CN115136847A - 一种具有菌幕的食用菌孢子制种技术 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有菌幕的食用菌孢子制种技术。将具有内菌幕（蜜环菌、香菇、大球盖菇、双胞磨菇等）、外菌幕（草菇、竹荪、冬荪等）的子实体在即将开裂之时，采摘消毒放入无菌箱中，待菌幕破裂并让孢子弹射到有粘性的无菌水中、液体培养基中，或无菌滤纸上，形成孢子悬浮液，吸取（或挑取）适量的孢子接入液体三角瓶中，培养5‑6天后，接入液体发酵罐培养5‑6天后，再接入栽培种培养基培养成栽培种。本发明利用有性繁殖的孢子分离菌种，优良性状比无性繁殖明显，且极大缩短了制种周期，把食用菌菌种的育种和生产，推向良种化、精准化、独特化、工厂化。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有内、外菌幕的食用菌孢子制种技术，属于食用菌(包括药用菌)制种及种植领域。
背景技术
在食用菌菌种的育种、制种和栽培中，通常采用两种方法分离菌种：一是组织分离，即使用子实体的某一部分来分离菌种的方法。属无性繁殖。优点：简便，能保持原菌株的特性。所获菌种不发生遗传重组等变异，能保持原菌株的优良特性，遗传性较稳定，变异小或后代不易发生变异。因此生产上常采用此法。缺点：无性繁殖几代或多代后，菌种活力易退化，抗性下降，产量降低。二是孢子分离，即是采取子实体上成熟的有性孢子萌发培养成纯菌丝，再进一步培养成菌种的方法。属于有性繁殖。优点：可获得生命力强、菌龄短的菌丝体，所得菌种生活力旺盛。该方法的另一个优点是分离得到的有性孢子兼有双亲的遗传特性，可用于杂交育种和选育新品种。缺点：变异率高，产量不稳定。孢子间不仅存在个体差异，还存在较普遍的自然分化现象，出现的变异较大，必须经过出菇试验后才能用于生产中。
用无性时期的料材获得的菌种在生产上易退化，用有性时期的材料获得的菌种能恢复和提高物种的活力和抗性，但后代变异率高，在产量和质量上表现出不同程度的不稳定性。怎样才能保持有性繁殖的活力和优势，在农作物育种中的一个主要的方法就是纯化培育自交系，再进行杂交育种。
我国食用菌制种工艺流程、配方和技术可分两个历程或阶段：
一是传统的固体培养基配方及阶段。即三级菌种制种均是使用固体培养基。母种(一级种，常用试管)—原种(二级种，常用菌种瓶)—栽培种(三级种，常用菌种瓶或菌种袋)。其中母种的常用培养基或配方是PDA，即马铃署200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。原种、栽培种常用的培养基或配方是，锯木屑78％，麸皮18％，糖1％，石膏1％。含水量60％。目前我国绝大部分的菌种厂家仍是采用这种传统的制种模式和配方。
二是液体培养基配方及阶段。此阶段是在生产母种(一级种，用三角瓶)—原种(二级种，用发酵罐)—栽培种(三级种，用菌种瓶或菌种袋)。栽培种配方同上。三角瓶、发酵罐液体培养基配方之一：玉米粉5份，黄豆粉3份，麸皮1份，)酵母膏2份，葡萄糖或蔗糖20份，水1000ml。在二十世纪末期，食用菌制种业参照发酵工业的工艺成熟技术，工厂化生产厂家逐渐使用液体菌种制作栽培种。自2010年以来，已能用液体菌种直接、大规模、工厂化方式栽培金针菇、杏鲍菇、蟹味菇、黑木耳等。近三、四年，国内已有四、五个厂家用液体菌种每年生产蜜环菌种达600万袋左右。
