CN115125236A

CN115125236A - Benzonase免疫噬菌体展示抗体库的构建方法、单克隆抗体、编码基因和试剂盒

Info

Publication number: CN115125236A
Application number: CN202210298731.3A
Authority: CN
Inventors: 易红飞; 朱倩静; 张蕊蕊; 王星
Original assignee: Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2022-03-22
Filing date: 2022-03-22
Publication date: 2022-09-30

Abstract

本发明提供一种Benzonase免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其步骤包括：(1)用Benzonase蛋白免疫兔，提取淋巴细胞的总RNA，逆转录成cDNA；(2)利用PCR技术扩增重链可变区和轻链可变区片段并拼接成scFv基因；(3)构建pCANTAB5E‑scFv重组质粒，电转化至TG1感受态细胞，构建噬菌体单链抗体库；(4)特异性富集噬菌体单链抗体库，从中筛选出阳性克隆。并公开了筛选得到的单克隆抗体及其编码基因。本发明通过噬菌体展示抗体库技术筛选得到高亲和力的兔源单链抗体。本发明的单链抗体可以通过大肠杆菌BL21表达得到，为免疫检测试剂盒的开发提供可选的原料。

Description

Benzonase免疫噬菌体展示抗体库的构建方法、单克隆抗体、编码基因和试剂盒

技术领域

本发明专利涉及一种Benzonase免疫噬菌体展示抗体库的构建方法、Benzonase单克隆抗体scFv及其编码基因。

背景技术

Benzonase是一种来自于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，经基因工程改造的核酸内切酶。Benzonase可降解双链、单链、线状、环状的DNA和RNA，完全将核酸降解成3～5 个碱基长度的5'-单磷酸寡核苷酸。因其能高效降解任何形式的DNA和RNA，又被称为“全能核酸酶”。无论在实验室研究还是在工业级生产的过程中，Benzonase是去除生物制品中所有形式DNA和RNA的一种有效工具酶。通过高效的核酸去除，可显著提升后续实验、生产的效果及产量，性能优于其他核酸去除方法。

Benzonase属于重组蛋白表达产品，在生物制品中不能有残留，在生物制品生产过程中使用Benzonase去除核酸后，还需要对Benzonase进行清除，并且进行残留检测，确保产品符合生产标准要求。已有研究表明Benzonase免疫小鼠免疫原性很差，难以得到高亲和力的鼠源单克隆抗体，本发明目的通过噬菌体展示抗体库技术筛选得到高亲和力的兔源单链抗体。本发明的单链抗体可以通过大肠杆菌BL21表达得到，为免疫检测试剂盒的开发提供可选的原料。

发明内容

本发明的目的是提供一种Benzonase免疫噬菌体展示抗体库的构建方法。

一种Benzonase免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征在于其步骤包括：

(1)用Benzonase蛋白免疫兔，提取淋巴细胞的总RNA，逆转录成cDNA；

(2)利用PCR技术扩增重链可变区和轻链可变区片段并拼接成scFv基因；

(3)构建pCANTAB5E-scFv重组质粒，电转化至TG1感受态细胞，构建噬菌体单链抗体库；

(4)特异性富集噬菌体单链抗体库，从中筛选出阳性克隆。

优选的，步骤(2)中PCR技术使用的引物如下：

优选的，步骤(2)中重链VH上游引物(VH-F1、VH-F2、VH-F3、VH-F4)和下游引物(VH-R)两两混合进行PCR，轻链VLK上游引物(VLK-F1、VLK-F2)和下游引物(VLK-R1、 VLK-R2、VLK-R3)两两混合进行PCR，轻链VLlamda-F和VLlamade-R引物混合进行PCR，将获得的轻链VL和重链VH的PCR产物回收并等摩尔混合作为模板，使用引物表中相对应的重链上游引物和轻链下游引物进行PCR。

