CN115154584A - 乳酸链球菌素协同增效苯唑西林抗多重耐药菌mrsa的应用及药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了乳酸链球菌素协同增效苯唑西林的抗菌应用及药物，将乳酸链球菌素NIS和苯唑西林钠OX联合使用，发现该组合可以使耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株对苯唑西林从耐药变为敏感，NIS和OX联用对MRSA具有协同抑菌作用，该作用通过体外和动物皮肤感染模型均得到验证。本发明将乳酸链球菌素和苯唑西林钠混合一起制成药物组合，控制MRSA感染时需要同时使用，或者将乳酸链球菌素和苯唑西林钠分别制成药物，控制MRSA感染时联合使用。

Description

乳酸链球菌素协同增效苯唑西林抗多重耐药菌MRSA的应用及 药物

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及乳酸链球菌素协同增效苯唑西林抗多重耐药菌MRSA的应用及药物。

背景技术

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是一种目前对一线抗生素普遍耐药的病原细菌，其造成的感染及其对抗菌药物的耐药性是全球公共卫生系统的主要威胁之一。MRSA的感染目前一般被认为有两种来源，一种为社区来源，另一种为医院来源。两种来源的MRSA菌株可能在毒力强弱上、感染形式上都有着一定的差异。除了临床感染外，MRSA也在食品中频频检出，这可能对公众健康产生潜在的威胁。MRSA的致病机制十分复杂，主要包括无症状的黏附定植、分泌毒力因子和产生生物膜。在耐药产生方面，目前MRSA菌株被认为通过产生β-内酰胺酶对甲氧西林以及其他的β-内酰胺类抗生素耐药，还有外排泵的高表达、产生于抗生素亲和力降低的胞内受体、产生生物膜等为MRSA菌株产生耐药性提供适应性的环境。

使用抗生素高效而直接的抑制和杀灭进入人体的病原菌的方式，依然是目前临床治疗细菌感染性疾病最为主要的策略，MRSA已对目前大多数抗生素产生抵抗力，用于治疗MRSA感染的抗生素目前为止主要包括有糖肽类-万古霉素、噁唑烷酮类-利奈唑胺和环脂肽类-达托霉素，但这些药物有较强的药品不良反应(adverse drug reaction，ADR)，且近年来有报道MRSA对上述敏感抗生素的MIC值有升高趋势。MRSA有关感染的治疗已不能完全依靠已有的绝大多数抗生素，且ADR限制了万古霉素、利奈唑胺和达托霉素的应用，因此，开发新型抗MRSA的抗生素或抑菌新策略至关重要。

目前，对于耐药细菌的抗生素替代方案及研究主要有天然产物替代疗法、抗菌光动力疗法(aPDT)、抗毒力疗法等，比如β-内酰胺类抗生素与克拉维酸的联用，已被证明能恢复β-内酰胺类抗生素耐药菌对抗生素的敏感性；某些具有抑菌效果的天然生物碱的开发，但目前相关研究大多还停留在体外试验，生物碱类物质成药预防与治疗病原菌及其生物膜的有效性和安全性还需要进一步研究；aPDT是一种新型抗菌方法，是光动力疗法的一个分支，主要在局部抗感染治疗中展现出优势，如口腔和皮肤感染等，局限性主要体现在应用范围上，其对于血流感染、肺部感染等深部组织感染及全身性感染效果有限。

苯唑西林(oxacillin，OX)称苯唑青霉素，分子式为C₁₉H₁₉N₃O₅S，OX对于耐青霉素的葡萄球菌具有较好的抗菌活性，而对青霉素敏感的各类球菌，抗菌活性则不如青霉素。临床上OX注射和口服给药均可，主要用于产β-内酰胺酶的葡萄球菌所致的各种感染性疾病，如皮肤感染、呼吸道感染和各种软组织感染，亦可用于脑膜炎、败血症、心内膜炎和烧伤感染等较为严重感染性疾病的治疗。OX与青霉素的抗菌机制相似，通过抑制细菌细胞壁粘肽合成酶PBPs来抑制细胞壁的合成，使细菌的细胞壁结构受到破坏，进而影响细菌生理功能，最后导致细菌死亡。而MRSA的耐药机制是产生被修饰过的PBPs即PBP2a，PBP2a不会被OX结合，另外MRSA细胞膜上有能够转运OX的外排泵，因此，OX对于MRSA感染的治疗往往是无效的。

乳酸链球菌素(nisin，NIS)是一种细菌素，为一种核糖体合成肽，由乳球菌属和链球菌属的一组革兰氏阳性菌所产生，是细菌次生代谢产物，具有广谱抗菌活性，是具有较长研究历史的天然抗菌肽之一，可有效抑制引起食品腐败的绝大多数革兰氏阳性菌。NIS属于天然抑菌成分，作为食品添加剂的安全性已经得到了公认，目前NIS作为食品防腐剂广泛使用，包括肉制品、乳制品以及果蔬等主要食品的生产和保存过程中。NIS的天然提取较为容易，获取量大，因此其开发和应用被认为有极高的应用价值。

