CN115137746A - 香菇多糖用于制备预防或治疗神经退行性疾病的药物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学药物领域，涉及香菇多糖(Lentinan)的新用途，具体涉及香菇多糖在制备用于预防或治疗神经退行性疾病的药物的用途。本发明首次提出了利用香菇多糖制备预防或治疗神经退行性疾病的药物，尤其是预防或治疗神经炎症诱发的神经退行性疾病的药物，对于神经退行性疾病的药物开发及应用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及医学药物领域，涉及香菇多糖(Lentinan)的新用途，具体涉及香菇多糖在制备用于预防或治疗神经退行性疾病的药物的用途。
背景技术
香菇多糖(Lentinan)是一种从香菇(L.edodes)中分离得到的具有β-(1,6)支链的β-(1,3)-葡聚糖，最早由日本学者在1969年成功提取出来，并且在日本及中国作为临床癌症治疗药物被批准上市。香菇多糖的抗癌活性是其最受关注的生物活性之一。香菇多糖主要通过调节免疫在机体内发挥其抗癌活性，研究证明其在食道癌、胃癌、肺癌等癌症临床治疗过程中，作为辅助治疗药物，有利于提高患者生存率、生活质量及减轻放/化疗毒性。但对于香菇多糖抗癌活性的具体机制尚未完全清晰，现有文献及体外实验研究结果表明，香菇多糖作为T 细胞特异性免疫佐剂可增强T细胞群的效应及T细胞功能，同时，香菇多糖可以增加体内白细胞介素及肿瘤坏死因子的产生、调节Th2细胞的活化状态来调控Th1-Th2淋巴细胞的平衡。另一方面，香菇多糖同时还具有抗细胞氧化损伤及抗炎活性，研究表明，香菇多糖能通过降低AGE诱导的软骨细胞中环氧合酶 2(COX-2)及一氧化氮合酶(iNOS)的表达来抑制促炎细胞因子的产生，同时减少NF-κB信号通路的活化。香菇多糖还能减少由李斯特菌介导的骨髓细胞 AIM2炎性体激活而引起的IL-1β的分泌。这些证据表明香菇多糖在体外能有效减轻细胞的氧化应激损伤并抑制炎症反应。
神经炎症反应在几种急性与慢性脑部疾病的病理发展过程中起着核心作用，尽管瞬时、低强度的神经炎症是有益的，但不受控制的神经炎症则会刺激神经胶质细胞的活化、增加BBB的通透性、引起外周免疫细胞的浸润综合导致 CNS内组织损伤。不受控的神经炎症会导致并加速神经退行性疾病的发生发展，神经炎症在多种神经退行性疾病中起着关键的致病作用，包括阿尔茨海默病 (AD)、帕金森病(PD)、多发性硬化症(MS)与术后认知功能障碍(POCD)等。此前已有研究表明POCD、PD、MS与AD中均检测到小胶质细胞激活、CNS中炎症介质产生以及外周免疫细胞的浸润。AD的病理发生与突触损伤、神经元缠结、β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)沉积密切相关。神经炎症发展的中期中会诱导大量促炎细胞因子表达进而导致APP的合成与tau的磷酸化。同时肿瘤坏死因子(TNF-α)等促炎细胞因子会通过MAPK通路与NF-κB通路促进 APP修饰加工与Aβ合成进一步加快阿尔兹海默症的病理进程。MS是一种免疫介导的炎性疾病，其病理特征为CNS的脱髓鞘和炎症，CNS的适应性免疫会引起并加剧MS病理进程。免疫系统中淋巴细胞和神经胶质细胞产生的促炎细胞因子都会推进MS的发展。以上神经退行性疾病的病理发生与发展都表明了神经炎症在许多慢性神经疾病中都发挥着重要的作用。因此，寻找通过抑制神经炎症来治疗神经退行性疾病的药物备受广大科研人员的关注，尽管临床上有使用非甾体抗炎药，例如萘普生、塞莱昔布等对神经退行性疾病进行治疗，但疗效甚微，且存在副作用严重的问题。而香菇多糖作为一类食物来源的天然药物，具有良好的抗炎抗氧化活性，来源广泛且对包括癌症在内的多种疾病具有保护性。但是香菇多糖否能通过抗炎抗氧化途径治疗神经退行性疾病尚未有研究报道，因此探究香菇多糖是否能缓解神经炎症、改善神经退行性疾病，对开发其作为神经退行性疾病的辅助用药具有巨大的潜在价值。