两个阶段的效果对比。用固体培养基生产栽培种(三级种)，要用时间140天左右，用液体培养基生产栽培种，所用时间65天左右。从有性繁育的角度算起，生产工艺流程和时间是，用子实体—孢子(组织)分离试管母种15天—试管母扩繁一次15天—原种50天—栽培种30-60天。此种方法仍是我国食用菌培育和制种的主要方法。本文称常规方法，即固体基质培养法。本发明的制种方法，用液体基质培养法，生产工艺流程和时间是，用子实体—孢子分离三角瓶液体菌种培养7天—发酵罐培养7天—栽培种30-50天。用液体基质生产菌种，正品率高，生长快，能较大幅度的节省时间和有效利用人、财、物。液体菌种的培养纯度，生长速度，生产活力要高于固体菌种。但液体菌种的生产和操作的精细度、精确度和难度要多于和高于固体菌种。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有内、外菌幕的食用菌制种和育种的工艺，所述工艺包括以下步骤：
一种具有内、外菌幕的食用菌制种的工艺，所述工艺包括以下步骤：
1)选取在生产中大面积推广应用的菌株作种源培养出子实体；
2)采取子实体：有内菌幕种类的食用菌，在内菌幕即将开裂的3-5小时之前，采摘完整的子实体剪柄并消毒，放入无菌箱中；有外菌幕的食用菌的子实体，在外菌幕有开裂之痕迹时即采摘去掉根部泥土或培养基并消毒，放入无菌箱中；
3)孢子分离：在无菌箱里把菌盖放在装有粘性的无菌水或液体培养基的瓶口上，或放在无菌滤纸上，菌褶向下，弹射、收集孢子；
4)孢子稀释或三角瓶液体菌种培养：将收集到含有孢子的无菌水进行摇晃，使其形成孢子液，用吸管吸取孢子液接入三角瓶培养得到孢子悬浮液；在滤纸上的孢子用接种针挑取接入无菌水中，摇晃培养得到孢子悬浮液；如果是步骤3)将孢子弹射到液体菌种培养基上，可将三角瓶在振荡下培养，直接培养成一代母种(一级种)，备用；
5)发酵罐或原种培养：将上述步骤3)经过三角瓶培养获得的孢子悬浮液接入发酵罐中，培养，并得到液体菌种(母种，一级种)；如步骤4)中采用的是液体菌种培养基已获得一代母种(一级种)，本步骤可转扩到固体培养基制作成原种(二级种)；
6)栽培种培养：将步骤5)在发酵罐中培养好的液体菌种，接入固体培养基制作成栽培种；或步骤5)得到的原种，置于通风、避光、适温下培养；待菌丝体长满袋/瓶后，用于栽培；
完成具有内、外菌幕食用菌菌种制种。
优选地，所述步骤1)优良菌株为自交2-3代的菌株(如M1)。
优选地，所述步骤2)采取子实体过程中，采取有内菌幕的子实体时，菌盖、菌柄表面用酒精擦试消毒，孢子被内菌膜包裹呈无菌状态；采取有外菌幕的子实体时，整个外菌幕表面用酒精擦试消毒，孢子被外菌膜包裹呈无菌状态。
优选地，所述步骤3)弹射时间在10-20小时，温度调控在18-32℃℃。
优选地，所述步骤3)中三角瓶液体培养基制备方法：将玉米粉5份、黄豆粉3份、麸皮1份、酵母膏2份、葡萄糖20份、水1000ml，在100℃中煮沸15min后过滤；将过滤液定量至1000ml，在120℃中灭菌40min，冷却，备用。
优选地，所述步骤4)三角瓶液体培养中培养条件为：置于22～30℃，以145-155r/min振荡培养130-150h时。
