CN115125264B - 一种含有电信号报告元件的探潜微生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

一种含有电信号报告元件的探潜微生物传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有电信号报告元件的探潜微生物传感器及其制备方法和应用。所述探潜微生物传感器包括细胞色素c操纵子基因ccmA‑H和血红素细胞色素c操纵子基因mtrCAB、金属调控蛋白基因kmtR及其调控启动子P2025、合成启动子PJn。所述探潜微生物传感器能够感应水中潜艇所释放的金属Ni(II)离子以产生输出电信号的变化进而被实时检测，其克服了传统生物传感器所产生的光信号在水中传播受限的问题，与其他非声探潜相比，本发明的探潜微生物传感器操作更简便、信号收集更容易，可以在重要海道进行布防，形成潜艇探测矩阵，多方位、多角度的对周边航行的潜艇进行实时追踪探测，具有很好的应用前景。

Description

一种含有电信号报告元件的探潜微生物传感器及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及一种含有电信号报告元件的探潜微生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
潜艇作为现代海军的重要组成部分，具有隐蔽性高、打击力强的特点。声呐技术作为应用最为广泛的探潜技术，具有水中损耗小、传输距离远等特点。然而，一些新出现的“静音级”、“无声级”潜艇可以将反射的声波隐藏于海洋本身所产生的噪声中，以此来逃避声呐的检测。此外，部分近海、浅海海域复杂的环境所导致声波折射会使声呐设备接收到大量的噪声污染，以至于无法从中区分真正的潜艇信号，这些区域也被认为是声呐探测的盲区。近年来，随着现代微生物学及分子生物学技术的迅猛发展，以微生物为基础的生物传感器技术也受到了广泛的关注。微生物传感器可以感应环境中各类因素的细微变化，并向外界输出易于被检测的生物信号。由于微生物传感器检测灵敏度高、检测靶标选择性多、检测特异性强等特点使其在环境、食品等领域都有所应用，而近年来，微生物传感器的应用研究也在军事领域逐步展开。
潜艇在海洋中长期潜行的情况下，一些特殊的部位很容易受到海水的腐蚀，继而释放出一定量的金属离子。如：潜艇的螺旋桨，由于其材质与艇体不同，且其长期处于高速运动状态，因此更易受到化学腐蚀和电化学腐蚀而释放出金属离子；此外，在目前的核潜艇和AIP动力潜艇中，热交换系统都是必不可少的一部分，而潜艇排出的热废水中也会携带一定量因排水管道内壁腐蚀而释放出的金属离子。另一方面，虽然潜艇艇体都会进行涂层防腐和阴极保护以减缓腐蚀现象的发生，但是艇体中一些焊接部位、杯形管节内表面等特殊结构处还会因腐蚀作用而释放出一定量的金属离子。到目前为止，还没有任何将微生物传感器应用于潜艇探测的研究成果被发表。传统微生物传感器在淡水和饮用水中进行重金属污染的检测，却并不能应对海洋中负责的环境和众多的干扰因素。
因此，在探潜微生物传感器的构建中必须对信号输出元件进行优化和改良，以保证探潜微生物传感器的检测准确性。
发明内容
本发明提供了一种含有电信号报告元件的探潜微生物传感器的制备方法及其应用。所述探潜微生物传感器中含有金属感应蛋白及其启动子和胞外电子传递途径，能够实现潜艇金属的实时检测。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种含有电信号报告元件的探潜微生物传感器，所述探潜微生物传感器中同时包括细胞色素c操纵子基因、金属调控蛋白基因、金属调控蛋白调控启动子、合成启动子。
进一步的，所述细胞色素c操纵子基因为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ccmA-H基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示mtrCAB基因。
进一步的，所述金属调控蛋白基因为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的kmtR基因；所述金属调控蛋白调控启动子为核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的P2025。
进一步的，所述合成启动子为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的PJn。
本发明还提供了所述的探潜微生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将细胞色素c操纵子基因ccmA-H和mtrCAB、金属调控蛋白基因kmtR及金属调控蛋白调控启动子P2025、合成启动子PJn和分别进行扩增、纯化和回收；
(2)将步骤(1)回收的P2025、mtrCAB、PJn、kmtR、ccmA-H片段与利用SalI单酶切的线性化pSEVA-551质粒以1：2：1：2：2：3的质量比进行组装，连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，利用含有四环素的LB平板进行筛选阳克隆菌株，验证正确后得到重组载体pYNi1；
(3)将步骤(2)的重组载体pYNi1转化至受体菌Cupriavidus necator H16中，利用含有四环素、庆大霉素的MSM平板进行筛选阳克隆菌株，验证正确后得到重组菌株H16YNi；
(4)将步骤(3)的重组菌株H16YNi在含有果糖的MSM培养基中活化后，按1％接种量接种至含有相同培养基的微生物燃料电池阳极室内培养，通对微生物燃料电池进行外加0.3V的电压促进阳极材料上形成生物膜，生物膜的成功形成，即表示探潜微生物传感器的成功构建。
进一步的，扩增E.coli来源的细胞色素c操纵子基因ccmA-H的PCR引物的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
进一步的，扩增合成启动子PJn的PCR引物的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
进一步的，扩增M.tuberculosis来源的金属调控蛋白基因kmtR的PCR引物的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。
进一步的，扩增M.tuberculosis来源的金属调控蛋白调控启动子P2025的PCR引物的序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。
进一步的，扩增S.oneidensis来源的血红素细胞色素c操纵子基因mtrCAB的PCR引物的序列如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示。
进一步的，所述阳极材料为炭毡。
本发明还提供了所述的探潜微生物传感器在用于制备实时检测海洋中潜艇释放金属离子的潜艇探测器中的应用。
进一步的，所述潜艇释放金属离子为Ni(II)离子。
进一步的，所述潜艇探测器能够感应到的Ni(II)离子的浓度不低于0.05μmol/L。