发明内容
本发明提供香菇多糖的一种新应用，
本发明提供了香菇多糖用于制备用于预防或治疗神经退行性疾病的药物的用途。
优选地，本发明提供了香菇多糖用于制备用于预防或治疗神经炎症诱发的神经退行性疾病的药物的用途。
发明人在体外通过LPS刺激小胶质细胞，构建了体外神经炎症模型。香菇多糖的处理在体外显著减轻了小胶质细胞的氧化应激反应及炎症因子的表达。发明人还通过脑立体定位注射在动物体内构建了神经炎症模型，实验结果显示，对小鼠进行香菇多糖的补充，可显著改善LPS刺激下导致的小鼠中枢神经系统的氧化损伤，同时在转录及蛋白表达水平均减少了炎症因子的表达，香菇多糖减轻LPS诱导的氧化损伤及神经炎症反应在体内外均得到了验证。
发明人通过对LPS诱导的脑炎模型小鼠在造模前长期(30天)补充香菇多糖，显著改善了LPS导致的小鼠认知功能障碍及焦虑情绪，表明香菇多糖可以缓解炎症造成的认知功能障碍。
本发明首次提出了利用香菇多糖制备预防或治疗神经退行性疾病的药物，尤其是预防或智利神经炎症诱发的神经退行性疾病的药物，对于神经退行性疾病的药物开发及应用具有重要意义。
香菇多糖作为一种经过审批上市多年的癌症治疗药物，具有良好的抗氧化、调节免疫活性的能力，并且来源广泛、副作用少等优势，本发明发现香菇多糖对于小胶质细胞激活所致的神经炎症、氧化损伤具有有效的防治作用，进而对小胶质细胞激活所致的神经炎症及氧化损伤导致的神经系统疾病包括阿尔兹海默症、帕金森症、多发性硬化症、术后认知功能障碍、脑卒中等具有防治作用。利用LPS诱导的神经炎症模型小鼠进行实验可以发现，香菇多糖可以有效抑制模型小鼠的神经炎症反应、减轻氧化损伤，进一步行为学检测小鼠的认知功能可以发现，香菇多糖能有效的改善炎症导致的小鼠认知功能障碍，对神经炎症引起的神经退行性疾病具有确切的防止作用。
本发明提供了一种香菇多糖老药新用途径，为开发有效的神经退行性疾病药物减少了研究成本，也大大缩短了药物研发到临床治疗的时间及经济成本。
附图说明
图1为香菇多糖结构式。
图2为香菇多糖预处理抑制BV2细胞中的氧化应激及炎症反应结果图。其中， A图为LNT预处理对LPS诱导的BV2细胞ROS生成的影响(n＝3)，B图为蛋白免疫印迹检测四组细胞中炎症因子IL-1β、TNFα的蛋白表达水平，C图为对蛋白免疫印迹的IL-1β条带进行相对定量分析结果(n＝3)，D图为对蛋白免疫印迹的TNFα条带进行相对定量分析结果(n＝3)。
图3为香菇多糖减轻LPS诱导的小鼠氧化应激及神经炎症反应的结果图。其中， A图为补充LNT对LPS诱导的小鼠脑组织ROS生成的影响(n＝3)，B图为补充LNT增强了LPS刺激后的小鼠脑的总抗氧化能力(n＝3)，C图为蛋白免疫印迹检测三组小鼠海马中炎症因子IL-1β、TNFα的蛋白表达水平，D图为对蛋白免疫印迹的IL-1β条带进行相对定量分析结果(n＝3)，E图为对蛋白免疫印迹的TNFα条带进行相对定量分析结果(n＝3)，F图为实时荧光定量PCR检测三组小鼠海马中IL-1β的mRNA相对表达量(n＝3)，G图为实时荧光定量PCR检测三组小鼠海马中TNFα的mRNA相对表达量(n＝3)。
图4为香菇多糖改善LPS诱导的小鼠认知功能障碍的结果图。其中，A图为旷场实验中，三组小鼠的总行走距离，B图为三组小鼠在旷场中心区域时间占总时间比例，C图为Y迷宫交替正确率(n＝10)。