目前，尚无任何关于苯唑西林OX和乳酸链球菌素NIS联用针对MRSA的报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供乳酸链球菌素协同增效苯唑西林的抗菌应用及药物，通过乳酸链球菌素NIS和苯唑西林钠OX联合用药提高了OX的药效，可以有效解决耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA对OX的耐药问题。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了乳酸链球菌素联合苯唑西林在制备抗多重耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的药物中的应用。

优选地，所述的药物为乳酸链球菌素协同增效苯唑西林抑菌的药物。

优选地，所述的药物为抑制MRSA的生物膜形成的药物。

优选地，所述的药物为破坏MRSA细胞壁和细胞膜形成的药物。

优选地，所述的药物为下调MRSA的OX耐药基因mecA的表达的药物。

本发明还公开了一种抗多重耐药菌MRSA的药物，该药物由乳酸链球菌素和苯唑西林组合形成。

优选地，协同使用时，1.6～3.2mg/mL乳酸链球菌素和<8μg/mL苯唑西林能够有效控制MRSA引起的感染。

进一步优选地，给药时，乳酸链球菌素和苯唑西林分开给药。

进一步优选地，给药时，乳酸链球菌素和苯唑西林同时给药或依次给药。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次揭示了乳酸链球菌素能够协同增效苯唑西林发挥抗菌作用，因而可以将其用于多重耐药菌MRSA的感染控制，将乳酸链球菌素NIS和苯唑西林钠OX联合使用，发现该组合可以使MRSA菌株对苯唑西林从耐药变为敏感，NIS和OX联用对MRSA具有协同抑菌作用，该作用通过体外和动物皮肤感染模型均得到验证。具体效果体现在：

1)NIS对MRSA的OX耐药具有逆转性，显著提高了MRSA对OX的敏感性。10μg/ml的OX药敏片对MRSA分离株Yn2020043、Yn2020070的抑菌圈直径分别为8mm、10mm，50mg/ml NIS单独作用的抑菌圈直径分别为8mm、6mm，NIS联用OX的抑菌圈直径为18mm、16mm，抑菌圈直径增加2.25倍、1.6倍。

2)NIS与OX联用具有协同抑菌作用，OX单独作用于MRSA分离株Yn2020043、Yn2020070的MIC为32μg/ml、16μg/ml，NIS单独作用的MIC为12.8mg/ml、12.8mg/ml，NIS联用OX的MIC分别为8μg/ml OX和3.2mg/ml NIS、4μg/ml OX和1.6mg/ml NIS，部分抑菌浓度指数FITC值为0.5、0.375，抑菌作用方式判定为协同作用。

3)NIS与OX联用可抑制MRSA的生物膜形成，MRSA分离株Yn2020043、Yn2020070均为强生物膜形成菌株，加入1/2MIC的药物培养24h，OX单用对MRSA分离株Yn2020043、Yn2020070生物膜抑制率分别为45.87％、24.11％，NIS单用的生物膜抑制率分别为54.67％、35.59％，NIS联用OX的生物膜抑制率分别为65.88％、66.07％。

4)OX联合NIS作用于MRSA，破坏了MRSA细胞壁和细胞膜，并影响胞内主要代谢酶的酶活，OX联合NIS作用于MRSA，扫描电镜观察结果显示，菌体整体向内皱缩，体积变小，部分细胞形状不再完整，有细胞表面出现明显向内凹陷，扫描电镜照片显示，出现菌体破损的碎片及泄露的菌体内容物。OX联合NIS作用于MRSA，培养物上清中可检测到胞内的碱性磷酸酶AKP酶活、Na⁺K⁺-ATP酶活和Ca²⁺-ATP酶活，并显著高于对照组和药物单用组(P<0.001)；细胞膜的破损率从未处理的1.01％分别增加至NIS处理21.9％、OX处理64.3％、NIS联用OX处理87.2％。

5)OX联合NIS作用于MRSA，可下调MRSA的OX耐药主要基因mecA的表达，这可能是耐药逆转的原因之一。

6)在MRSA感染的小鼠皮肤损伤模型中，OX联用NIS亦存在协同作用，且浓度越高伤口愈合效果越好；该联用对治疗MRSA感染的作用主要体现在对感染部位荷菌量的降低、感染部位炎症程度的降低以及伤口愈合的促进等。

本发明将乳酸链球菌素和苯唑西林钠混合一起制成药物组合，控制MRSA感染时需要同时使用，或者将乳酸链球菌素和苯唑西林钠分别制成药物，控制MRSA感染时联合使用。其中，所述乳酸链球菌素和苯唑西林钠混合制成药物组合物中，还可包含其他成分，所述两者分别制成药物组合物，使用时联合使用，还可以包含联合使用其他药学上可接受的成分。