进一步的，所述探潜微生物传感器的使用方法为：将所述探潜微生物传感器的阳极材料用于微生物燃料电池的组装，利用含有Ni(II)离子的海水流过微生物燃料电池阳极室，利用电化学工作站检测微生物燃料电池电信号输出变化，每1小时检测一次，一共检测12小时。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1、本发明将含有胞外电子传递途径的报告质粒作为基础质粒，通过连接金属感应启动子，并且利用强组成型启动子启动金属感应蛋白和辅助产电途径，制备成含有电信号报告元件的探潜微生物传感器，该生物感应器能够实时感应海水中微量浓度的特异性金属Ni(II)离子，并产生瞬时的电信号输出，进而实现对海洋中潜艇所释放金属离子的检测，且该方法操作方便、简单、安全性高、灵敏度高。
2、本发明利用细胞色素c和血红素细胞色素c在非产电微生物C.necator H16中构建了胞外电子传递途径，并且利用金属感应蛋白及金属诱导启动子和组成型启动子构建了电子传递途径的联级表达系统。细胞色素c是电子载体，负责电子在细胞内的转运，血红素细胞色素c收到金属感应蛋白及其启动子的诱导表达后可以将细胞内传递的电子跨越周质和外膜，并最终延伸到细胞外部环境，可以算作微生物燃料电池阳极端，从而形成回路，产生易于被检测到的输出电流。含有电信号报告元件的探潜微生物传感器可以克服传统生物传感器输出的光信号在水中不易被检测的技术缺陷，并能够检测到微量的由潜艇释放的特异性金属离子，通过在重要海道进行布防含有该微生物传感器的装置，形成潜艇探测矩阵，多方位、多角度的对周边航行的潜艇进行实时追踪探测，因此具有很好的应用前景。
附图说明
图1为构建的载体pYNi1的质粒图谱。
图2为含有电信号报告元件的探潜微生物传感器实验装置示意图。
图3为构建的工程菌株H16YNi诱导产电检测结果。
图4为含有电信号报告元件的探潜微生物传感器的工作原理示意图。
图5为含有电信号报告元件的探潜微生物传感器的运行流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过购买获得的常规产品。
实施例1：基因的获得和载体的构建
1、基因的获得
将来源于E.coli的细胞色素c操纵子基因ccmA-H(如SEQ ID No.1所示)，来源于M.tuberculosis的金属调控蛋白基因kmtR(SEQ ID No.3所示)及金属感应启动子P2025(SEQID No.4所示)，来源于S.oneidensis的血红素细胞色素c操纵子基因mtrCAB(SEQ ID No.5所示)在华大基因进行合成，连接至pUC57，得到载体pMV530。PJn片段包含于实验室保藏载体p2M-PJn。
2、载体pYNi1的构建
(1)以pMV530为模版，利用引物ccmA-H F/R进行聚合酶链式反应(PCR)扩增ccmA-H片段；利用引物PJn F/R进行PCR反应扩增PJn片段(SEQ ID No.2所示)；利用引物kmtR F/R进行PCR反应扩增kmtR片段；利用引物P2025 F/R进行PCR反应扩增P2025片段；利用引物mtrCABF/R进行PCR反应扩增mtrCAB片段，PCR扩增体系如下所示：
Figure BDA0003684544250000041
Figure BDA0003684544250000051
PCR反应程序为：94℃，5min；98℃，30s；Tm，30s；72℃，2min(2～4kb/min)，30个循环；72℃，10min；10℃，1h。
引物序列如下所示：
ccmA-H F：5’-aaggatgtcgggtaaaaaggaggacaagggtgggtat-3’
ccmA-H R：5’-tgcctgcaggtcgacttatttactctcctgcggcgac-3’
PJn F：5’-agtactagctgggacgatttgattgtctctctgccgt-3’
PJn R：5’-actatctgcgtacatatgtatatctccttcttaaaagatcttttgaatt-3’
kmtR F：5’-gaaggagatatacatatgtacgcagatagtggacctg-3’
kmtR R：5’-cccttgtcctcctttttacccgacatccttggtagc-3’
P2025 F：5’-agagacaatcaaatcgtcccagctagtactggaac-3’
P2025 R：5’-ttgtgcgttcatcatccttgtcctcctttctcttttatct-3’
mtrCAB F：5’-gaaaggaggacaaggatgatgaacgcacaaaaatcaaaaatcg-3’
mtrCAB R：5’-tcctctagagtcgacttagagtttgtaactcatgctcagc-3’
胶回收和纯化：DNA片段的回收和纯化分别参照OMEGA Gel Extraction Kit和Cycle Pure Kit说明书进行。
(2)利用限制性内切酶SalI单酶切载体pSEVA551，酶切体系如下所示：
Figure BDA0003684544250000052
Figure BDA0003684544250000061
反应条件：37℃反应2h。
胶回收和纯化：DNA片段的回收和纯化分别参照OMEGA Gel Extraction Kit和Cycle Pure Kit说明书进行。
(3)Gibson组装构建载体
将回收到的ccmA-H，PJn，kmtR，P2025，mtrCAB片段与单酶切得到的线性化载体pSEVA-551按质量比1：2：1：2：2：3进行混合，总体积保持在5μL以下，随后进行Gibson组装，反应体系如下所示：
Figure BDA0003684544250000062
反应条件：50℃反应1h，冰浴10min。
反应结束后，将反应产物按全部转化进入Trans1 T1大肠杆菌感受态细胞中，涂布至含有四环素的LB平板中，12～16小时培养后挑取阳克隆利用引物pSEVA551Y F/R进行菌落PCR验证，验证体系如下所示：
Figure BDA0003684544250000063
PCR反应程序为：94℃，5min；98℃，30s；50℃，30s；72℃，5min，30个循环；72℃，10min；10℃，1h。
引物序列如下所示：
pSEVA551Y F：GCCTTTAATTAAAGCGGATAAC
pSEVA551Y R：CAGTTTATCGATGATAAGCTGTC
如图1所示，将验证正确的阳克隆培养后进行质粒提取和测序，质粒提取方法参照OMEGA Plasmid DNAMini Kit I说明书进行。将测序结果正确的菌株进行培养，将生长好的工程菌株利用20％甘油在-80℃保藏。
实施例2：工程菌株H16YNi的构建
利用三亲接合转移的方法将载体转化入C.necator H16中，具体操作步骤如下：
(1)含有载体pYNi1的大肠杆菌T1为供体菌，含有质粒pRK2013的大肠杆菌T1为辅助菌，C.necator H16为受体菌。
(2)将供体菌、受体菌和辅助菌各取10mL，4000rpm离心10min收集菌体。
(3)用5mL不含任何抗性的LB培养基重悬菌体，4000rpm离心10min再次收集菌体，用枪头吸净离心管底液体。
