CN115137821A - 一种金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物及其制备方法和应用,属于药剂学技术领域,解决金纳米棒表面功能化过程较为复杂、对功能化基团的化学结构特征要求较高的技术问题,解决方案为:组成及浓度比为:光热剂:邻苯二酚锚定剂=1:(1~4.5);其中,光热剂为AuNR@CTAB金纳米棒,邻苯二酚锚定剂为绿原酸,通过AuNR@CTAB金纳米棒和绿原酸一步法组装获得,可以应用于协同治疗骨肉瘤并诱导骨组织再生的药物中。本发明制备方法简单,具有普适性,金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物结构精确、水溶性好,具有优异且可调控的光热性能,具有良好的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于药剂学技术领域,具体涉及的是一种金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物及其制备方法和应用。
背景技术
手术干预联合化疗/放疗是治疗骨肉瘤的常用方法,然而手术切除会造成切除后残余肿瘤病灶区难以清除并易导致肿瘤转移与复发,切除部位大面积骨缺损等问题。同时,化疗/放疗由于选择性低、副作用严重,可能会引起多药耐药。目前,生物活性纳米系统、3D打印植入物和支架等多功能平台已被探索用于协同抑制肿瘤生长和促进骨再生。值得注意的是,光热治疗是以特定波长的光对肿瘤病灶区进行照射,利用光热转换剂将光能转化为热能,使病灶部位局部升温从而杀死肿瘤细胞的一种非侵入性的治疗方法,由于其高选择性和微创性,在近红外激光照射下能精准地靶向肿瘤,同时对周围正常组织的损伤降到最低,对骨肉瘤显示出潜在的治疗效果。此外,黑磷、AuPd合金纳米颗粒和碳纳米管等光热剂能产生温和的局部热量,用于成骨和生物矿化。
金纳米棒制备方法简便,具有合适的长径比,对近红外辐射(650-900 nm)有较强的吸收和散射能力,光热转换能力突出,是一种优异的光热剂,但覆盖在金纳米棒表面的阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵具有很强的细胞毒性,限制了其生物应用。虽然可以通过聚合物、蛋白、多肽等对其表面修饰,降低毒性,提高生物相容性。然而,目前金纳米棒表面功能化过程较为复杂、对功能化基团的化学结构特征要求较高,为其功能化增加了难度。因此,需要开发一种简单易操作的方法实现其表面功能化,实现良好的光热效应使其应用于抑制骨肿瘤并促进骨修复。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点,解决金纳米棒表面功能化过程较为复杂、对功能化基团的化学结构特征要求较高的技术问题,本发明提供一种金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物及其制备方法和应用,由金纳米棒和邻苯二酚类化合物绿原酸一步法组装获得,通过调节特定部位的热量以抑制骨肉瘤生长并促进骨修复,具有良好的实际应用价值。
本发明通过以下技术方案予以实现:
一种金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物,其组成及浓度比为:光热剂:邻苯二酚锚定剂=1:(1~4.5);其中,光热剂为AuNR@CTAB金纳米棒,邻苯二酚锚定剂为绿原酸。
邻苯二酚类化合物又称儿茶酚类化合物,是苯的两个邻位氢被羟基取代后形成的化合物。天然邻苯二酚类化合物包括单宁、儿茶素、木脂素和许多其他生物活性分子等。在本发明提供的金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物中,选择的邻苯二酚类化合物是一种具有抗氧化、抗肿瘤和促进软骨修复等多种药理活性的绿原酸。
进一步的,所述金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物呈棒状结构,金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物的直径为64~70 nm,长径比为3.4~3.8,纵向等离子共振吸收峰为800±10nm。
一种金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物的制备方法,包括以下步骤:首先,通过种子生长法制得AuNR@CTAB金纳米棒;然后,将AuNR@CTAB金纳米棒与绿原酸溶液以浓度比1:(1~4.5)混合后放在摇床上孵育18~24 h,孵育后获得的混合液进行离心分离,转速为9000~10000 rpm,离心分离时间为20~30 min,采用超纯水洗涤离心液至少两次,沉淀物重新分散在超纯水中,制得金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物。本发明通过Au-邻苯二酚键修饰AuNR@CTAB的表面,一步法组装形成金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物(AuNR@CA)。