优选的，步骤(4)中特异性富集噬菌体单链抗体库具体指取抗原用PBS，混匀后包被于免疫管，用封闭液，添加噬菌体单链抗体库，加入BSA溶液孵育；

洗脱：加入pH 2.2 Gly-HCl，静置后，用枪头用力吹打后收集，收集管内加入pH8.5 Tris-HCl中和pH，再加入BSA溶液稀释；

洗脱产物扩增：取洗脱产物加入TG1菌液中培养，加入M13K07辅助噬菌体继续培养，菌液离心，用2×YT培养基重悬沉淀，过夜震荡培养；第二天将菌液离心，上清液体转移至新的离心管，加入PEG-NaCl，冰上静置沉析后离心，然后去除上清，用BSA溶液重悬沉淀，转至另一EP管，离心，去除沉淀，上清即为扩增富集产物；

重复上述步骤，进行多次淘选，提高每轮淘选严苛程度，富集得到具有亲和力的噬菌体。

本发明还公开了一种Benzonase单克隆抗体scFv，其序列为SEQ ID No.1～6中任一所述，依次命名为scFv1、scFv2、scFv3、scFv4、scFv5、scFv6。

本发明还公开了一种Benzonase单克隆抗体scFv编码基因，其序列为SEQ ID No.7～12 中任一所述。其中序列如SEQ ID No.7所示的DNA编码scFv1，依次类推。

本发明还公开了一种Benzonase检测试剂盒，含有上述的Benzonase单克隆抗体scFv。

优选的，Benzonase检测试剂盒含有序列如SEQ ID No.2所示的抗体scFv2作为包被抗体，还含有的序列如SEQ ID No.1所示的抗体scFv1，对scFv1进行生物素标记。

本发明的Benzonase免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，可筛选得到具有高亲和力的兔源单链抗体，可构建出库容量5.23×10⁷、重组噬菌体滴度为2.86×10¹⁴pfu/ml、重组率为92.3％的噬菌体单链抗体库。本发明的单链抗体可以通过大肠杆菌BL21表达得到，开发的免疫检测试剂盒具有很高的灵敏性。

附图说明

图1是提取的总RNA电泳图。

图2是轻链VL、重链VH基因的PCR产物凝胶电泳图。

图3是scFv基因PCR产物凝胶电泳图。

图4是pCANTAB5E质粒双酶切前后电泳图。

图5是连接产物电转化的平板图。

图6是菌落PCR鉴定图。

图7是重组蛋白scFv纯化图。

图8是拟合的标准曲线。

具体实施方式

本发明实施例的主要材料如下：

弗式完全/不完全佐剂，购自德国Sigma公司。

新西兰大白兔(2-2.5kg),购自上海甲干生物有限公司。

超纯RNA提取试剂盒(DNase I)，购自康为世纪生物科技有限公司。

无水乙醇，三氯甲烷，丙三醇(甘油)购自国药集团。

PCR扩增引物，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

卡那霉素，氨苄青霉素，购自索莱宝生物科技有限公司。

PEG8000,购自Sigma。

Sfi1，Not1限制性内切酶，T4 DNA ligase，购自英国NEB。

SanPrep柱式DNA胶回收/质粒小提试剂盒/PCR产物纯化试剂盒，20×PBS,Tween20, 购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

大肠杆菌(E.coli)TG1 Electro感受态细胞，E.coli DH5α感受态细胞购自上海维地生物技术有限公司。

pCANTAB5E噬菌粒载体，购自上海科雷生物有限公司。

M13K07 helper phage,购自英国NEB。

GXL DNA Polymerase，购自日本Takara。

Benzonase，50x TAE buffer，DEPC-treated Water，琼脂糖，5000bp DNA marker，YeaRed Nucleic Acid Gel Stain，

Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis SuperMixComponent，牛血清白蛋白，氯化钠，TMB显色液，脱脂奶粉，来自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。