具体实施方案
香菇多糖的结构式如图1所示，
实验材料：采用香菇多糖口服液进行以下实验，购买于日本味之素公司，每 100g中含有香菇多糖有效成分β-葡聚糖为15mg。
以下实验中，香菇多糖用LNT表示。
实施例一：香菇多糖在小胶质细胞BV2细胞中的抗炎抗氧化作用
小胶质细胞是CNS固有的免疫细胞，在CNS中发挥外周巨噬细胞的作用。小胶质细胞作为CNS的第一条免疫防线，在发育、稳态、生理免疫监测和神经炎症的病理进展中起着关键的作用。香菇多糖被认为在免疫细胞中可发挥抗炎抗氧化作用，为了探究香菇多糖是否能调节小胶质细胞的炎症及氧化应激反应，设计了如下实验。
1.BV2细胞培养及药物处理
将BV2细胞以2x106个/孔的密度接种于六孔板中，在37℃，5％CO2培养箱过夜培养。LNT组及LNT+LPS组每孔细胞加入200μg/mL的LNT预处理1 小时，随后LPS组及LNT+LPS组加入1μg/mL LPS诱导细胞炎症反应，空白组不做处理，12小时后收集细胞检测炎症因子蛋白表达水平及活性氧(ROS) 的水平。
2.细胞ROS测定
将六孔板中的细胞消化并收集，使用无血清培养基清洗细胞后加入10μM 浓度的DCFH-DA探针，37℃下孵育20min，每隔5min混匀一次；孵育结束后在室温下用PBS洗涤两次，随后将100μL样品加入酶标板中，每个样品三个复孔，使用荧光酶标仪设置激发波长为488nm，发射波长为535nm进行荧光检测，得到的样品吸光度值用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。
3.蛋白免疫印迹检测细胞炎症因子的蛋白表达水平
(1)细胞蛋白的提取：将细胞消化收集起来，每孔细胞中加入1mL含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解30min，随后4℃下12000×g离心30min，收集上清，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀，于99℃加热15min变性蛋白，冷却至室温后-80℃保存；
(2)蛋白免疫印迹检测IL-1β、TNFα的蛋白表达水平：将蛋白样品置于10％ SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离，随后将蛋白转移至PVDF膜上；室温下使用 5％脱脂奶粉对PVDF膜封闭2小时，随后按照1：1000稀释抗体，并让PVDF 膜在4℃下孵育过夜；使用TBST洗膜3次，每次15min，随后在室温下进行二抗孵育2h，洗膜三次后在超灵敏多功能成像仪中进行曝光及图像记录；蛋白免疫印迹图像使用ImageJ进行灰度分析，β-actin作为内参，使用GraphPad Prism 6.0软件及单因素方差分析进行统计分析，p<0.05认为具有显著性差异。
4.香菇多糖预处理抑制LPS诱导的细胞炎症反应及氧化应激水平
ROS是指在生理和病理条件下产生的活性氧的总称，研究证明，在中枢神经系统中，过量ROS会造成蛋白质氧化与脂质过氧化，进而导致氧化损伤、神经元细胞变性与功能损伤，同时还诱导炎症基因的表达，图2的A图中可以看出LPS可以诱导细胞中的活性氧的增加，而在LNT预处理的细胞中，ROS的含量较空白组没有差异，同时LNT预处理降低了LPS诱导的活性氧的生成，表明LNT在对LPS诱导的细胞氧化应激反应中能发挥抗氧化的功能。同时检测了细胞中炎症因子的蛋白表达情况，图2的B图表示蛋白免疫印迹检测的空白组、LPS组、LNT组、LNT+LPS组细胞的IL-1β、TNFα、β-actin的蛋白表达情况。图1的C图和D图分别表示蛋白条带的灰度值经过内参矫正后，各组的 IL-1β、TNFα的蛋白相对表达量，实验结果显示，LPS诱导BV2细胞中IL-1β、 TNFα的表达较空白组显著上调，而LNT对细胞进行预处理不会导致炎症因子的表达上调，同时LNT的预处理显著降低了LPS诱导的BV2细胞中炎症因子的表达(***p<0.001；****p<0.0001)。