优选地，所述步骤5)液体发酵罐的培养基制备方法：将玉米粉5份、黄豆粉3份、淀粉1份、酵母膏2份、蔗糖20份、水1000ml，根据发酵罐的大小按比例扩大后，加入适量的消泡剂，在121～124℃中灭菌1.5h，待温度降至25℃备用。
优选地，所述步骤5)发酵罐培养中培养条件为：22～30℃(不同种类温度略有差异)，气压0.05mpa，培养145h。
优选地，所述步骤6)每袋接5ml即可，置于18～30℃中培养。
优选地，所述内菌幕种类的食用菌为蜜环菌、香菇、大球盖菇或双胞磨菇或其他，外菌幕的食用菌为草菇、竹荪或冬荪或其他。
本发明的制种方法，用液体基质培养法，生产工艺流程和时间是，用子实体—孢子分离—三角瓶液体菌种培养7天—发酵罐培养7天—栽培种50天。用液体基质生产菌种，正品率高，生长快，能较大幅度的节省时间和有效利用人、财、物。液体菌种的培养纯度，生长速度，生产活力要高于固体菌种。但液体菌种的生产和操作的精细度、精确度和难度要多于和高于固体菌种。这就要求和做到：制作三角瓶和发酵罐液体菌种时要绝对纯净，不能有任何的杂菌感染。一个三角瓶，或一个发酵罐如有一个杂菌感染，将毁坏和浪费成千上万袋、瓶菌种，造成较大损失。在三角瓶、发酵罐培养程中要建立严格的试管和显微镜检测方法，严密跟踪，严防感杂，确保纯净。
在采取孢子和培养的过程中，要建立严密的、精准的，精细的、精密的一系列的操作技术和方法。在食用菌的生长发育成熟过程中，凡是具有内菌幕(图1蜜环菌，图2香菇)，外菌幕(图3竹荪，图4草菇)的菌类，在子实体生长发育和即将成熟之时，内、外菌幕包裹着菌褶或菌盖。它们的内、外菌幕开裂或破裂之际，稍后1-3天，也是孢子成熟和弹射之时。我们利用这一生物学特性，在开裂或破裂前的几个小时采取子实体，放入到无菌箱里，让其弹射孢子。有内菌幕的菌褶，有外菌幕的菌盖(亦即菌褶)未暴露在空气中，这样弹射出来的孢子即是无菌的。本技术最有效的降低了杂菌污染的概率。
把菌盖直接放在装有粘性的无菌水的瓶口上，让其弹射孢子，一是进一步减少或严防菌褶暴露在空气中的时间和环节，二是把弹射的孢子制成悬浮液，方便用吸管吸取接种。三是用灭菌的滤纸片插入孢子悬浮液，立即取出放入玻璃瓶中封存，可较长时间(一年至二年)将孢子保藏，用于再接种和扩大繁育。也可让孢子弹射到无菌滤纸上，接种或保藏。
种源的培育或选取。选取已知的，生产栽培中大量应用并被证实了的，自交纯化2-3代(如蜜环菌菌株M1)优良菌株培养出子实体，获得孢子。把孢子直接接入三角瓶液体培养基培养，又接入发酵罐中培养，再接入栽培种培养基，这样培养出来的栽培种，菌龄短，纯净度高(或正品率高)，生活活力强。
此技术方法是获得某些菌类无菌孢子的最优方法。如竹荪、冬荪类。我国竹荪和冬荪菌种的分离主要是用组织分离法。极少用孢子分离法获得菌种。因为，这类菌的子实体在成熟开裂时顶破外菌幕，伸展出菌裙和菌盖时，其中菌盖一旦和空气接触，便慢慢流出墨绿色的孢子液。这类孢子液，一是不便收集，二是暴露在空气中的孢子液有粘性，易吸附空气中的微生物，三是有气味(臭味)，吸引蚊蝇采食而很易感杂。采用本技术，在无菌箱里，等它们流出孢子液时，用无菌滤纸片粘取孢子液，便可收取到竹荪、冬荪的无菌孢子，用于接种或保藏。