(5)加入50～70μL不含任何抗性的LB培养基重悬菌体，将供体菌、辅助菌和受体菌混合均匀，再将混合菌液集中滴加在放有纤维滤纸的无抗LB固体平板培养基上，30℃下放置培养24h。
(6)用枪头将滤纸上的菌苔全部洗入1mL无菌水中，轻轻吹吸使菌液分布均匀，将菌液做适当稀释后取100μL涂至双抗LB固体平板上，30℃放置培养48h。
(7)挑取上述平板中生长的单克隆接种于含有双抗和果糖的MSM培养基中培养24～48h，提取质粒进行PCR验证，质粒提取方法参照OMEGA Plasmid DNA Mini Kit I说明书进行，PCR验证体系如下：
Figure BDA0003684544250000071
Figure BDA0003684544250000081
PCR反应程序为：94℃，5min；98℃，30s；50℃，30s；72℃，5min，30个循环；72℃，10min；10℃，1h。
将验证正确的工程菌株利用20％甘油在-80℃保藏。
实施例3：含有电信号报告元件的探潜微生物传感器生物膜的构建
将在含有果糖的MSM培养基中活化的H16YNi按1％接种量接种至含有相同培养基的微生物燃料电池阳极室内，通对微生物燃料电池进行外加0.3V的电压促进碳毡阳极上生物膜的形成，H16YNi生物膜的成功形成，即表示含有电信号报告元件的探潜微生物传感器已构建成功。
实施例4：含有电信号报告元件的探潜微生物传感器检潜艇释放金属离子的应用
(1)测试装置的搭建
如图2所示，在阳极室和阴极室中间放置密封圈，再将二者夹紧进行组装，并确保溶液不向外泄露。碳毡由导线连接分别位于阳极室和阴极室中，其中在阳极室中的位置与进水口相平行，在阴极室中垂直于底部，其中阳极室碳毡上包含有已经培养形成的H16YNi生物膜。阳极室装载含有果糖和抗生素的MSM培养基，阴极室装载由K3[Fe(CN)6]、K2HPO4和KH2PO4所配置的电解液。在装置进水口设置反渗透膜，以保证只有的水和金属离子可以进出反应装置，装置的阳极和阴极外接电化学工作站用于输出电信号的检测。
(2)输出电信号的检测
将构建的装置中通入含有Ni(II)浓度为0.05μmol/L的模拟海水，利用电化学工作站检测微生物燃料电池电信号输出变化，每1小时检测一次，一共检测12小时。结果如图3所示，在金属离子存在的情况下含有电信号报告元件的探潜微生物传感器电信号输出与无金属离子时有显著性的提高，2小时后电流密度达到了1μA/cm2以上，后期金属离子全部排除后电流密度又降低到平稳值。
因此，如图4和图5所示，在实际使用中，敌方潜艇航行至我国关键水域水道时会释放金属离子，将本发明制备的含有电信号报告元件的探潜微生物传感器安装于潜艇探测器上，并部署于关键水域水道形成列阵，用来感应特定金属离子；当敌艇接近，潜艇探测器中的金属感应元件感应到金属离子浓度升高，则会发出生物信号，进而转化为电流信号进行输出，我方则监测到电信号变化；当敌艇远离，金属离子浓度减低，最终使得电流信号降低至稳定，进而实现对海洋中潜艇的监测。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种含有电信号报告元件的探潜微生物传感器及其制备方法和应用
<141> 2022-06-08
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgggtatgc ttgaagccag agagttactt tgtgagcggg atgaacgaac cttatttagt 60
ggcttgtcat ttacgctgaa cgcaggagag tgggtacaaa tcaccggtag caacggcgcg 120
gggaagacaa cgcttctccg tttgctgacg gggttgtctc gccctgacgc aggcgaggtt 180
ctctggcaag ggcagccctt gcatcaggta cgcgacagct accatcaaaa cctgttatgg 240
ataggccatc agccggggat caaaacccgg ctgacggcgt tagaaaatct gcacttttat 300
catcgcgatg gcgataccgc acaatgtctg gaagccctgg cgcaggccgg gcttgccgga 360
ttcgaagata ttcctgtaaa tcagctctcg gccgggcaac aacgccgcgt cgctttagcg 420
cgtctgtggc tgacccgtgc cacgttatgg atcctcgacg agccttttac cgcgattgac 480
gttaacggtg tcgatcgtct gacccagcgt atggcgcagc atacggagca gggggggatt 540
gtgattctga ctacccacca gccgctcaac gttgctgaaa gtaaaattcg ccgcatttca 600
ctgacgcaaa cgagggccgc atgaatgatg ttctggcgca ttttccgtct tgagctgcgt 660
gtagcgtttc gccatagcgc cgaaatcgcc aacccgctgt ggttcttcct gattgtaatt 720
accctttttc cgctcagtat cggtccggag ccgcaactgc tggcgcgtat tgcaccgggc 780
attatctggg ttgctgcgct gctttcatcc ttgctggcgc tggaacgact gttccgtgac 840
gatttgcagg acggcagtct tgaacaattg atgttgttgc cgttaccctt gcccgccgtt 900
gtgctggcga aggtgatggc gcactggatg gtaaccggtc tgccgttact catcctttcg 960
ccactggtag caatgctact gggaatggat gtttatggct ggcaagtgat ggcgctgacg 1020
ctgctgctgg gaacgcctac gcttggcttt ctcggtgcac cgggcgtggc gctgacagtg 1080
ggacttaagc gcggtggtgt gctgctcagc atactggtgt taccgctgac tatcccatta 1140
ctcatctttg ccaccgccgc gatggacgcg gcttctatgc atttgcccgt tgacgggtat 1200
ctggcaattt taggcgcgtt gctggcaggc accgcgacat taagtccttt tgcgacggcg 1260
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gcatcaatgg cagtggcagc gtttattggc cttgtctggc agatgaaaat ggccaacctg 1560
gcggtggcgg cgatggcccc cattggtgcc gtgtttacct ttattgccct ggttaccggc 1620