实施例二：香菇多糖在LPS诱导的脑炎小鼠中的抗炎抗氧化作用
为了进一步验证香菇多糖在体内对LPS诱导的神经炎症的作用机制，本申请使用C57BL/6J小鼠进行体内实验，通过脑立体定位注射构建脑炎模型小鼠，并在定位注射前30天对小鼠进行持续灌胃香菇多糖，随后检测小鼠脑组织中的氧化应激水平及炎症因子的表达水平，以此来探究香菇多糖膳食补充对神经炎症的作用及影响。
1.脑立体定位注射LPS构建脑炎模型小鼠
(1)随机分组及给药：将30只2月龄的雄性C57BL/6J小鼠随机分为三组，即生理盐水组、LPS组、LNT+LPS组，每组小鼠10只；在注射LPS前30天，对 LNT+LPS组小鼠按照体重每kg1.67g香菇多糖剂量进行灌胃，LPS组小鼠以相同体积的生理盐水进行灌胃，生理盐水组小鼠不进行处理；
(2)双侧脑室定位注射LPS：使用1％戊巴比妥钠溶液按照80mg/kg剂量对小鼠进行腹腔注射麻醉，随后将小鼠头部进行备皮、消毒，并将小鼠固定于脑立体仪中；剪开小鼠头皮，根据Paxinos等著的小鼠脑立体定位图谱，在前囟后- 0.3mm，矢状缝左右各1.0mm处使用颅骨钻进行钻孔，将装载有1μg/mL LPS 的微量进样器缓慢插入孔中，深度为颅骨表面下2.0mm，滞留2min后，以0.5 μL/min的速度每孔注射2μL，留针5min后缓慢拔出注射器，使用骨蜡将注射孔填补，缝合头皮并给予镇痛药物，将小鼠置于温暖环境中直至苏醒；
2.检测小鼠脑组织氧化应激水平
(1)行为学实验结束后，使用1％戊巴比妥钠溶液按照80mg/kg剂量对小鼠进行腹腔注射麻醉，并使用生理盐水对小鼠进行心脏灌流，随后在冰上立即分离小鼠脑组织及海马组织，海马组织液氮速冻后置于-80℃保存；
(2)脑组织ROS的测定：将取出的脑组织中加入9倍体积的生理盐水并使用美天旎组织处理器进行研磨，随后4℃下12000rpm离心10min，取200μL上清加入10μMDCFH-DA探针置于酶标板中，每个样本3个复孔，37℃下孵育 30min，使用荧光酶标仪设置激发波长为488nm，发射波长为535nm进行荧光检测，得到的样品吸光度值用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析；
(3)脑组织总抗氧化能力的检测：使用采用总抗氧化能力检测试剂盒#S0119 对脑组织中的自由基阳离子3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)进行检测，首先取10μL脑组织匀浆上清与200μLABTS工作液混合，室温静置5min，随后使用荧光酶标仪在734nm处检测样品吸光值，并根据标准曲线计算每个样品的抗氧化能力；
3.小鼠海马组织总RNA的提取及实时荧光定量PCR反应检测炎症因子表达水平
(1)每个海马组织样本中加入1mL trizol裂解液并使用美天旎组织处理器进行研磨，随后加入氯仿200μL，混匀室温静置2-3min后4℃下12000×g离心15 min；离心后取上层水相至新的EP管中；加入异丙醇500μL混匀室温静置10 min后4℃下12000×g离心10min，下层沉淀为RNA，小心吸除上清后加入1 mL预冷的75％乙醇轻轻混匀，短时间漩涡震荡后置于离心机7500×rpm/min离心5min，弃上清；室温晾干10min加入20-30μL的DEPC水58℃下孵育15 min；最后使用分光光度计测RNA溶液浓度；
