，去除收集管中溶液；其中，吸附缓冲液的pH值为5；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小尺寸为100bp，浓度为5ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:8；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，9000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，9000g离心过滤60s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)的pH值为10。
核酸的回收效率为92％。
实施例8
用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备；
混合溶液A：先将3,4-二羟基苯基丙酸溶解在pH值为8.5的缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液)中，得到浓度为0.5mg/ml的溶液，再向溶液中添加硫酸铜和双氧水得到混合溶液A；其中，混合溶液A中硫酸铜的浓度为0.5mM，过氧化氢的浓度为1mM；
混合溶液C：先将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在pH值为5.5的缓冲溶液(磷酸盐缓冲液)中，得到混合溶液B，再向混合溶液B中添加五乙烯六胺，完全溶解得到混合溶液C；其中，混合溶液B中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为2mM，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为2mM；混合溶液C中五乙烯六胺的浓度为1mg/ml；
聚合物多孔膜为乙烯-乙烯醇共聚物膜；其中，聚合物多孔膜的平均孔径为1.5μm，厚度为400μm，孔隙率为80％；
(2)按照0.1mg:20ml的质量体积比先将聚合物多孔膜浸没在温度为30℃的混合溶液A中10min，得到改性膜，再按照0.1mg:20ml的质量体积比将改性膜浸没在温度为30℃的混合溶液C中8h，得到用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜。
使用AntonPaarSurPASS3固体表面Zeta电位分析仪测试不同pH下的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的电位变化，其中pH测试范围为4.0～10.0，用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜伴随着氨基的质子化发生了负电向正电位的转变。
采用如上所述的制备方法制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将4张的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，9000g离心过滤30s，去除收集管中溶液；其中，吸附缓冲液的pH值为5；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小尺寸为5kb，浓度为150ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:8；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，9000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，9000g离心过滤60s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为12。
核酸的回收效率为82％。
实施例9
用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备；
混合溶液A：先将3,4-二羟基苯基丙酸溶解在pH值为6.5的缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液)中，得到浓度为0.5mg/ml的溶液，再向溶液中添加硫酸铜和双氧水得到混合溶液A；其中，混合溶液A中硫酸铜的浓度为3mM，过氧化氢的浓度为8mM；
混合溶液C：先将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在pH值为4.5的缓冲溶液(磷酸盐缓冲液)中，得到混合溶液B，再向混合溶液B中添加三乙烯四胺，完全溶解得到混合溶液C；其中，混合溶液B中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为4mM，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为50mM；混合溶液C中三乙烯四胺的浓度为10mg/ml；
聚合物多孔膜为聚乙烯膜；其中，聚合物多孔膜的平均孔径为3μm，厚度为600μm，孔隙率为48％；
(2)按照10mg:100ml的质量体积比先将聚合物多孔膜浸没在温度为60℃的混合溶液A中1min，得到改性膜，再按照10mg:100ml的质量体积比将改性膜浸没在温度为60℃的混合溶液C中2h，得到用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜。
使用AntonPaarSurPASS3固体表面Zeta电位分析仪测试不同pH下的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的电位变化，其中pH测试范围为4.0～10.0，用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜伴随着氨基的质子化发生了负电向正电位的转变。
采用如上所述的制备方法制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将3张的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，9000g离心过滤30s，去除收集管中溶液；其中，吸附缓冲液的pH值为4；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小尺寸为10kp，浓度为175ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:10；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，9000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，9000g离心过滤60s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为9。
核酸的回收效率为85％。
实施例10
用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备；
混合溶液A：先将咖啡酸溶解在pH值为8.5的缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液)中，得到浓度为4mg/ml的溶液，再向溶液中添加硫酸铜和双氧水得到混合溶液A；其中，混合溶液A中硫酸铜的浓度为0.3mM，过氧化氢的浓度为1.2mM；
混合溶液C：先将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑溶解在pH值为5的缓冲溶液(磷酸盐缓冲液)中，得到混合溶液B，再向混合溶液B中添加四乙烯五胺，完全溶解得到混合溶液C；其中，混合溶液B中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为50mM，1-羟基苯并三唑的浓度为10mM；混合溶液C中四乙烯五胺的浓度为2mg/ml；
聚合物多孔膜为聚丙烯膜；其中，聚合物多孔膜的平均孔径为5μm，厚度为350μm，孔隙率为65％；
(2)按照5mg:70ml的质量体积比先将聚合物多孔膜浸没在温度为45℃的混合溶液A中15min，得到改性膜，再按照5mg:70ml的质量体积比将改性膜浸没在温度为45℃的混合溶液C中5h，得到用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜。
使用AntonPaarSurPASS3固体表面Zeta电位分析仪测试不同pH下的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的电位变化，其中pH测试范围为4.0～10.0，用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜伴随着氨基的质子化发生了负电向正电位的转变。