附图说明

图1为平板抑菌圈法筛选MRSA菌株图片；其中，(a)为Yn2020043；(b)为Yn2020051；(c)为Yn2020070；

图2为OX和NIS单独及联合作用下各菌株的生长曲线绘制结果图；其中，(a)为MRSAYn2020043；(b)为MRSA Yn2020051；(c)为MRSA Yn2020070；(d)为ATCC 25923；

图3为OX联合NIS对菌株生物膜生成的影响结果图；其中，(a)为MRSA Yn2020043；(b)为MRSA Yn2020051；(c)为MRSA Yn2020070；(d)为ATCC 25923；

图4为OX和NIS单独及联合作用于Yn2020070的扫描电镜图；其中，(a)为PC组；(b)为NIS组；(c)为OX组；(d)为OX+NIS组；

图5为OX和NIS单独及联合作用于ATCC 25923的扫描电镜图；其中，(a)为PC组；(b)为NIS组；(c)为OX组；(d)为OX+NIS组；

图6为OX和NIS单独及联合作用于菌株的胞外AKP活性；其中，(a)为MRSAYn2020070；(b)为B.ATCC 25923；

图7为流式细胞仪测定Yn2020070各组于不同波长处所检测到的荧光细胞数量及发出规定波长范围内荧光的细胞所占比例；其中，(a)为PC组；(b)为NIS组；(c)为OX组；(d)为OX+NIS组；

图8为流式细胞仪测定ATCC 25923各组于不同波长处所检测到的荧光细胞数量及发出规定波长范围内荧光的细胞所占比例；其中，(a)为PC组；(b)为NIS组；(c)为OX组；(d)为OX+NIS组；

图9为OX和NIS联合作用对Yn2020070mecA基因的相对表达量水平的改变结果图；

图10为建模后第三天小鼠MRSA感染溃疡外观照片；其中，(a)为治疗性处理；(b)为预防性处理；

图11为治疗性处理后小鼠MRSA感染模型各部位每日愈合状况；

图12为预防性处理后小鼠MRSA感染模型各部位每日愈合状况；

图13为治疗和预防性处理中OX和NIS单独及联合作用下造模部位菌株存活率；其中，(a)为治疗组；(b)为预防组；

图14为治疗性处理小鼠伤口组织的HE染色的组织切片图像；其中，(a)为BC组；(b)为PC组；(c)为NIS组；(d)为OX组；(e)为OX+NIS组；

图15为预防性处理小鼠伤口组织的HE染色的组织切片图像；其中，(a)为BC组；(b)为PC组；(c)为NIS组；(d)为OX组；(e)为OX+NIS组。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明提供一种抗多重耐药菌MRSA和/或普通金黄色葡萄球菌的药物，由乳酸链球菌素和苯唑西林的组合而成，本发明通过体外、体内试验验证，乳酸链球菌素和苯唑西林两者合用具有良好的协同增效作用，对临床MRSA耐药菌株和金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923均有效。具体的实验内容如下：

一、菌株及实验动物

本领域将对苯唑西林耐药或头孢西丁耐药，且mecA基因阳性的金黄色葡萄球菌判定MRSA菌株，本发明实施例使用的MRSA菌株为某疾控中心的临床分离株；金黄色葡萄球菌ATCC 25923为标准株，存于本实验室。所有菌株均采用甘油冻存的方式存于-80℃冰箱。金葡菌培养于TSB液体培养基(37℃恒温振荡培养箱过夜培养)或固体平板上(37℃恒温培养箱中培养24h)。

实验动物为昆明鼠，9～11周龄，20-40g，雄性，购自西安交通大学医学部实验动物中心。

二、实验分组简介

本文所有实验分组及其简写分别为：

空白对照组(blank control，BC)

阳性对照组(positive control，PC)

溶剂对照组(solvent control，SC)

NIS单独作用组(NIS)

OX单独作用组(OX)

OX联用NIS组(OX+NIS)

三、OX与NIS联用对MRSA的抑制作用

1、平板抑菌实验

一次性接种环从平板上挑取单菌落于5mL/支的TSB液体培养基中，37℃恒温振荡培养24h。设置OX组、NIS组和OX+NIS组，提前室温解冻NIS母液并使用TSB液体培养基稀释，过夜菌稀释后，终OD₆₀₀为0.1，无菌棉签蘸取，涂布于平板。

以下为具体操作材料：1、苯唑西林药敏片(10μg/片)，2、15μL的NIS(0.05g/ml)，3、牛津杯，4、无菌TSB平板；“1”和“2”位置分别为OX组、NIS组，“2”滴进牛津杯，将“2”滴进“1”的位置为OX+NIS组，倒置37℃培养，至16小时，计算OX+NIS组抑菌圈增加倍数，以此来筛选实验菌株，计算公式：