(2)RNA逆转录及实时荧光定量PCR反应
使用Evo M-MLV反转录试剂盒#AG11711两步法对脑组织总RNA进行逆转录反应，反应体系及反应条件如表1所示。
表1：逆转录反应体系及反应条件
| 试剂 | 用量 |
| 5×gDNA Eraser Buffer | 2.0μL |
| gDNA Eraser | 1.0μL |
| Total RNA | 1μg |
| RNase Free ddH<sub>2</sub>O | Up to 10μL |
| 反应条件：42℃2min | |
| PrimeScript RT Enzyme Mix I | 1.0μL |
| RT Primer Mix | 1.0μL |
| 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time) | 4.0μL |
| RNase Free ddH<sub>2</sub>O | 4.0μL |
| Total | 10μL |
| 反应条件：37℃15min，85℃5s |
将逆转录得到的cDNA稀释10倍后使用
Green Premix Pro Taq HS qPCRKit Ⅱ#AG11702试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，实时荧光定量PCR 反应引物序列如表2所示，实时荧光定量PCR反应体系、反应条件如表3、表 4所示，GAPDH为内参基因，通过2-△△CT法计算基因的相对表达量，并使用 GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。
表2：mRNA实时荧光定量PCR引物序列
表3：实时荧光定量PCR反应体系
表4：实时荧光定量PCR反应条件
4.蛋白免疫印迹检测小鼠海马中炎症因子的蛋白表达
(1)在小鼠海马组织中加入4倍体积的含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解30min，随后4℃下12000×g离心30min，收集上清，取4μL上清使用BCA法蛋白浓度测定试剂盒对样品蛋白浓度进行测定，其余上清加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀，于99℃加热15min变性蛋白，冷却至室温后-80℃保存；
(2)根据测得的蛋白浓度取一定量的样品进行蛋白免疫印迹，具体步骤同实施例1中描述的免疫蛋白印迹方法。
5.膳食补充香菇多糖抑制LPS诱导的小鼠中枢神经系统炎症反应及氧化应激水平
为了探究香菇多糖在体内是否能改善氧化应激水平及神经炎症反应，本申请采用侧脑室注射LPS诱发小鼠中枢神经炎症反应，并在注射前对小鼠进行为期一个月的香菇多糖给药。实验结果如图3的A图所示，侧脑室注射LPS显著增加了小鼠脑组织中的氧化应激水平，而在补充香菇多糖小鼠中，ROS的含量较LPS组显著降低，同样在三组小鼠的总抗氧化能力测试中也能发现，LPS刺激严重破坏了小鼠脑组织中的抗氧化能力，且香菇多糖的补充显著恢复了LPS 诱导损伤的中枢神经系统的抗氧化能力(图3的B图，****p<0.0001)。