上述金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物可以应用于协同治疗骨肉瘤并诱导骨组织再生的药物中。
与现有技术相比本发明的有益效果为:
本发明制备方法简单,具有普适性,金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物结构精确、水溶性好,具有优异且可调控的光热性能,可用于协同治疗骨肉瘤并诱导骨组织再生,具有良好的实际应用价值。
附图说明
图1是本发明所述金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物应用于药物的工作原理示意图。
图2是本发明中金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物的透射电子显微镜图。
图3是本发明中金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物的粒径大小图。
图4是本发明中金纳米棒与邻苯二酚化合物绿原酸相互作用的傅里叶红外光谱图。
图5是本发明中金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物的水溶性图。
图6是本发明中金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物的紫外可见吸收光谱图。
图7是本发明中金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物在NIR激光(808nm,2.0W·cm-2)照射下在不同时间点的红外图像。
图8是本发明中金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物在NIR激光(808nm,2.0W·cm-2)照射下的升温曲线。
图9是本发明中金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物在四个开/关激光(808nm,2.0W·cm-2)照射过程中的温度变化曲线。
图10是本发明中金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物在SNIR激光照射前后Saos-2细胞存活率。
图11是本发明中金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物在SNIR激光照射前后Saos-2细胞凋亡情况。
图12是本发明中金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物治疗14天后荷瘤裸鼠肿瘤组织的H&E染色和免疫组化分析。
图13是本发明中金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物在MNIR激光照射前后与MC3T3-E1细胞孵育3d后的碱性磷酸酶染色。
图14是本发明中金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物在MNIR激光照射前后与MC3T3-E1细胞孵育7d后的茜素红染色。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例一:
一种金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物的制备方法,包括以下步骤:首先,通过种子生长法制得AuNR@CTAB金纳米棒;然后,精密称取0.05g绿原酸(CA)粉末溶解于5mL浓度为50%无水乙醇溶液中,制成浓度为10 mg·mL-1的CA溶液,加入1 mL浓度为10 mg·mL-1的AuNR@CTAB金纳米棒溶液,再加入4 mL水,得到10 mL混合液;混合液放在摇床上孵育18 h,孵育后获得的混合液进行离心分离,转速为9000 rpm,离心分离时间为20 min,超纯水洗涤两次,沉淀物重新分散在超纯水中,制得金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物(AuNR@CA)。
对本实施例一制得的AuNR@CA材料进行下述几方面的检测:
(1)使用透射电子显微镜(TEM)和动态光散射粒度仪测定形貌和大小,结果显示AuNR@CA杂化纳米药物呈棒状结构(图2),平均直径为64 nm(图3);
(2)通过FTIR光谱仪表征AuNR和CA之间的超分子相互作用(图4),CA表面功能化AuNR后,CTAB在2920 cm-1和2849 cm-1处的甲基特征峰明显减弱,而出现了CA在3354 cm-1(羟基的伸缩振动)、1685 cm-1(羰基的伸缩振动)和1605 cm-1(芳环的伸缩振动)处的特征峰,表明CA分子成功地取代了AuNR表面的CTAB;