tctgcatggg gaaaaccgat gtggggcacc tggtgggtat gggatgcacg tctgacttct 1680
gaactggtgc tgctgttttt gtatgtgggt gtgattgccc tgtggcacgc cttcgacgac 1740
cgccgtctgg cgggccgtgc ggcaggtatc ctggtgctga ttggcgtggt gaatctgccg 1800
attattcatt actccgtgga gtggtggaac accctgcatc agggatcaac gcggatgcag 1860
caaagtatcg atccggcgat gcgttcgccg ctgcgctggt cgatttttgg cttcctgctc 1920
ctgtctgcca cgctgacgct gatgcggatg cgtaatttga ttttgctgat ggaaaaacgc 1980
cgtccgtggg tgagtgaact gatactgaaa agaggccgta aatgaatgac ccctgcattt 2040
gcttcctgga atgaattttt cgcaatgggc ggttacgcct tttttgtctg gctggcggtg 2100
gtgatgaccg ttattccgct ggtggttttg gtcgtgcact cggtgatgca acatcgcgca 2160
attctgcgtg gcgtggcgca acagcgggcg cgtgaggcgc gtttacgtgc tgcgcaacag 2220
caggaggctg catgaatgaa tattcgccgt aaaaaccgct tgtggattgc ctgtgccgtg 2280
ttggcagggc tggcgctgac tatcggtctg gtgctatatg cgctgcgctc gaatatcgat 2340
ctcttttata cgccggggga aattctctac ggcaagcgtg aaactcagca aatgccggaa 2400
gtcggtcagc gtctgcgcgt tggcgggatg gtgatgccgg gtagtgtgca gcgcgatccc 2460
aattcgctga aagtgacctt caccatttac gatgctgaag gctcagtgga tgtctcttac 2520
gaaggcattt tgccggatct gttccgtgaa gggcagggcg ttgtggtgca gggcgaactg 2580
gaaaaaggca atcatatcct cgcgaaagaa gtgctggcga aacacgatga aaactatacg 2640
ccgccagaag ttgagaaagc gatggaagct aaccaccgtc gcccggcgag tgtttataag 2700
gacccagcat catgaatgat gccagaaatt ggtaacggac tgctgtgcct ggcgctggga 2760
attgcgctgc tgctgtccgt gtatccgcta tggggcgtgg cgcgcggaga tgcgcgcatg 2820
atggcgtctt cccgcttgtt tgcctggctg ctgtttatgt ctgtggctgg cgcatttctg 2880
gtgctggtca atgctttcgt ggtcaacgac ttcaccgtca cctatgttgc cagcaactcc 2940
aatacccagc ttccggtgtg gtatcgcgtg gcggctacct ggggcgcgca tgaaggctcg 3000
ctactgctgt gggtgctgct gatgagcggc tggacctttg cggtggcgat ttttagtcag 3060
cgtattccgc tggatattgt ggcccgtgta ctggcgataa tggggatggt cagtgtcggc 3120
tttttgctgt tcattctctt tacctctaac ccgttctctc gcacgttgcc gaacttcccg 3180
attgaaggtc gcgatcttaa cccgctattg caggatccgg ggctgatctt ccatccgcct 3240
ctgctttata tggggtacgt gggtttctcg gtggcgtttg cttttgccat tgcttctttg 3300
ctgagcgggc gtctggacag cacttatgcg cgttttactc gtccgtggac gctggcagcg 3360
tggatcttcc tgacgctcgg catcgtgctc ggttccgcat gggcctatta cgaactcggc 3420
tggggtggct ggtggttctg ggatccggta gaaaacgcct cgtttatgcc gtggctggtg 3480
gggactgcgc tgatgcactc actggcggtc actgaacaac gcgccagctt caaagcgtgg 3540
acattactgc tggcaatcag tgccttctcg ttgtgtctgt tggggacttt cctcgtgcgt 3600
tccggcgtgc tggtatcggt acacgcgttt gcgtctgatc cggcgcgcgg tatgtttatc 3660
ctcgccttta tggtgctggt gattggcggt tcgctgctgc tgtttgccgc gcgtggacac 3720
aaagttcgct cacgcgtaaa caatgcgctg tggtcgcggg aatctttgct gttagcgaac 3780
aatgttttgc tggtcgctgc gatgctggtg gtgttgctgg ggacgctgct gccgttggtg 3840
cataagcaac tgggactggg cagtatttcg attggcgaac cgttcttcaa caccatgttt 3900
acctggctga tggtgccgtt tgcgctactg cttggtgtcg gtcctctggt gcgctggggg 3960
cgggatcgcc cgcgtaagat ccgcaattta ttgattatcg ccttcatctc tacgctggtg 4020
ctgtcgctgc tgttgccgtg gctgttcgaa agcaaagttg tggcgatgac ggtgctcggc 4080
ctggcaatgg cctgctggat tgcggtgctg gcaattgcgg aagctgcgct acgtatttca 4140
cgcggcacga aaaccacctt cagttattgg gggatggtgg cggctcacct tgggctggca 4200
gtgacaattg ttggcattgc ctttagccag aactatagcg ttgagcgtga tgtgcgcatg 4260