海马是中枢神经系统中发挥学习记忆功能的重要脑区，研究表明，海马中产生过度炎症往往会导致记忆功能的紊乱，可能是导致AD发生的病理之一。通过实时荧光定量PCR实验及蛋白免疫印迹检测三组小鼠海马组织中炎症因子的mRNA及蛋白表达情况，可以看出，LPS显著诱导了小鼠海马组织中炎症因子IL-1β、TNF-α的转录及蛋白水平表达的上调(图3的C图至G图，*p<0.05， **p<0.01，***p<0.001)，而在香菇多糖补充后的小鼠海马中，LPS诱导的炎症因子的转录及蛋白表达水平显著降低，因此可以认为香菇多糖的补充显著改善了LPS诱导的小鼠神经炎症反应。
实施例三：膳食补充香菇多糖显著改善LPS诱导的认知功能障碍
过度的神经炎症最终会导致中枢神经系统的功能损伤，认知功能是中枢神经系统的主要功能之一，当神经炎症过度反应时，会导致认知功能关键脑区——海马的神经元损伤，并进一步影响其功能的发挥。实施例二中已证明，香菇多糖能显著改善LPS诱导的小鼠海马中的神经炎症反应，因此本实施例将通过行为学实验进一步探究香菇多糖是否能改善LPS导致的认知功能障碍。
1.旷场实验：在对小鼠进行了脑立体定位注射24h后开始进行行为学实验，旷场实验主要用以检测小鼠的自主活动能力、焦虑及探索行为，旷场实验所用的实验箱大小为40cm×40cm×40cm(长×宽×高)，底部为白色，四壁为黑色。实验前2h将小鼠置于实验环境中以适应。调整摄像头使其处于旷场正上方并设置好软件参数。实验开始时，将小鼠放入旷场底部中央位置，使其在旷场中自由活动10min，软件记录小鼠活动距离及各区域探索时间等参数，每只小鼠实验结束后，将小鼠从旷场移出，放入笼内，并用75％酒精擦拭实验箱以消除气味。
2.Y迷宫实验：Y迷宫主要用以测试小鼠辨别性学习、工作记忆、参考记忆的能力，Y迷宫设备主要由A、B、C三个完全相同的臂组成，每个臂的大小为30cm×8cm×15cm(长×宽×高)，互为120°，实验前2h将小鼠置于实验环境中以适应，实验开始时，将小鼠放入随机的一个臂的末端，记录8min内小鼠进入各个臂的次数与顺序，小鼠连续进入Y迷宫全部三个臂一次认为是交替 (alternation)一次(如按照A,B,C或A,C,B的顺序)，实验评价指标包含总进臂次数、交替次数，以及自发交替行为百分比(实际交替数/总进臂次数- 2*100％)，实验过程由摄像头记录并通过软件进行分析，每只小鼠实验结束后，用75％酒精擦拭迷宫臂内，以消除气味。
3.实验数据由ANYMAZE软件进行记录，并使用GraphPad Prism 6软件进行数据统计分析。
4.实验结果
旷场实验主要测试小鼠的行动能力以及焦虑程度，实验结果如图4的A图所示，三组小鼠在旷场中的总行走距离具有明显差异，其中，LPS组小鼠总行走距离最低，这是由于LPS刺激对小鼠造成的活动能力的下降，而香菇多糖的补充则显著的改善了这种活动能力的减弱，另一方面，LNT+LPS组小鼠在旷场中央的探索时间占比明显高于LPS组，这说明香菇多糖同时也改善了LPS对小鼠造成的焦虑情绪(图4的B图，*p<0.05)；为了探究三组小鼠的短期记忆能力，本申请计算了小鼠在Y迷宫测试中的正确交替率，实验结果如图4的C图所示，LPS组小鼠的交替正确率显著低于生理盐水组小鼠，说明在LPS的急性刺激下，小鼠的短期认知功能受到了损伤，但在香菇多糖的作用下，小鼠的自发交替率显著增加(*p<0.05)，说明香菇多糖的补充能显著改善LPS导致的小鼠认知功能障碍。
Claims (2)
1.香菇多糖用于制备用于预防或治疗神经退行性疾病的药物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述神经退行性疾病是神经炎症诱发的神经退行性疾病。
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