(3)分别在装有一定体积的去离子水中逐步加入冷冻干燥后的AuNR@CA材料样品,直至刚刚饱和。通过冷冻干燥求出样品的质量,计算水溶性。如图5所示,CA通过Au-邻苯二酚键有效地改善了AuNR@CA杂化纳米药物的水溶性。
对本实施例一制得的AuNR@CA杂化纳米药物进行光热效应研究:
(1)紫外吸收光谱图(图6)显示,AuNR@CA材料同时具有CA和AuNR的典型吸收峰,提示AuNR@CA杂化纳米药物是一种潜在的光热剂,为光热性能奠定了良好基础。
(2)取1 mL浓度为200 μg·mL-1的AuNR@CA杂化纳米药物溶液,使用2.0 W·cm-2的808 nm NIR激光照射溶液10 min,用红外热像仪以每30 s的时间间隔记录溶液的实时温度并拍照。近红外热像仪图片显示(图7),在10 min的辐照时间内,AuNR@CA杂化纳米药物升温速度快。同时,如图8所示,在2.0 W·cm-2的激光照射下,而AuNR@CA杂化纳米药物的温度在10 min内可达到68.3℃,说明AuNR@CA杂化纳米药物具有优异的光热性能。
(3)通过开/关激光循环照射实验来评价纳米粒子的的光热稳定性。分别取1mL浓度为200 μg·mL-1的AuNR@CA杂化纳米药物溶液,使用2.0 W·cm-2的808nm激光照射溶液10min,然后立即关闭激光10 min,循环四次,用红外热像仪以每30 s的时间间隔记录溶液的实时温度。从图9可以看出,AuNR@CA杂化纳米药物的四个温度峰值没有明显变化,表明AuNR@CA杂化纳米药物具有良好的光热稳定性。
实施例二:
将金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物应用在协同治疗骨肉瘤并诱导骨组织再生的药物中,以人成骨肉瘤Saos-2细胞为例,研究金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物的体外抗肿瘤效果。
(1)使用CCK-8法检测Saos-2细胞存活率。将处于对数生长期的Saos-2细胞用胰蛋白酶-EDTA消化液成细胞悬液,按5000个/孔的细胞密度接种于96孔板中,孔板边缘用无菌PBS填充以防挥发。细胞培养24 h后,吸出旧培养基,加入100 μL经新鲜完全培养基稀释的不同浓度的AuNR@CA杂化纳米药物溶液,孵育12 h后,AuNR@CA杂化纳米药物中的激光治疗组以2.0 W·cm-2的激光功率照射10 min,继续培养12 h后,吸出旧培养基,无菌PBS洗涤2次,加入含10%CCK-8的无血清培养基,放入CO2培养箱中孵育2 h。使用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值,计算细胞存活率。实验结果如图10所示,AuNR@CA杂化纳米药物在24 h内对Saos-2细胞表现出剂量依赖性细胞毒性。在无SNIR激光照射的情况下,AuNR@CA杂化纳米药物对Saos-2细胞表现出较高的细胞毒性,SNIR激光(808 nm,2.0 W·cm-2,10 min)照射后能显著提高AuNR@CA的抗肿瘤活性,如AuNR@CA(14.4 μg·mL-1 CA,3.2 μg·mL-1 AuNR)经SNIR激光照射后,细胞存活率降至0.8%,明显低于AuNR@CA杂化纳米药物组(26.1%)。
(2)使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。将处于对数生长期的Saos-2细胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化成细胞悬液,按5×105个/孔的细胞密度接种于6孔板中,培养24 h后,吸出旧培养基,加入2 mL经新鲜完全培养基稀释的AuNR@CA杂化纳米药物溶液(1.8 μg·mL-1 CA,0.4 μg·mL-1 AuNR),孵育12 h后,AuNR@CA杂化纳米药物中的激光治疗组以2.0 W·cm-2的激光功率照射10 min,继续培养12 h后,吸出旧培养基,无菌PBS洗涤2次,用胰蛋白酶-EDTA消化液消化收集细胞,1000 rpm离心3 min,弃掉上清液,无菌PBS洗涤2次,加入预先配好的1×AnnexinV Binding Solution,制成终浓度为1×106个/mL的细胞悬液。取100 μL细胞悬液加入5 μL AnnexinV-FITC染色液和5 μLPI染色液,室温避光孵育15 min,再加入400 μL1×AnnexinVBindingSolution,使用流式细胞仪在激发波长Ex=488nm,发射波长Em=530nm条件下检测。结果显示(图11)AuNR@CA(+SNIR)组诱导Saos-2细胞晚期凋亡率最高(12.9%),表明AuNR@CA杂化纳米药物在光热效应的协同作用下,可诱导骨肉瘤细胞凋亡,实现高效的抗肿瘤效果。