式中：

A₁：苯唑西林药敏片加15μL 0.05g/m L的NIS位置抑菌圈直径；

A₂：苯唑西林药敏片位置的抑菌圈直径。

参见图1，图1中标记1为OX，2为NIS，3为OX+NIS。结果显示，对于MRSA Yn2020043、Yn2020051、Yn2020070、ATCC 25923，药物联用后的抑菌圈扩大倍数分别为1.250、0.500、0.600、0.125，均显著高于OX、NIS单独使用时的抑菌圈直径。

2、微量肉汤稀释法测定药物单独使用对MRSA的MIC

使用纯水将苯唑西林钠固体溶解为1.920mg/m L，0.22μm无菌滤器过滤除菌，-20℃备用。使用时按实验需求稀释至所需浓度。

NIS溶液，7％浓盐酸使用超纯水配制为0.01mol/L pH＝2的稀盐酸，电子天平称取NIS粉末，使NIS与稀盐酸以1g：10m L的比例进行充分溶解，装入50m L/支离心管，放入离心机，2500rpm，1min，取上清，再用0.22μm规格的细菌过滤器过滤上清液，配制成100mg/m L的无菌NIS母液，0.22μm无菌滤器过滤除菌，-20℃备用，使用时按实验需求稀释至所需浓度。

使用微量肉汤稀释法测定NIS和OX对MRSA菌株的MIC。一次性接菌环于平板上挑取一单菌落，转入5m L/支TSB，24h，37℃恒温振荡。使用无菌TSB培养基稀释菌液至OD₆₀₀为0.1。

使用TSB液体培养基分别倍比稀释NIS和OX，NIS的终浓度为12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05mg/m L，OX的终浓度为0.256、0.128、0.064、0.032、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001mg/ml，NIS和OX设置BC，TSB液体培养基稀释稀盐酸备用，使其稀释后的浓度与51.2mg/m L NIS稀释液中的盐酸浓度相等；处理孔每孔加入150μL OD₆₀₀＝0.1的菌液和50μL稀释后的NIS和OX，BC组每孔加入200μL无菌TSB液体培养基，以SC组为PC组，每孔加入150μL OD₆₀₀＝0.1的菌液和50μL的盐酸稀释液，每个组设置三个重复孔，加样后于37℃，16～18h，肉眼不见孔内液体浑浊所对应最小浓度为MIC。

结果显示，以ATCC 25923为标准菌株，通过微量肉汤稀释法测定两种化合物对于各菌株单独作用时的MIC值，对于OX，三株MRSA菌株Yn2020043、Yn2020051、Yn2020070和ATCC 25923的MIC分别为32μg/mL、64μg/mL、16μg/mL和8μg/mL；对于NIS，三株MRSA菌株及标准株的MIC均为12.8mg/mL。

3、棋盘法联合抑菌试验测定FICI，确定药物联用的抑菌作用方式

通过棋盘法联合抑菌试验的方法来测定，使用NIS和OX浓度为2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC。

处理孔滴加50μL体积的NIS和OX稀释液，菌液使用TSB液体培养基稀释至OD600＝0.1，各个处理孔加入150μL稀释后菌液，PC孔加入150μL稀释后的菌液和50μL TSB液体培养基，BC孔加200μL的TSB液体培养基，37℃的恒温培养16～18h，获得最佳抑菌联合时NIS和OX两个化合物各自的MIC值，计算部分抑菌浓度指数(fractional inhibitoryconcentration index，FICI)。计算公式：

式中

B₁：联合的NIS的MIC；

B₂：NIS单独用时的MIC；

B₃：联合的OX的MIC；

B₄：OX单独用时的MIC。

结果认定：如果FICI>2，则为无关；如果1<FICI≤2，则为无相关；如果是0.5<FICI≤1，则为相加；如果FICI≤0.5，则为协同。

结果如下表1所示：

表1 棋盘法联合抑菌试验测定各菌株对OX联合NIS作用的FICI值

由表1可以看出，当两种化合物联合时，对于Yn2020043，OX和NIS的MIC分别下降至8μg/mL和3200μg/mL，对于Yn2020051，OX和NIS的MIC分别下降至16μg/mL和3200μg/mL，对于Yn2020070，OX和NIS的MIC分别下降至4μg/mL和1600μg/mL，而对于ATCC 25923，OX和NIS的MIC分别下降至4μg/mL和6400μg/mL，根据公式计算得到，Yn2020043、Yn2020051、Yn2020070和ATCC 25923的FICI值分别为0.500、0.500、0.375和1.000。