纯化自交系获得种源。我国目前还没有定点、定时、定向培育一个自交系而选育或杂交，审定的食用菌新品种面世。在几种大宗农作物(玉米、水稻、大豆等)的育种单位，基本上都在海南岛建立了南繁基地。华中农业大学傅庭栋院士在青海建立油菜育种基地。其目的就是定点、定时、定向，在有限的时间内，利用南北气候的差异，加代繁育自交系，即纯化优良的父、母本，用于杂交育种。与农业上的育种业相比，食用菌的育种可谓才处于起步阶段，育种的手段和方法相对有限。为此食用菌的育种完全可借鉴农作物上的育种方法和手段，如纯化培育自交系。一个优良的自交系本身就是一个好品种，可直接用于生产。更有价值和作用的是用于杂交育种。食用菌在培育和获取自交系的过程中，要比农作物容易的多。它既可以在室内加代培育，且一年之内能培育出3-4代。也可以在室外和原生态的环境中培育。完全能做到室内与室外，自交与杂交，互相穿插，互相印证。将制种和育种的成效及时调整或优化。
本技术和方法在天麻、猪苓对蜜环菌需要和利用，即蜜环菌菌种的制作和栽培中，能显示出突出的效果和优势(见表1)。因为天麻、猪苓利用的只是蜜环菌的营养体—菌丝体；同理，在发酵工业的生产上也能表现出优势，因为发酵业生产和收获的也是菌丝体。
本发明具有以下的有益效果：
1、以自交2-3代的方式获得有性孢子，一方面获得遗传性能稳定的种源用于生产菌种和栽培，另一方面培育纯化了自交系，为杂交育种提供优良的亲本，即父、母本。一旦杂交成功，获得优育菌株后，即可用组织分离的方法扩繁和保藏菌种用于生产。此种食用菌制种与育种的技术和方法，在食用菌新品种的选育中，将具有重要的借鉴和创新作用。
2、用有性孢子作为材料，培育出来的栽培种生活活力和生命力优而强。如用M1培育蜜环菌菌材，菌材上的蜜环菌菌索生长均匀、旺盛、粗壮(图5菌材、菌索)。菌种(菌索和菌丝体)以最快速度“钻入”菌材中，最大程度的分解和合成菌材上的营养物质，输送和供给天麻生长。用该菌材栽培有性种麻和商品麻，均能获得稳产高产的效果(图6蜜环菌M1菌株栽培的天麻产量)。
3、本方法尤其是在蜜环菌用于天麻栽培的菌种制种中，无需考虑蜜环菌子实体的各种性状，如子实体的大小、颜色、菇形、菌盖厚薄、菇柄长短、营养成分、口感风味等，因天麻栽培利用的是蜜环菌的菌丝体分解木棒等基质，为天麻输送营养，所以有别于其他食用菌主要获取并利用的是子实体，省去孢子直接生产菌种后需要繁杂的、且一定要培养出子实体的栽培试验过程。
4、在内菌幕、外菌幕未开裂之前，把子实体放入无菌箱中，精准的获得无菌孢子。
5、把孢子制成悬浮液，一是方便接种，二是用无菌滤纸粘取孢子液后放入瓶中，利于种源的保藏。
6、创新食用菌菌种生产新工艺。把孢子直接接入到液体培养基中，再接入栽培种培养基中，1次扩繁便培养成栽培种。大幅度的节省了时间和有效利用了人、财、物。大大革新了食用菌制种的工艺流程和技术方法。将把食用菌菌种的育种和生产，推向精准化、精细化、独特化、工厂化。
附图说明
图1：左1蜜环菌子实体的内菌幕已开裂，左2菌幕未开裂；
图2：a，香菇的内菌幕未开裂，b，内菌幕正在开裂；
图3：a，竹荪的外菌幕还未开裂，b，外菌幕正在开裂；
图4：a，草菇外菌幕及菌盖，b，外菌幕未开裂；
图5：用蜜环菌M1菌株培育的菌材；
图6：蜜环菌M1菌株栽培的种麻，一平米产12.5kg；
图7 2021年6-10月在室内栽培的蜜环菌子实体；