aagtccggcg atagcgtcga tattcatgaa tatcgcttca ccttccgtga tgtcaaagag 4320
gtgactggcc cgaactggcg tggcggtgtg gcgactatcg gcgtaacgcg cgatggcaag 4380
ccggaaacgg tgctgtatgc ggaaaaacgt tattacaaca ctgccgggtc gatgatgacc 4440
gaagcggcaa ttgacggcgg catcacgcgt gacctgtacg cggccctcgg tgaagagctg 4500
gaaaacggcg cgtgggccgt gcgtctttac tacaaaccat ttgttcgctg gatttgggcg 4560
ggcgggctga tgatggcgtt gggcggactg ctgtgtctgt ttgatcctcg ctatcgtaag 4620
cgcgtgagtc cgcaaaaaac tgcgccggag gccgtatgaa tgaagcgcaa agtattgtta 4680
attccgttga ttatcttcct ggcgattgcc gcggcgctgc tgtggcagct ggcgcgtaat 4740
gccgaagggg atgatccgac caatctggaa tcggcgctca ttggcaagcc tgtgccgaag 4800
tttcgtctcg aatcactgga caatccgggg cagttttatc aggcggatgt gctgactcag 4860
ggcaaaccag tactgcttaa cgtctgggcg acctggtgtc cgacctgccg tgcggaacat 4920
caatatctga atcagctttc tgcgcagggc atccgcgtgg tcggcatgaa ctataaagac 4980
gatcgccaga aggcaatcag ctggctgaaa gagctgggca atccttacgc gctaagcctg 5040
tttgatggcg atggcatgtt agggctggat ctcggtgtct atggcgcgcc agaaacgttt 5100
cttattgacg gcaacggcat cattcgctat cgccatgcgg gcgatctgaa tcctcgcgtc 5160
tgggaagaag agatcaagcc gctgtgggag aaatacagta aggaggccgc acaatgaatg 5220
aggtttttat tgggcgtgct gatgctgatg atctccggct cagcgctggc gaccatcgat 5280
gtgttgcagt ttaaagatga agcacaggaa caacagttcc gtcagctcac tgaagaactg 5340
cgctgcccga aatgccagaa caacagcatt gccgattcca actcgatgat tgccaccgac 5400
ctgcgtcaga aagtgtatga actgatgcag gaaggtaaaa gtaaaaaaga gattgtcgat 5460
tatatggtgg cgcgttacgg caacttcgtc acttacgatc cgccgttaac gccgctgacc 5520
gtgctgctgt gggtgctgcc agtagtggct attggcattg gcggttgggt catatacgcc 5580
cgctcgcggc gtcgggtacg cgtggtgccg gaagcgtttc ctgaacaaag cgtgccggaa 5640
ggtaagcgtg ccggatatgt tgtttatctg ccgggtattg tggtggcgtt aattgtggct 5700
ggcgtcagct actaccagac tggcaattat cagcaggtga aaatctggca gcaggccacg 5760
gcacaggctc cggcgttgct ggacagggcg ctggatccga aagccgatcc gctcaacgaa 5820
gaagagatgt cgcgtcttgc gctggggatg cgtactcaac tgcaaaaaaa tccgggagat 5880
atagaaggct ggattatgtt gggccgcgtt ggcatggcgc tgggtaacgc cagtatcgcc 5940
accgatgcat acgccactgc gtatcgcctc gatccgaaaa acagtgatgc tgcactggga 6000
tacgctgaag cgttgactcg ttcatctgat cccaacgaca accgcctcgg cggtgaactg 6060
ctacgtcagc tggtgagaac ggaccatagc aatatccgtg tgctaagcat gtatgcgttt 6120
aatgcctttg agcagcagcg atttggcgaa gccgttgccg cgtgggagat gatgttgaaa 6180
ctcttacctg ccaacgatac tcgccgtgcg gtgattgaac gtagtatcgc gcaggcgatg 6240
caacatttgt cgccgcagga gagtaaataa 6270
<210> 2
<211> 634
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatttgattg tctctctgcc gtcactattc gaaccggctc cgggcattgc cctggccggc 60
actttgcatg gggagatgct atccgaatgg acccggcttg cgcctccccc aaagcgggag 120
ggtctgccgg cacatctgcc ctggaactgg ctggaagccc tcgaccgcac ctgctgcggc 180
cgtggcttgc gtccattccg atagcggctc cccttttatc cggcaagcgc gacattctcg 240
catggagacg ccatgcgcta tgcttgccgg agaaacctgg gaatcgtcag cgattccgag 300
acatttgagt ccattgttgc cttgcaacgc acgcgctgtc aatgcgggaa tccgcctcgg 360
cactgcacgc ttcccgacct accggacggt atgcagcgct cgcatctgcc gaggccccag 420
agcataggcg agaaggatga atttttgatg tacatcgtgg ccattgctgc agagcggata 480
taaaaaccgt tattgacaca ggtggaaatt taaaatatac tgttagtaaa cctaatggat 540
cgaccttgaa ttcaaaagat ctgggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgg 600