根据FICI的结果判定方法，认为OX和NIS联合作用时对三株MRSA菌株均为协同抑制作用，而对于ATCC 25923，认为是相加作用。

4、NIS联用OX作用下MRSA的生长曲线

NIS和OX稀释至所需浓度，使加样后浓度为棋盘法联合抑菌试验结果显示的最佳联合MIC。设置BC组、PC组、SC组、NIS组、OX组和OX+NIS组，活化后的菌液稀释至OD600＝0.1，BC组每孔为200μL TSB液体培养基，PC组每孔加入150μL稀释后菌液和50μL TSB液体培养基，NIS组每孔加入150μL稀释后菌液和50μL相应浓度NIS，OX组每孔加入150μL稀释后菌液和50μL相应浓度OX，OX+NIS组每孔加入150μL稀释后菌液和50μL相应浓度OX和NIS，SC组每孔加入150μL稀释后菌液和50μL相应浓度的稀盐酸，使最终浓度与相对应菌株的NIS组中盐酸的浓度相等。加样后的96孔板立即放入酶标仪，设置自动测定程序，595nm处，24h，间隔1h，总时长24h，程序执行完毕后获取读数。根据时长和OD595的值绘制菌株生长曲线。

结果如图2所示，可以看出，各个菌株SC组的生长曲线在各期与PC组基本重合，依然呈典型生长规律。Yn2020043的OX+NIS组生长曲线则与其余各组相比在24h时菌的OD值最低。Yn2020051的OX+NIS组的生长曲线在24h时菌的OD值较OX组更低，对数生长期的增殖速度与各组相比最低，整体增殖迟缓。Yn2020070的OX+NIS组24h时OD值较OX组显著降低，整体增殖速度为各处理组最低。ATCC 25923的OX+NIS组对数生长期推迟至10h出现，20h进入平台期，24h时菌株的OD值与OX组基本相同。

5、结晶紫染色法测定OX联用NIS对MRSA菌株的生物膜形成的影响

使用结晶紫半定量法测定生物膜。培养过程中加入葡萄糖可提高MRSA的生物膜生成量，为使实验敏感性提高，使用高糖TSB培养基，葡萄糖浓度设置为0.5％，培养基配制过程为：纯水配制20％的葡萄糖备用，取12.5mL加入487.5mL TSB液体培养基中，分装至5mL/支试管中，121℃，15min，为高糖TSB液体培养基。高糖TSB液体培养基活化后的菌液，稀释至OD₆₀₀＝1。NIS和OX用高糖TSB稀释至所需浓度，使加样后浓度为棋盘法联合试验结果显示的最佳联合1/2MIC，组别设置为PC组、NIS组、OX组和NIS+OX组。每孔加样总体积为200μL，BC组每孔200μLTSB液体培养基，对照组和处理组每孔加入OD₆₀₀＝1的菌液为150μL，加入相应浓度的稀释液50μL，溶剂对照组设置同2.3.1.4)，每孔设置3个重复，加样完毕后放入37℃的恒温培养箱24h后取出检测生物膜。

6、结晶紫染色法测定OX联用NIS对MRSA菌株的生物膜形成的影响

使用结晶紫半定量法测定生物膜。培养过程中加入葡萄糖可提高MRSA的生物膜生成量，为使实验敏感性提高，使用高糖TSB培养基，葡萄糖浓度设置为0.5％，培养基配制过程为：纯水配制20％的葡萄糖备用，取12.5mL加入487.5mL TSB液体培养基中，分装至5mL/支试管中，121℃，15min，为高糖TSB液体培养基。高糖TSB液体培养基活化后的菌液，稀释至OD₆₀₀＝1。NIS和OX用高糖TSB稀释至所需浓度，使加样后浓度为棋盘法联合试验结果显示的最佳联合1/2MIC，组别设置为PC组、NIS组、OX组和NIS+OX组。每孔加样总体积为200μL，BC组每孔200μL TSB液体培养基，对照组和处理组每孔加入OD₆₀₀＝1的菌液为150μL，加入相应浓度的稀释液50μL，溶剂对照组设置同2.3.1.4)，每孔设置3个重复，加样完毕后放入37℃的恒温培养箱24h后取出检测生物膜。

根据生物膜形成能力判断标准，3株实验菌株和标准菌株均为生物膜阳性菌株，且黏附能力均为强黏附，即均有较强的生物膜形成能力，具体见表2：

表2 结晶紫染色生物膜形成能力界定

培养至24h，对于Yn2020043，处理组生物膜生成量均有减少，1600μg/mL NIS、4μg/mLOX、1600μg/mL NIS与4μg/mL OX联用下生物膜的生成量均低于PC组(t＝14.962，P<0.001；t＝9.305，P<0.001；t＝19.565，P<0.001)，两药联用下的生物膜生成量低于OX单独作用(t＝4.111，P<0.05)；对于Yn2020070，2μg/mL OX、800μg/mL NIS与2μg/mL OX联用下生物膜生成量均低于PC组(t＝3.417，P<0.05；t＝10.938，P<0.001)，联用下的生物膜生成量较NIS和OX单独作用下均低，差异均有统计学意义(t＝5.612，P<0.01；t＝4.324，P<0.05)。对于ATCC 25923，2μg/mL OX单独作用刺激菌株产生较多生物膜，较PC组生成量高(t＝10.865，P<0.001)，OX组与NIS组相比生物膜生成量高，差异有统计学意义(t＝14.255，P<0.001)，3200μg/mL NIS和2μg/mL OX联用下的生物膜生成量较OX单独作用下低(t＝12.317，P<0.001)，PC组、NIS组和OX+NIS组三组间差异无统计学意义(P>0.05)。(结果见图3)。

四、OX联用NIS对MRSA的抑菌机制

以下抑菌机制实验选择MRSA Yn2020070和ATCC25923.