图8 2021年10月25至12月24日用本发明工艺培养的：a，蜜环菌栽培种，b，蜜环菌原种。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和技术点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
1、优良菌株的选取。选取已知自交2-3代的优良菌株(如蜜环菌M1))作种源培养出子实体：
2、采取子实体。有内菌幕(蜜环菌、香菇、大球盖菇、双胞磨菇)种类的食用菌，在内菌幕即将开裂的5小时之前，采摘子实体，放入无菌箱中。有外菌幕(草菇、竹荪、冬荪等)的子实体，在外菌幕即有开裂之痕迹时即采摘，放入无菌箱中；
3、采取有内菌幕的子实体时，菌盖、菌柄表面用酒精擦试，再用无菌膜包裹。采取有外菌幕的子实体时，整个外菌幕表面用酒精擦试，再用无菌膜包裹；
4、配制有粘性的无菌水。取纯净水100g，纯马铃暑粉3-4g，在35℃中将其溶化后，在121℃中灭菌50分钟，备用。同时把滤纸装入菌种瓶中，在121℃中灭菌2小时，备用；
5、孢子弹射和收集。在无菌箱里把菌盖直接放在有粘性的无菌水的瓶口上。或把菌盖放在无菌滤纸上。弹射时间在15个小时。温度调控在20℃；
6、制备三角瓶液体培养基。配方：玉米粉5份、黄豆粉3份、麸皮1份、酵母膏2份、葡萄糖20份、水1000ml，在100℃中煮沸15min后过滤。将过滤液定量至1000ml(500ml容量瓶装150ml过滤液)，在120℃中灭菌40min，冷却，备用；
7、在上述三角瓶中根据需要接入不同种的孢子。接有粘性的无菌水孢子液时，需适当摇晃，让其形成孢子悬浮液时，用吸管吸取1-2ml接入三角瓶。在滤纸上的孢子用接种针挑取接入三角瓶中。置于22℃(草菇30℃)，以150r/min振荡培养140h时，备用；
8、液体发酵罐菌种的培养。根据发酵罐的大小定容。将上述配方(葡萄糖改换为蔗糖，麸皮改换为淀粉)中的液体培养基按比例扩大后，加入适量的消泡剂，在124℃中灭菌1.5h，待温度降至25℃备用；
9、将上述培养好的三角瓶菌种接入发酵罐中，置于22℃(草菇30℃)，气压0.05mpa，培养145h左右时，备用；
10、固体栽培种培养基的制作(以蜜环菌种为例)。配方：棉籽壳63份，玉米面15份，锯木屑20份，石膏1份，白糖1份，含水量65％。装袋，在125℃中灭菌3h，冷却，备用；
11、将上述发酵好的液体菌种，每袋接入5ml即可。置于20℃(草菇30℃)，通风，避光培养。待菌丝体长满袋后，用于栽培。
采用实施例1方法进行应用：
应用实例1：蜜环菌制作工艺流程对比(表1)
表1蜜环菌制作工艺流程对比
2021年6月6日接蜜环菌栽培种，8月5日菌丝体长满瓶，10月21日子实体逐渐成熟(图7)，10月25日孢子弹射到三角瓶中，10月31日孢子液体菌种发酵成熟，即接入栽培种培养基中培养，12月24日长满瓶(图8)。
应用实例2：用自交纯化3代蜜环菌M1栽培天麻的产量，见表2：
表2蜜环菌M1孢子分离与栽培天麻产量
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有菌幕的食用菌制种的工艺，其特征在于，所述工艺包括以下步骤：
1）选取在生产中大面积推广应用的菌株作种源培养出子实体；