aattcaaaag atcttttaag aaggagatat acat 634
<210> 3
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtacgcag atagtggacc tgacccgttg cctgacgatc aggtctgctt ggtggtcgag 60
gtgttccgaa tgctcgccga cgcgacccgc gtgcaggtgc tgtggtcgct ggcagaccgc 120
gaaatgtcgg tcaatgaact cgccgagcag gtgggcaagc ccgcgccgtc ggtctcccag 180
cacctggcaa agctacgaat ggcgcggctg gtgcgcaccc gccgcgatgg aaccacgatc 240
ttttaccgtc tggagaacga gcacgtgcgc cagctcgtca tcgacgccgt tttcaacgcc 300
gagcacgccg gtcccgggat tccccgccac caccgtgctg ccggcggact gcagtcggtc 360
gctaaggcat cggctaccaa ggatgtcggg taa 393
<210> 4
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcccagcta gtactggaac cggcgagagc atccgctatt atctgcgtat gaatgcagat 60
aaaagag 67
<210> 5
<211> 5112
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgatgaacg cacaaaaatc aaaaatcgca ctgctgctcg cagcaagtgc cgtcacaatg 60
gccttaaccg gctgtggtgg aagcgatggt aataacggca atgatggtag tgatggtggt 120
gagccagcag gtagcatcca gacgttaaac ctagatatca ctaaagtaag ctatgaaaat 180
ggtgcaccta tggtcactgt tttcgccact aacgaagccg acatgccagt gattggtctc 240
gcaaatttag aaatcaaaaa agcactgcaa ttaataccgg aaggggcgac aggcccaggt 300
aatagcgcta actggcaagg cttaggctca tcaaagagct atgtcgataa taaaaacggt 360
agctatacct ttaaattcga cgccttcgat agtaataagg tctttaatgc tcaattaacg 420
caacgcttta acgttgtttc tgctgcgggt aaattagcag acggaacgac cgttcccgtt 480
gccgaaatgg ttgaagattt cgacggccaa ggtaatgcgc cgcaatatac aaaaaatatc 540
gttagccacg aagtatgtgc ttcttgccac gtagaaggtg aaaagattta tcaccaagct 600
actgaagtcg aaacttgtat ttcttgccac actcaagagt ttgcggatgg tcgcggcaaa 660
ccccatgtcg cctttagtca cttaattcac aatgtgcata atgccaacaa agcttggggc 720
aaagacaata aaatccctac agttgcacaa aatattgtcc aagataattg ccaagtttgt 780
cacgttgaat ccgacatgct caccgaggca aaaaactggt cacgtattcc aacaatggaa 840
gtctgttcta gctgtcacgt agacatcgat tttgctgcgg gtaaaggcca ctctcaacaa 900
ctcgataact ccaactgtat cgcctgccat aacagcgact ggactgctga gttacacaca 960
gccaaaacca ccgcaactaa gaacttgatt aatcaatacg gtatcgagac tacctcgaca 1020
attaataccg aaactaaagc agccacaatt agtgttcaag ttgtagatgc gaacggtact 1080
gctgttgatc tcaagaccat cctgcctaaa gtgcaacgct tagagatcat caccaacgtt 1140
ggtcctaata atgcaacctt aggttatagt ggcaaagatt caatatttgc aatcaaaaat 1200
ggagctcttg atccaaaagc tactatcaat gatgctggca aactggttta taccactact 1260
aaagacctca aacttggcca aaacggcgca gacagcgaca cagcatttag ctttgtaggt 1320
tggtcaatgt gttctagcga aggtaagttt gtagactgtg cagaccctgc atttgatggt 1380
gttgatgtaa ctaagtatac cggcatgaaa gcggatttag cctttgctac tttgtcaggt 1440
aaagcaccaa gtactcgcca cgttgattct gttaacatga cagcctgtgc caattgccac 1500
actgctgagt tcgaaattca caaaggcaaa caacatgcag gctttgtgat gacagagcaa 1560
ctatcacaca cccaagatgc taacggtaaa gcgattgtag gccttgacgc atgtgtgact 1620
tgtcatactc ctgatggcac ctatagcttt gccaaccgtg gtgcgctaga gctaaaacta 1680
cacaaaaaac acgttgaaga tgcctacggc ctcattggtg gcaattgtgc ctcttgtcac 1740
tcagacttca accttgagtc tttcaagaag aaaggcgcat tgaatactgc cgctgcagca 1800
gataaaacag gtctatattc tacgccgatc actgcaactt gtactacctg tcacacagtt 1860
ggcagccagt acatggtcca tacgaaagaa accctggagt ctttcggtgc agttgttgat 1920
ggcacaaaag atgatgctac cagtgcggca cagtcagaaa cctgtttcta ctgccatacc 1980