本发明主要培养基和缓冲液配方：

2×YT液体培养基：蛋白胨16g/L，酵母粉提取物10g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4，定容至1L，121℃高温高压灭菌20min。

2×YT-A液体培养基：含50mg/L氨苄青霉素(AMP)的2×YT培养基。

SOB液体培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉提取物5g/L，氯化钠0.5g/L,氯化钾0.185g/L, 氯化镁0.95g/L,pH7.2-7.4,超纯水定容至1L，121℃高温高压灭菌20min。

2×YT-AK液体培养基：含50mg/L氨苄青霉素(AMP)和50mg/L卡那霉素(Kan)的2×YT 培养基。

2×YT固体培养基：每100ml液体2×YT培养基中加入1.5g琼脂粉，121℃高温高压灭菌20min。

2×YT-A固体培养基：含100mg/ml氨苄青霉素(AMP)的2×YT培养基。

2×YT-K固体培养基：含50mg/ml卡那霉素(Kan)的2×YT培养基。

50％甘油保种液：准确量取25ml丙三醇，超纯水定容至25ml，混匀121℃高温高压灭菌20min。

氨苄青霉素母液/卡那霉素母液(50mg/ml),准确称量0.5g AMP/Kan固体粉末溶于10ml 超纯水中，充分溶解后使用0.22μM滤膜过滤除菌，分装1.5ml灭菌EP管中，-20℃保存备用。

PEG/NaCl：电子天平称量NaCl 146.1g/L,PEG8000称量200g/L,800ml超纯水定容至1L, 121℃高温高压灭菌20min。

PBST缓冲液：将20×的PBS稀释至1×，1L 1×PBS溶液加入1ml Tween-20,混匀121℃高温高压灭菌20min。

琼脂糖凝胶：1.2％的凝胶称量0.36g琼脂糖于30ml 1×TAE核酸电泳缓冲液中，煮沸至完全溶解，待冷却至50℃左右，加入3μl核酸染色水溶液，充分混匀，导入制胶模具中，室温冷却凝固后，放于电泳槽中进行电泳。

实施例1噬菌体展示抗体库的构建

1.1动物免疫和脾细胞总RNA的提取

Benzonase免疫2-2.5kg的新西兰大白兔，每两周皮下免疫一次，初次免疫用弗式完全佐剂乳化Benzonase，免疫剂量为1mg蛋白，加强免疫用非完全佐剂乳化，免疫剂量为0.5mg 蛋白。免疫2月后，用0.5mg的蛋白皮下冲击免疫。冲击免疫三天后，取脾脏组织块30-50mg。按照超纯RNA提取试剂盒(DNase I)的步骤提取总RNA。在液氮中充分研磨后加入1mlTRIzon Reagent，或在脾脏组织中加入1ml TRIzon Reagent后匀浆处理。样品中加入TRIzon Reagent后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5min，使蛋白核酸复合物完全分离。以每1ml TRIzon Reagent加入200μl三氯甲烷的比例加入三氯甲烷，盖好管盖，剧烈振荡15 s，室温放置2min。4℃12,000rpm(～13,400×g)离心10min，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free 离心管(自备)中。

在得到的水相溶液中加入等体积的70％乙醇(无RNase水配制),约600μl-700μl，颠倒混匀。将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。配制DNase I混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1U/μl)，混匀，配制成终体积为80μl的反应液。向吸附柱中直接加入80μl DNase I混合液，20-30℃孵育15min。向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。12,000rpm离心2min，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温 3min，彻底晾干。将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50 μl RNase-Free Water，室温放置2min，12,000rpm离心1min，收集RNA溶液，取1μl样品跑电泳检测提取效果，结果如图1，其余的RNA样品于-80℃冰箱保存待用。