1、MRSA菌体形态学变化

通过台式扫描电子显微镜观察OX与NIS联合对MRSA的表面形态的影响。提前活化的菌株转接入100mLTSB液体培养基，37℃恒温振荡培养15h后，NIS组配入NIS，终浓度为上述棋盘法联合抑菌试验中最佳OX和NIS联合中NIS浓度的两倍，OX组配入OX，终浓度为上述棋盘法联合抑菌试验中最佳OX和NIS联合中的OX浓度的两倍，OX+NIS组配入OX和NIS，两药物分别的终浓度与本实验中NIS组和OX组中相等，PC组加入无菌PBS，各组处理过程中加入的总液体体积相等，加入药物后再次置入恒温振荡培养箱，37℃，10h培养后，8000rpm，15min，离心收集各组菌体，灭菌PBS洗涤三次，加入2％戊二醛浸泡，4℃过夜后上机检测。

参见图4，图4中，红色箭头指向不规则形变；黄色箭头指向表面向内凹陷；蓝色箭头指向菌体破损及碎片；绿色箭头指向菌体内容物(×20000)。结果显示，Yn2020070的PC组菌体颗粒饱满，整体呈经典的近球形，表面光滑，完整无破损；3200μg/mL的NIS处理10h后，菌体依然饱满，呈近球形，与PC组相比菌体体积无明显改变，有菌体出现不规则形变和凹陷；8μg/mL的OX处理后，菌体体积略微增大，形状无明显改变，有菌体表面出现细小凹陷；3200μg/mL的NIS和8μg/mL的OX联合处理的OX+NIS组，菌体整体向内皱缩，体积变小，部分细胞形状不再完整，有细胞表面出现明显向内凹陷，画面内出现菌体破损的碎片及泄露的菌体内容物。

参见图5，图中红色箭头指向不规则形变，黄色箭头指向表面向内凹陷，蓝色箭头指向菌体破损及碎片，绿色箭头指向菌体内容物(×20000)。ATCC 25923的PC组菌体饱满，呈近球形，表面光滑完整，无破损；12800μg/mL的NIS处理后，菌体表面有明显的向内凹陷，出现细胞内容物流出，其余与PC组相比无明显改变；8μg/mL的OX处理后，菌体颗粒较PC组更圆，菌体有破裂和出现不规则形变，有内容物外泄；OX+NIS组处理下，菌体明显向内凹陷，出现菌体破损，菌体内容物有外泄。

2、对MRSA细胞壁完整性的影响

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)在细菌细胞膜和壁间，细胞壁受损伤，通透性增加，AKP泄出即可在胞外检测出酶活，AKP活性间接反应胞壁损伤度。

活化后的Yn2020070和ATCC 25923菌株转接入100mL TSB液体培养基，37℃恒温振荡培养箱12h，富集菌液至OD600＝10，移入2mL/支灭菌离心管，两个不同浓度的NIS组、OX组均配入稀释后的NIS，终浓度为棋盘法联合抑菌试验所得的最佳OX和NIS联合中NIS浓度、OX浓度的两倍和四倍，OX+NIS组所配入的OX和NIS终浓度与本实验中对应浓度的NIS组和OX组相等，PC组加入无菌PBS，各组加入总液体体积相等，再次置入恒温振荡培养箱，37℃，2h，取出后8000rpm，10min离心收集各组上清，用试剂盒检测AKP活性，于520nm处测量OD值。

式中：

D₁：标准孔OD₅₉₅测定值；

D₂：测定孔OD₅₉₅测定值；

D₀：空白孔OD₅₉₅测定值。

参见图6，结果显示，Yn2020070和ATCC 25923的PC组AKP在胞外检测到其活性较低，而各处理组活性均有上升，两菌株OX+NIS组的酶活性为四个分组内最高。对于Yn2020070，2MIC浓度下菌PC组与OX组差异有统计学意义(t＝8.965，P<0.001),OX组活性低于OX+NIS组，差异有统计学意义(t＝17.088，P<0.001)。对于ATCC 25923，NIS组与OX+NIS组差异有统计学意义(t＝21.095，P<0.001)。

3、对MRSA细胞膜完整性的影响

核酸染料碘化丙啶(propidium iodide，PI)为一种可插入DNA的荧光探针，与细菌核酸结合后发出红色荧光，PI不能穿过完整的菌的胞膜，若PI染色后检测到菌体发出红色荧光则认为该菌体细胞膜被破坏。