ccaacagttg cagatcacac taaagtgaaa atgtaaatga agaactgcct aaaaatgaaa 2040
aacctactgc cggcacttac catcacaatg gcaatgtctg cagttatggc attagtcgtc 2100
acaccaaacg cttatgcgtc gaagtgggat gagaaaatga cgccagagca agtcgaagcc 2160
accttagata agaagtttgc cgaaggcaac tactccccta aaggcgccga ttcttgcttg 2220
atgtgccata agaaatccga aaaagtcatg gaccttttca aaggtgtcca cggtgcgatt 2280
gactcctcta agagtccaat ggctggcctg caatgtgagg catgccacgg cccactgggt 2340
cagcacaaca aaggcggcaa cgagccgatg atcacttttg gtaagcaatc aaccttaagt 2400
gccgacaagc aaaacagcgt atgtatgagc tgtcaccaag acgataagcg tatgtcttgg 2460
aatggcggtc accatgacaa tgccgatgtt gcttgtgctt cttgtcacca agtacacgtc 2520
gcaaaagatc ctgtgttatc taaaaacacg gaaatggaag tctgtactag ctgccataca 2580
aagcaaaaag cggatatgaa taaacgctca agtcacccac tcaaatgggc acaaatgacc 2640
tgtagcgact gtcacaatcc ccatgggagc atgacagatt ccgatcttaa caagcctagc 2700
gtgaatgata cctgttattc ctgtcacgcc gaaaaacgcg gcccaaaact ttgggagcat 2760
gcacccgtca ctgagaattg tgtcacttgc cacaatcctc acggtagtgt gaatgacggt 2820
atgctgaaaa cccgtgcgcc acagctatgt cagcaatgtc acgccagcga tggccacgcc 2880
agcaacgcct acttaggtaa cactggatta ggttcaaatg tcggtgacaa tgcctttact 2940
ggtggaagaa gctgcttaaa ttgccatagt caggttcatg gttctaacca tccatctggc 3000
aagctattac agcgctaaat gaaatttaaa ctcaatttga tcactctagc gttattagcc 3060
aacacaggct tggccgtcgc tgctgatggt tatggtctag cgaatgccaa tactgaaaaa 3120
gtgaaattat ccgcatggag ctgtaaaggc tgcgtcgttg aaacgggcac atcaggcact 3180
gtgggtgtcg gtgtcggtta taacagcgaa gaggatattc gctctgccaa tgcctttggt 3240
acatccaatg aagtggcggg taaatttgat gccgatttaa actttaaagg tgaaaagggt 3300
tatcgtgcca gtgttgatgc ttatcaactc ggtatggatg gcggtcgctt agatgtcaat 3360
gcgggcaaac aaggccagta caacgtcaat gtgaactatc gccaaattgc tacctacgac 3420
agcaatagcg ccctatcgcc ctacgcgggt attggtggca ataacctcac gttaccggat 3480
aactggataa cagcaggttc aagcaaccaa atgccactct tgatggacag cctcaatgcc 3540
ctcgaactct cacttaaacg tgagcgcacg gggttgggat ttgaatatca aggtgaatcc 3600
ctgtggagca cctatgttaa ctacatgcgt gaagagaaaa ccggcttaaa acaagcctct 3660
ggtagcttct tcaaccaatc gatgatgtta gcagagccgg tggattacac cactgacacc 3720
attgaagcgg gtgtcaaact caagggtgat cgttggttta ccgcactcag ttacaatggg 3780
tcaatattca aaaacgaata caaccaattg gactttgaaa atgcttttaa ccccaccttt 3840
ggtgctcaaa cccaaggtac gatggcactc gatccggata accagtcaca caccgtgtcg 3900
ctgatgggac agtacaacga tggcagcaac gcactgtcgg gtcgtattct gaccggacaa 3960
atgagccaag atcaggcgtt agtgacggat aactaccgtt atgctaatca gctcaatacc 4020
gatgccgtcg atgccaaagt cgatctactg ggtatgaacc tgaaagtcgt tagcaaagtg 4080
agcaatgatc ttcgcttaac aggtagttac gattattacg accgtgacaa taatacccaa 4140
gtagaagaat ggactcagat cagcatcaac aatgtcaacg gtaaggtggc ttataacacc 4200
ccttacgata atcgtacgca acgctttaaa gttgccgcag attatcgcat tacccgcgat 4260
atcaaactcg atggtggtta tgacttcaaa cgtgaccaac gtgattatca agaccgtgaa 4320
accacggatg aaaataccgt ttgggcccgt ttacgtgtaa acagcttcga tacttgggac 4380
atgtgggtaa aaggcagtta cggtaaccgt gacggctcac aataccaagc gtctgaatgg 4440
acctcttctg aaaccaacag cctgttacgt aagtacaatc tggctgaccg tgacagaact 4500
caagtcgaag cacggatcac ccattcgcca ttagaaagcc tgactatcga tgttggtgcc 4560
cgttacgcgt tagatgatta taccgatact gtgattggat taactgagtc aaaagacacc 4620