1.2 scFv基因克隆及拼接

本发明采用翌圣生物公司的逆转录试剂盒，以提取兔源脾脏细胞RNA为模板按照表1-1 所示逆转录反应体系，加入RNA模板，RNase free Water,

ⅢSuperMix,25℃5min, 55℃孵育反转录15min，85℃加热5min反应得到cDNA。表1-2引物由上海生工合成。轻链可变区基因和重链可变区基因都以兔源cDNA为模板，轻链上游引物和下游引物两两混合进行PCR，重链上游引物和下游引物两两混合进行PCR，具体混合方式为：重链：VH-F1与 VH-R混合进行PCR，VH-F2与VH-R混合进行PCR，VH-F3与VH-R混合进行PCR，VH-F4 与VH-R混合进行PCR；轻链：轻链VL-F1与VL-R1混合进行PCR，VL-F1与VL-R2混合进行PCR，VL-F1与VL-R3混合进行PCR，VL-F2与VL-R1混合进行PCR，VL-F2与VL-R3 混合进行PCR，VLlamda-F与VLlamda-R混合进行PCR；PCR反应添加成分如表1-3，并按照表1-4反应体条件进行PCR反应。对获得的轻链VLK和重链VH的PCR产物上样于1.2％琼脂糖凝胶中，电泳观察其扩增结果，结果如图2，使用OMEGA公司胶回收试剂盒按照试剂盒实验步骤回收，回收产物-20℃保存。

将上一步回收的重链和轻链基因等摩尔混合作为模板，使用相对应的重链VH上游引物和轻链下游引物进行PCR，拼接成为scFv。PCR反应体系如表1-5，反应条件同表1-4中VH基因扩增条件。反应结束后上样进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3，胶回收。

表1-1逆转录反应体系

表1-2所用引物

表1-3 PCR反应体系

表1-4 PCR扩增条件

目的片段	变性	退火	延伸	反应结束	循环次数
						VL	98℃10s	55℃15s	68℃42s	4℃	30
VH	98℃10s	60℃15s	68℃42s	4℃	30

表1-5 PCR反应体系

组分	使用量
		Prime STAR GXL Premix(2×)	25μl
引物F(10μM)	1μl
		引物R(10μM)	1μl
Template(VH+VL)	2μl
		灭菌水	21μl
Total	50μl

1.3构建pCANTAB5E-scFv重组质粒

pCANTAB5E转化DH5α扩增，大提制备质粒。按照英国NEB公司双酶切体系，对pCANTAB5E质粒和scFv片段分别进行Sfi1和Not1酶切处理，酶切反应如下表1-6所示。37℃水浴中酶切1h后，加入2μl Sfi1，充分混匀，放置50℃水浴锅中，继续酶切1h。酶切结束后经1.2％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，结果如图4，使用OMEGA公司胶回收试剂盒回收产物。使用NEB公司电转专用连接酶，将酶切处理的scFv基因片段scFv(S+N)和质粒pCANTAB5E(S+N)，在低温环境下按表1-7中连接反应体系，4℃连接过夜。

表1-6酶切反应体系

表1-7酶连体系

反应组分	体积
		10×Ligase buffer	2μl
pCANTAB5E(S+N)	100ng
		scFV(S+N)	50ng
灭菌水	补至20μl

1.4连接产物转化感受态TG1和库容及重组率测定

取TG1感受态细胞放置冰上融化后，加入1μl pCANTAB5E-scFv连接产物后轻轻混匀，沿管壁加入冰浴的电转杯中，放置5-10min后置于电转仪中，设置电压2.0kv，点击恒压时间5.0ms左右，电转化后立即加入1ml预热的SOB液体培养基，经37℃摇床震荡复苏培养1h。本次实验转化平行操作20管，每1μl电转一次，共转化20次，共获得20ml转化后感受态细胞。