采用如上所述的制备方法制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将5张的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，9000g离心过滤30s，去除收集管中溶液；其中，吸附缓冲液的pH值为7；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小尺寸为30kp，浓度为120ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:10；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，9000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，9000g离心过滤60s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为8.5。
核酸的回收效率为83％。
实施例11
用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备；
混合溶液A：先将没食子酸溶解在pH值为8.5的缓冲溶液(Tris-HCl缓冲溶液)中，得到浓度为2mg/ml的溶液，再向溶液中添加硫酸铜和双氧水得到混合溶液A；其中，混合溶液A中硫酸铜的浓度为5mM，过氧化氢的浓度为20mM；
混合溶液C：先将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑溶解在pH值为6的缓冲溶液(磷酸盐缓冲液)中，得到混合溶液B，再向混合溶液B中添加多乙烯多胺，完全溶解得到混合溶液C；其中，混合溶液B中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为4mM，1-羟基苯并三唑的浓度为20mM；混合溶液C中多乙烯多胺的浓度为17.5mg/ml；
聚合物多孔膜为聚甲基丙烯酸甲酯膜；其中，聚合物多孔膜的平均孔径为0.01μm，厚度为300μm，孔隙率为45％；
(2)按照3mg:50ml的质量体积比先将聚合物多孔膜浸没在温度为55℃的混合溶液A中5min，得到改性膜，再按照3mg:50ml的质量体积比将改性膜浸没在温度为55℃的混合溶液C中7h，得到用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜。
使用AntonPaarSurPASS3固体表面Zeta电位分析仪测试不同pH下的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的电位变化，其中pH测试范围为4.0～10.0，用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜伴随着氨基的质子化发生了负电向正电位的转变。
采用如上所述的制备方法制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将6张的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，9000g离心过滤30s，去除收集管中溶液；其中，吸附缓冲液的pH值为4；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小尺寸为100bp，浓度为50ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:2；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，9000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，9000g离心过滤60s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为9。
核酸的回收效率为86％。

Claims (10)

1.用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，其特征在于，先将聚合物多孔膜浸没在含邻苯二酚类化合物、硫酸铜和双氧水的混合溶液A中，得到改性膜，再将改性膜浸没在含多胺化合物、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和X的混合溶液C中，得到用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜；
邻苯二酚类化合物含羧基；
X为N-羟基琥珀酰亚胺或1-羟基苯并三唑；
利用用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜通过固相吸附法对核酸进行分离纯化时，核酸的回收效率为80％以上。
2.根据权利要求1所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，其特征在于，所述邻苯二酚类化合物为没食子酸、咖啡酸、原儿茶酸或3,4-二羟基苯基丙酸；所述多胺化合物为三乙烯四胺、四乙烯五胺、五乙烯六胺、六乙烯七胺、多乙烯多胺、聚乙烯亚胺或聚酰胺胺。
3.根据权利要求1所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，其特征在于，所述聚合物多孔膜的平均孔径为0.01～5μm，厚度为20～2000μm，孔隙率为40％～85％。
4.根据权利要求1所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，其特征在于，所述混合溶液A的制备过程为：先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为6.0～10.0的缓冲溶液中，得到浓度为0.1～5mg/ml的溶液，再向溶液中添加硫酸铜和双氧水得到混合溶液A；所述混合溶液A中硫酸铜的浓度为0.1～8mM，过氧化氢的浓度为0.1～30mM。
5.根据权利要求4所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，其特征在于，所述聚合物多孔膜在混合溶液A中浸没的时间为1～60min，温度为20～60℃，所述聚合物多孔膜与所述混合溶液A的质量体积比为0.1～10mg:20～100ml。
6.根据权利要求1所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，其特征在于，混合溶液C的制备过程为：先将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和X溶解在pH值为3.0～6.0的缓冲溶液中，得到混合溶液B，再向混合溶液B中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液C。
7.根据权利要求6所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，其特征在于，混合溶液B中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为1～50mM，X的浓度为1～50mM；混合溶液C中多胺化合物的浓度为0.1～20mg/ml。
8.根据权利要求7所述的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的制备方法，其特征在于，所述改性膜在混合溶液C中浸没的时间为0.1～12h，温度为20～60℃，所述改性膜与所述混合溶液C的质量体积比为0.1～10mg:20～100ml。
9.采用如权利要求1～8任一项所述的制备方法制得的用于核酸分离纯化的pH响应性亲和膜的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)将1～15张的pH响应性亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(2)向纯化柱中加入含有核酸的样品溶液与吸附缓冲液的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的30～100％，3000～9000g离心过滤20～240s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为4.0～7.0；
(3)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的30～100％，3000～9000g离心过滤20～240s，去除收集管中溶液；所述洗涤缓缓冲液为含有水溶性有机溶剂的溶液；
(4)向纯化柱中加入回收缓冲液，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的2～10％，3000～9000g离心过滤20～240s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为7.5～12.0，且高于洗涤缓冲液的pH值。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述含有核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为100bp～30kp，浓度为1～200ng/μl；所述含有核酸的样品溶液与所述吸附缓冲液的体积比为1:1～1:10；步骤(3)中，所述水溶性有机溶剂为C1～C3的醇类。
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