agttatgatg ccaacatcag ttatatgatc accgctgact tactggcaac cgccttctac 4680
aattaccaaa ccattgagtc tgaacaggcg ggtagcagca attacagcac cccaacgtgg 4740
acaggcttta tagaagatca ggtagatgtg gtcggtgcag gtatcagcta caacaatctg 4800
ctggagaaca agttacgcct aggactggac tacacctatt ccaactccga cagtaacact 4860
caagtcagac aaggtatcac tggcgactat ggtgattatt ttgccaaagt gcataacatt 4920
aacttatacg ctcaatatca agccaccgag aaactcgcgc tgcgcttcga ttacaaaatt 4980
gagaactata aggacaatga cgccgcaaat gatatcgccg ttgatggcat ttggaacgtc 5040
gtaggttttg gtagtaacag ccatgactac accgcacaaa tgctgatgct gagcatgagt 5100
tacaaactct aa 5112
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaggatgtcg ggtaaaaagg aggacaaggg tgggtat 37
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcctgcagg tcgacttatt tactctcctg cggcgac 37
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agtactagct gggacgattt gattgtctct ctgccgt 37
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
actatctgcg tacatatgta tatctccttc ttaaaagatc ttttgaatt 49
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggagata tacatatgta cgcagatagt ggacctg 37
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccttgtcct cctttttacc cgacatcctt ggtagc 36
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agagacaatc aaatcgtccc agctagtact ggaac 35
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttgtgcgttc atcatccttg tcctcctttc tcttttatct 40
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaaggagga caaggatgat gaacgcacaa aaatcaaaaa tcg 43
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcctctagag tcgacttaga gtttgtaact catgctcagc 40
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcctttaatt aaagcggata ac 22
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cagtttatcg atgataagct gtc 23

Claims (8)

1.一种含有电信号报告元件的探潜微生物传感器，其特征在于，所述探潜微生物传感器中同时包括细胞色素c操纵子基因、金属调控蛋白基因、金属调控蛋白调控启动子、合成启动子；
所述细胞色素c操纵子基因为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ccmA-H基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示mtrCAB基因；
所述金属调控蛋白基因为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的kmtR基因；所述金属调控蛋白调控启动子为核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的P 2025。
2.根据权利要求1所述的探潜微生物传感器，其特征在于，所述合成启动子为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的PJn。
3.权利要求1-2任一项所述的探潜微生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将细胞色素c操纵子基因ccmA-H和mtrCAB、金属调控蛋白基因kmtR及金属调控蛋白调控启动子P 2025、合成启动子PJn分别进行扩增、纯化和回收；
（2）将步骤（1）回收的P 2025、mtrCAB、PJn、kmtR、ccmA-H片段与利用SalI单酶切的线性化pSEVA-551质粒以1：2：1：2：2：3的质量比进行组装，连接产物转入感受态细胞，筛选阳克隆菌株，得到重组载体pYNi1；
（3）将步骤（2）的重组载体pYNi1转化至受体菌中，筛选阳克隆菌株，得到重组菌株H16YNi；
（4）将步骤（3）的重组菌株H16YNi活化培养，并使其在阳极材料上形成致密的生物膜，得到探潜微生物传感器。
4.根据权利要求3所述的探潜微生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）的具体方法为：将所述重组菌株H16YNi在含有果糖的MSM培养基中活化后，按1%接种量接种至含有相同培养基的微生物燃料电池阳极室内培养，通对微生物燃料电池进行外加0.3 V的电压促进阳极材料上形成生物膜，生物膜的成功形成，即表示探潜微生物传感器的成功构建。
5.根据权利要求4所述的探潜微生物传感器的制备方法，其特征在于，所述阳极材料为炭毡。
6.权利要求1-2任一项所述的探潜微生物传感器在用于制备实时检测海洋中潜艇释放金属离子的潜艇探测器中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述潜艇释放金属离子为Ni(II)离子。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述潜艇探测器能够感应到的Ni(II)离子的浓度不低于0.05 μmol/L。
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