转化复苏培养之后的菌液混合后取出100μl，10倍梯度稀释法进行稀释后取100μl涂在 2×YT-A(含50mg/ml AMP)平板，37℃恒温培养箱倒置过夜计算库容，连接产物转化结果如图5。次日，取稀释平板中单菌落分散良好的平板挑取26个单菌落于2×YT-A(含50mg/ml AMP)液体培养基中，37℃，200rpm/min震荡培养过夜。26个扩大培养的单菌落各取1μl菌液作为模板，按照scFv基因拼接PCR体系进行菌液PCR，PCR产物跑电泳后于凝胶成像仪中分析结果，计算抗体库的重组率，PCR鉴定结果如图6。

计算公式：库容＝单菌落数量×稀释倍数×总体积(公式1-1)

重组率(％)＝阳性克隆/挑取单克隆个数(公式1-2)。

1.5噬菌体scFv抗体库的构建

1.5.1辅助噬菌体毒种制备

取过夜培养的TG1菌液按照1:100的比例接种于5ml SOB培养基中,37℃，200rpm/min 震荡培养到OD600达0.4-0.6后加入5μl的M13k07 helper phage，37℃，200rpm/min震荡培养1h后再加入5μl卡那霉素(50mg/ml),37℃，200rpm/min摇床培养1h。将培养好的菌液转接到100ml 2×YT液体培养基，加入卡那霉素(50mg/ml)至终浓度50μg/ml，37℃，200rpm/min过夜培养。次日，将过夜培养的菌液分装到50ml离心管中，4℃，10000rpm/min,离心20min,将上清转移至高温灭菌的500ml锥形瓶，加入为初始菌液1/5体积PEG/NaCl，本次操作加入体积为20ml,混匀之后分装到新的50ml离心管，冰上沉析2h后4℃，10000 rpm/min,离心10min弃掉上清，用2ml(1/50体积)的1×PBS重悬沉淀，转移至无菌离心管中，再次10000rpm/min,4℃,离心5min小心取上清，用0.22μM滤膜过滤除菌，加入最终浓度50％甘油，分装到无菌离心管中，-20℃保存。

1.5.2辅助噬菌体毒种滴定

将制备好的噬菌体液用1％BSA(in 1×PBS)作稀释液进行10倍梯度稀释，取稀释倍数 10^-4，10^-6，10^-8，10^-10，10^-12的菌液10μl至OD600达0.4-0.6的TG1中，将稀释液和TG1 作为阴性对照，37℃静置30min,摇床培养30min；培养结束后将上述5个稀释梯度的菌液和两个阴性对照涂在卡那霉素(含50mg/ml)的平板上，37℃过液培养。次日，计算平板上的克隆数，按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu/ml),一般要达到10¹²才可以后续实验。计算公式：噬菌体滴度＝单克隆数×稀释倍数×10(公式1-3)。

1.5.3初级噬菌体抗体库的构建

取转化保存的剩余培养物10ml加入到90ml 2×YT-A(25μg/ml AMP)培养基中37℃、 200rpm摇床培养1h，加入AMP至终浓度50μg/ml，继续培养1h。按照感染复数moi＝20:1加入辅助噬菌体M13K07 10μl于上述培养物中，先于37℃、60rpm轻摇30min利于噬菌体侵染，再放置摇床震荡培养30min。将培养液在无菌超净台内转移至灭菌的离心管中，5000rpm离心15min，小心去上清。无菌条件下用100ml 2×YT-AK(50mg/ml AMP和50mg/ml Kan)培养基重悬细菌沉淀，震荡培养过夜。次日，将过夜的菌液全部转入无菌50ml离心管中，10000rpm 4℃离心20min。

将上清转移至新的无菌锥型瓶中，加入为初始菌液1/5体积的PEG-NaCl(20ml),冰上静置1h沉析。10000rpm、4℃离心20min后去除上清，离心管倒扣2-5min，尽可能去除多余液体。用1/50起始菌液体积的1％BSA(in 1×PBS)重悬沉淀，转至1.5ml无菌管，10000 rpm离心5min，去除沉淀，上清转移至新的1.5ml无菌管，上清即为初级抗体库，加甘油至50％于-20℃保存。测定重组噬菌体的滴度，方法同1.5.2。