通过将人成骨肉瘤Saos-2细胞注入BALB/c裸鼠皮下建立异种移植肿瘤模型,评估金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物的体内抗肿瘤疗效。当肿瘤体积达到100 mm3左右时,每2d注射生理盐水和AuNR@CA(4 mg AuNR·kg-1, 18 mg CA·kg-1),共4次,其中AuNR@CA(+SNIR)组小鼠接受808 nm激光(2.0 W·cm-2)照射10 min。14天后处死小鼠,切除肿瘤组织进行H&E染色和免疫组化分析。如图12所示,H&E染色显示,与生理盐水处理组相比,AuNR@CA杂化纳米药物对肿瘤组织造成明显损伤,有许多松散区域,经SNIR激光照射后的AuNR@CA几乎破坏了整个肿瘤组织。AuNR@CA在SNIR激光照射后减少了CD31阳性血管形成并且抑制了Ki-67阳性肿瘤细胞增殖。同时,TUNEL染色结果显示,AuNR@CA引起肿瘤组织显著凋亡,并且在光热疗法的辅助下观察到更多的凋亡细胞,表明了金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物具有良好的抗骨肉瘤作用。
以小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1细胞为例,研究金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物体外诱导骨再生效果:分别使用碱性磷酸酸梅(ALP)染色和茜素红染色评估AuNR@CA杂化纳米药物的早期和晚期成骨分化能力。将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化成细胞悬液,按5×104个/孔的细胞密度接种于12孔板中,培养24h后,吸出旧培养基,加入1mL经新鲜完全培养基稀释的AuNR@CA溶液(28.13 μg·mL-1 CA,6.25 μg·mL-1 AuNR),分别孵育3天和7天,期间每2天更换一次新鲜培养基,AuNR@CA中的激光治疗组每隔12h以1.0 W·cm-2的激光功率照射1min。分别在3天和7天后,吸出旧培养基,无菌PBS洗涤2次,加入4%多聚甲醛固定液在4℃条件下固定20 min,无菌PBS洗涤2次并吸弃,每孔加入500 μL稀释好的1×NBT/BCIP染色液或配制好的2%茜素红染色液,室温避光孵育30 min,吸去染色液并用无菌PBS洗涤2次,终止显色反应。使用显微镜观察染色情况并拍照。结果如图13和14所示,AuNR@CA处理的MC3T3-E1细胞在MNIR激光辐射诱导轻度高温后ALP表达水平高、钙结节数量多,说明经温和光热效应诱导的AuNR@CA杂化纳米药物促进了MC3T3-E1细胞的成骨分化。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (4)
1.一种金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物,其特征在于:所述金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物的组成及浓度比为:光热剂:邻苯二酚锚定剂=1:(1~4.5);其中,光热剂为AuNR@CTAB金纳米棒,邻苯二酚锚定剂为绿原酸。
2.根据权利要求1所述的一种金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物,其特征在于:所述金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物呈棒状结构,金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物的直径为64~70 nm,长径比为3.4~3.8,纵向等离子共振吸收峰为800±10 nm。
3.一种如权利要求1所述的金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物的制备方法,其特征在于包括以下步骤:首先,通过种子生长法制得AuNR@CTAB金纳米棒;然后,将AuNR@CTAB金纳米棒与绿原酸溶液以浓度比1:(1~4.5)混合后放在摇床上孵育18~24 h,孵育后获得的混合液进行离心分离,转速为9000~10000 rpm,离心分离时间为20~30 min,采用超纯水洗涤离心液至少两次,沉淀物重新分散在超纯水中,制得金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物。
4.一种如权利要求1所述金纳米棒@邻苯二酚杂化纳米药物在协同治疗骨肉瘤并诱导骨组织再生药物中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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