2）采取子实体：有内菌幕种类的食用菌，在内菌幕即将开裂的3-5小时之前，采摘完整的子实体剪柄并消毒，放入无菌箱中；有外菌幕的食用菌的子实体，在外菌幕有开裂之痕迹时即采摘去掉根部泥土或培养基并消毒，放入无菌箱中；
3）孢子分离：在无菌箱里把菌盖放在装有粘性的无菌水或液体培养基的瓶口上，或放在无菌滤纸上，菌褶向下，弹射、收集孢子；
4）孢子稀释或三角瓶液体菌种培养：将收集到含有孢子的无菌水进行摇晃，使其形成孢子液，用吸管吸取孢子液接入三角瓶培养得到孢子悬浮液；在滤纸上的孢子用接种针挑取接入无菌水中，摇晃培养得到孢子悬浮液；如果是步骤3）将孢子弹射到液体菌种培养基上，可将三角瓶在振荡下培养，直接培养成一代母种，通过试管或显微镜进行检测，合格备用；
5）发酵罐或原种培养：将上述步骤3）经过三角瓶培养获得的孢子悬浮液接入发酵罐中，培养，并得到液体菌种；如步骤4）中采用的是液体菌种培养基已获得一代母种，本步骤可转扩到固体培养基制作成原种；
6）栽培种培养：将步骤5）在发酵罐中培养好的液体菌种，接入固体培养基制作成栽培种；或步骤5）得到的原种，置于通风、避光、适温下培养；待菌丝体长满袋/瓶后，用于栽培；
完成具有内、外菌幕食用菌菌种制种。
2.根据权利要求1所述具有菌幕食用菌制种的工艺，其特征在于，所述步骤1）优良菌株为自交2-3代的菌株。
3.根据权利要求1所述的具有菌幕食用菌制种的工艺，其特征在于，所述步骤2）采取子实体过程中，采取有内菌幕的子实体时，菌盖、菌柄表面用酒精擦试消毒，孢子被内菌膜包裹呈无菌状态；采取有外菌幕的子实体时，整个外菌幕表面用酒精擦试消毒，孢子被外菌膜包裹呈无菌状态。
4.根据权利要求1所述具有菌幕食用菌制种的工艺，其特征在于，所述步骤3）孢子弹射时间在10-20小时，温度调控在18-32℃（注：草菇30℃左右）。
5.根据权利要求1所述具有菌幕食用菌制种的工艺，其特征在于，所述步骤3）中三角瓶液体培养基制备方法：将玉米粉5份、黄豆粉3份、麸皮1份、酵母膏2份、葡萄糖20份、水1000ml，在100℃ 中煮沸15min后过滤；将过滤液定量至1000ml，在120℃中灭菌40min，冷却，备用。
6.根据权利要求1所述具有菌幕食用菌制种的工艺，其特征在于，所述步骤4）三角瓶液体培养中培养条件为：置于22～30℃，以145-155 r/min振荡培养130-150 h时。
7.根据权利要求1所述具有菌幕食用菌制种的工艺，其特征在于，所述步骤5）液体发酵罐的培养基制备方法：将玉米粉5份、黄豆粉3份、淀粉1份、酵母膏2份、蔗糖20份、水1000ml，根据发酵罐的大小按比例扩大后，加入适量的消泡剂，在121～124℃中灭菌1.5h ，待温度降至25℃备用。
8.根据权利要求1所述具有菌幕食用菌制种的工艺，其特征在于，所述步骤5）发酵罐培养中培养条件为：22～30℃，气压0.05mpa，培养145h。
9.根据权利要求1所述具有内、外菌幕食用菌制种的工艺，其特征在于，所述步骤6）每袋接5 ml即可，置于18～30℃中培养。
10.根据权利要求1所述的具有菌幕食用菌制种的工艺，其特征在于，所述内菌幕种类的食用菌为蜜环菌、香菇、大球盖菇或双胞磨菇或其他，外菌幕的食用菌为草菇、竹荪或冬荪或其他。
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