1.6免疫管淘选特异性的抗体

根据所需浓度取适量抗原用1×PBS稀释至2ml，混匀后包被于免疫管，37、1h(或4℃过夜)，用0.1％PBST洗涤，静置3min后甩干，重复三次，用2ml封闭液封闭，37℃、1h (或4℃过夜)，用0.1％PBST洗涤，静置3min后甩干，重复三次，于4℃放置。添加合适的噬菌体库投入量，用2.5％BSA(in 0.05％PBST)稀释至2ml，混匀后37℃、2h，孵育完成后留取少量上清待做滴度。洗脱：用2ml pH 2.2Gly-HCl，37℃静置10min后，用枪头用力吹打3min后收集，收集管内加入1/10体积pH 8.5Tris-HCl中和pH，再加入5％BSA(in 1×PBS)稀释至终浓度为1％。

洗脱产物扩增：取1ml洗脱产物加入4ml(OD600:0.4-0.6)TG1菌液中，37℃、60rpm培养30min，调整转速为200rpm再培养30min；加入M13K07辅助噬菌体10μl，37℃、 60rpm培养30min，调整转速为200rpm再培养30min。菌液10000rpm、4℃离心20min，用100ml 2×YT(含100μg/ml AMP+50μg/ml Kana)培养基重悬沉淀，过夜震荡培养。第二天将菌液于10000rpm、4℃离心20min，上清液体转移至新的离心管，加入1/5体积PEG-NaCl (20ml)，冰上静置1h沉析后10000rpm、4℃离心20min后去除上清，离心管倒扣2-5min，尽可能去除多余液体；用1/50起始菌液体积的1％BSA(in 1×PBS)重悬沉淀，转至1.5ml EP 管，10000rpm离心5min，去除沉淀，上清即为扩增富集产物，立即进行新一轮淘选。逐渐提高每轮淘选严苛程度，洗脱产物与扩增的滴度均有增加趋势，代表真正具有亲和力的噬菌体得到富集。

表1-8 5轮筛选条件

表1-9 5轮筛选结果

1.7 phage-ELISA检测噬菌体抗体

从洗脱产物侵染TG1的平板上挑取单克隆过夜培养，第二天将菌液稀释50-100倍至 OD600:0.1左右，摇至OD600:0.4-0.6后加1μl稀释十倍的M13K07，于37℃、60rpm培养30min，后调整转速为200rpm再培养30min。将菌液于10000rpm、4℃离心20min，去上清。沉淀用4ml 2×YT(含100μg/ml AMP+50μg/ml Kana)培养基重悬，过夜震荡培养。第二天将菌液于10000rpm、4℃离心20min，取上清留作ELISA检测。

抗原包被浓度为1μg/ml，每孔100μl，37、1h(或4℃过夜)，用0.1％PBST洗涤，静置1min后甩干，重复三次，封闭液封闭，每孔200μl，37℃、1h(或4℃过夜)，用0.1％PBST 洗涤，静置1min后甩后拍干，重复2次，于4℃放置。另外直接用封闭液包被封闭做对照，每孔200μl，37℃、2h(或4℃过夜)，用0.1％PBST洗涤，静置1min后甩后拍干，重复2 次，于4℃放置。于超净台依次加样，每孔100μl，37℃孵育1h，倒掉液体拍干，用0.1％PBST 洗涤，静置1min，甩后拍干，重复5次。加稀释5000倍后的HRP-亲和素，每孔100μl，37℃孵育1h，倒掉液体拍干用0.1％PBST洗涤，静置1min，甩后拍干，重复5次。加TMB显色液，每孔100μl，37℃显色。1M HCl作为终止液，每孔50μl，显色后终止读取OD450，样品OD450与只有封闭液作为对照OD450相差一倍以上即为阳性克隆。