把活化后的菌液用TSB液体培养基稀释至4×10⁶CFU/mL，以500μL/支分装入2mL/支离心管中，每组进行相应处理，即NIS组配入NIS、OX组配入OX，终浓度均为上述棋盘法联合抑菌试验中最佳OX和NIS联合中NIS浓度和OX浓度的1.5倍，OX+NIS组配入OX和NIS分别的终浓度与本实验NIS组和OX组中相等，PC组加无菌PBS，过程中各组加入的总液体体积相等，置入恒温振荡培养箱中4h后取出备用。PI染色流程参考试剂盒说明，上样前使用300目的灭菌筛网过滤。

结果显示，与PC组相比，经过2400μg/mL的NIS、6μg/mL的OX单独作用和NIS与OX联合作用4h后的MRSA菌株Yn2020070的PI染色菌体细胞百分比从1.01％分别增加到21.9％、64.3％和87.2％(结果如图7所示)；标准株ATCC 25923，与PC组相比，经过9600μg/mL的NIS、6μg/mL的OX单独作用和NIS与OX联合作用4h后菌株的PI染色菌体百分比从0.68％分别增加到26.3％、77.8％和64.1％(结果如图8所示)。

4、对MRSA的mecA基因相对表达的影响

过夜活化后的菌液转接至5mL/支的TSB液体培养基中，37℃恒温振荡培养12h，测量过夜菌液的OD₆₀₀，根据OD₆₀₀的值将菌液浓度调整至1×10⁶CFU/mL备用。设置PC组、NIS组、OX组和OX+NIS组，每组2.5mL菌液，用TSB培养基稀释药物，以上述棋盘法联合抑菌试验中最佳OX和NIS联合浓度的3/2MIC为各组药物作用浓度，PC组加入无菌PBS，各组药液加入的总体积相等，37℃，振荡培养5h，取出备用。

采用细菌RNA抽提试剂盒提取细菌RNA，分装置于-80℃保存；使用反转录cDNA试剂盒进行反转录。根据以上测得的RNA浓度计算反应体系的配比，去基因组DNA过程的体系(0.1ng模板RNA、1μL gDNA Purge、RNase Free Water补足体系至20μL)，混匀后置于PCR仪中42℃，5min，结束后置于冰上，取其反应产物进行逆转录反应的体系配制(10μL第一步反应液、

Plus 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix)，配制后置于PCR仪中50℃，15min，反应产物立即用于RT-qPCR。按照RT-qPCR试剂盒说明书操作，体系配制完毕后使用荧光定量PCR仪进行反应(以16sRNA为内参按照2^-ΔΔCt的方法计算各组mecA的mRNA相对表达量)。

参见图9，RT-qPCR结果发现，NIS的单独作用下，mecA相对表达量降低，在NIS组和PC组间差异有显著性(t＝9.143，P<0.001)，OX单独作用时，与PC相比mecA相对表达升高，差异有显著性(t＝11.140，P<0.001)，OX与NIS联用时与OX单用时相比mecA表达量显著降低，差异有显著性(t＝6.197，P<0.01)。

五、OX联用NIS对小鼠MRSA感染皮肤模型的疗效评价

1、建立小鼠MRSA感染皮肤模型

选用昆明鼠，模型制备前三天开始适应性饲养，SPF级环境，配置充足的食物和饮水，固定温度、湿度。对数生长后期菌株细胞离心弃上清，无菌PBS三次洗涤，无菌PBS重悬为低浓度(1×10⁶CFU/mL)、中浓度(1×10⁷CFU/mL)和高浓度(1×10⁸CFU/mL)。小鼠麻醉后固定，用小型宠物刮毛刀将小鼠背部毛发刮去，标记，消毒。干用无菌镊子将整块皮肤提起使两层皮肤折叠，消毒后的打孔器将两层皮肤穿孔，形成直径为4mm的正圆形溃疡。每一小鼠背部左一和右一为PC组，左二和右二为NIS组，左三和右三为OX组，左四和右四为OX+NIS组。每个位置均滴加相应浓度菌液6μL，处理组滴加相应浓度8μg/mL OX、3200μg/mL NIS及其联合的稀释液体积均为6μL，PC组滴加无菌PBS 6μL。苏醒后的小鼠每只均单独饲于独立并且通气的饲养笼中。每日继续观察造模位置变化，个体的生存状态，记录至PC组伤口基本愈合。感染菌株和药物处理的时间相差5h，先感染后处理为治疗性处理组，反之为预防性处理组，

第三天，两组小鼠个体PC组溃疡部位均出现微黄色分泌物，边缘轻微水肿，见图10。继续每日观察并记录，两组小鼠均活力良好，体重有增加。认为建模成功。

2、治疗性处理对小鼠MRSA感染部位愈合状况的影响

建模后第三天，PC组和NIS组的位置均出现了明显的微黄色分泌物，而这两组的溃疡面积大于BC组和OX+NIS组，同时OX组仅出现少量的分泌物，且溃疡面积也介于OX+NIS组和BC组之间；第五天，除PC组之外，其余各组分泌物基本吸收，OX+NIS组和BC组溃疡的面积显著小于PC组和NIS组，OX组则介于之间；第十二天，OX+NIS组和BC组基本愈合，OX组愈合稍慢，NIS组和PC组次之；OX+NIS组的愈合速度与BC组相近，见图11。

3、预防性处理对小鼠MRSA感染部位愈合状况的影响

建模后第三天，PC组和NIS组的溃疡均出现明显的微黄色分泌物，OX组溃疡产生的分泌物相对较少，PC组、NIS组和OX组的溃疡面积明显大于BC组和OX+NIS组；第五天所有分泌物基本吸收，OX+NIS组和BC组的面积小于PC组、NIS组和OX组；第八天，OX+NIS组的溃疡基本愈合，而BC组的溃疡愈合稍慢，NIS组、PC组和OX组预防的溃疡次之；OX+NIS组的愈合速度略快于BC组，见图12。预防性处理的OX+NIS组愈合时间短于治疗性处理的OX+NIS组。

4、对小鼠MRSA感染部位荷菌量的影响

第三天，治疗性处理组和预防性处理组处死小鼠中各随机取3只，使用无菌眼科剪从每一个造模部位切割2.5×5mm皮肤组织(处理组从两重复中取其中一个)，小心剔除周围毛发，放入1.5mL灭菌EP管中。将灭菌后还未冷却凝固的MRSA快速显色培养基放置在46±1℃的水浴锅内备用，从4℃取待测组织，室温下静置20min。1.5mL/支的EP管内加入1mL无菌PBS，灭菌后的镊子夹取组织置于其中，涡旋振荡器混匀，再将组织夹出留取液体，用无菌PBS稀释，平板计数法在MRSA快速显色培养基37℃培养18h，计数粉红菌落数量为感染部位的MRSA荷菌量。

治疗性处理中，NIS组、OX组和OX+NIS组的菌株存活率，均低于PC组，差异有统计学意义(t＝4.821，P<0.05；t＝6.262，P<0.001；t＝10.33，P<0.001)；OX+NIS组菌株存活率与单一处理的NIS组、OX组相比均低，差异有统计学意义(t＝5.507，P<0.001；t＝4.067，P<0.05)。预防性处理中，NIS组、OX组和OX+NIS组的菌株存活率均低于PC组，差异有统计学意义(t＝8.636，P<0.001；t＝9.780，P<0.001；t＝11.090，P<0.001)。见图13。

5、对小鼠MRSA感染部位组织病理学变化影响

取样同5.5.4，无菌PBS将取下的组织充分漂洗后浸入4％多聚甲醛组织固定液(组织与固定液体积比小于1：5)，4℃过夜固定，7天内采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色法制片，倒置显微镜100倍下观察并拍照。

建模后第三天，治疗性处理的PC、NIS和OX三个部位的表皮和毛孔角质层细胞严重增大，角质层增厚，OX+NIS治疗部位则相比呈轻微增大，而BC角质层细胞未见明显增大，PC、NIS和OX三个部位角质层厚度大于OX+NIS治疗和BC；PC和OX治疗部位的角质层下细胞排列最为紧密，NIS治疗部位次之，而OX+NIS治疗部位介于BC和NIS治疗部位之间；与BC相比，PC、NIS和OX部位的角质层下炎症细胞聚集度较高，而OX+NIS治疗的部位介于PC和其他受感染部位之间。见图14。

参见图15，可以看出，预防性处理的PC、NIS和OX三个部位表皮和毛孔的角质层细胞亦出现明显增大，OX+NIS预防和BC的角质层细胞未见明显增大；与BC相比，PC和OX治疗部位的角质层下细胞排列更紧密，而OX+NIS治疗和NIS治疗部位介于BC和其他受感染部位之间；PC的炎症细胞聚集程度最高，OX预防部位次之，NIS预防部位再次，而OX+NIS治疗部位几乎未出现炎症细胞聚集，BC部位介于OX+NIS治疗和其他处理部位之间。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (9)

1.乳酸链球菌素联合苯唑西林在制备抗多重耐药菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为乳酸链球菌素协同增效苯唑西林抑菌的药物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制MRSA的生物膜形成的药物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为破坏MRSA细胞壁和细胞膜形成的药物。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为下调MRSA的OX耐药基因mecA的表达的药物。

6.一种抗多重耐药菌MRSA的药物，其特征在于，该药物由乳酸链球菌素和苯唑西林组合形成。

7.根据权利要求6所述的抗多重耐药菌MRSA的药物，其特征在于，协同使用时，1.6～3.2mg/mL乳酸链球菌素和<8μg/mL苯唑西林能够有效控制MRSA引起的感染。

8.如权利要求7所述的抗多重耐药菌MRSA的药物，其特征在于，给药时，乳酸链球菌素和苯唑西林分开给药。

9.如权利要求7所述的抗多重耐药菌MRSA的药物，其特征在于，给药时，乳酸链球菌素和苯唑西林同时给药或依次给药。

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