1.8 scFv大肠杆菌表达和ELISA鉴定

对阳性噬菌体克隆感染的TG1摇菌抽提治理，送测序。获得scFv基因序列后使用NCBI BLAST中的Immunoglobulin BLAST和Nucleotide.nucleotide BLAST分析软件，分析出 CDR1，CDR2，CDR3区域。根据scFv测序结果，构建pET-Duet1-scFv表达载体。引物设计序列如下表。以阳性克隆提取的质粒为模板，PCR扩增得到scFv片段，PCR扩增获得 pET-Duet1的片段，一步克隆法构建PET-Duet1-scFv，菌落PCR鉴定阳性后，抽提质粒，测序验证构建正确。

将构建好的PET-Duet1-scFv质粒转化Rosseta(DE3)中，挑单克隆扩增到1L，OD600为0.6-0.8时加入IPTG终浓度0.2mM 16℃过夜诱导表达。诱导结束后对菌液进行离心，去上清，每1L菌液得到的菌体加入50ml PBS重悬，冰浴用匀浆破菌仪破菌5min后，导入离心管，12000rpm/min，4℃离心30min，上清转入新的离心管。用镍柱亲和纯化菌裂解液上清。1ml的镍亲和介质与上清4℃孵育1小时后，装入重力层析柱，流穿过后，用20ml的含 30mM咪唑的PBS洗涤，用250mM咪唑的PBS洗脱，对洗脱产物用10kD的浓缩管浓缩。 Nanodrop OD280测蛋白浓度，scFv1，scFv2，scFv3，scFv4，scFv5，scFv6的量费别为0.72mg， 0.061mg，0.13mg，0.92mg，0.47mg，0.055mg。scFv1的纯化结果如图7。将scFv稀释到 1μg/ml后二倍梯度稀释，Benzonase包板，BSA封闭，对scFv稀释样本进行检测，二抗使用 HRP标记的抗flag-tag抗体，BSA包被和封闭作对照。ELISA结果如下表所示，6个scFv均与Benzonase结合，与BSA对照不结合。

表1-10 ELISA结果

1.9 6株scFv大肠杆菌表达抗体配对形成免疫试剂盒

从表达鉴定成功的的6株scFv抗体中，选择scFv1，scFv4，scFv5抗体标记生物素，其余三株scFv抗体与标记生物素抗体进行随机配对，采用双抗体夹心ELISA检测Benzonase。各取scFv1，scFv4，scFv5抗体0.5mg，溶解在pH 7.4的0.01M PBS缓冲液中。(Tris或其他含胺缓冲液中的蛋白质必须转换成合适的缓冲液)，在蛋白溶液中加入适量的10mm生物素试剂溶液(2.0mg NHS-Biotin试剂溶解在590μl二甲基亚砜(DMSO)的溶剂中)，在室温下孵育 30分钟，scFv抗体标记完成，之后通过透析纯化所标记的蛋白质以获得最佳的性能和稳定性，可以通过ELISA对标记的蛋白质进行初步测试确定了标记抗体的适当功能和标记，ELISA对标记的scFv抗体进行初步配对测试步骤及结果如下：

将scFv2，scFv3，scFv6稀释到8μg/ml后二倍梯度稀释包板4°过夜，BSA封闭，对Benzonase样本进行检测，同时加入PBS作为空白对照，检测抗体(标记完成的scFv抗体) 对应分别为scFv1，scFv4，scFv5稀释到16μg/ml使用浓度后二倍梯度进行检测，二抗使用 HRP标记的抗生物素的链霉素。ELISA结果如下表1-11所示，相互配对的6个scFv中，包被scFv2抗体配对scFv1抗体标记生物素作为检测抗体、包被scFv3抗体配对scFv4抗体标记生物素作为检测抗体结果符合使用预期，空白对照良好，继续调试确认灵敏度。包被scFv6 抗体配对scFv5抗体标记生物素作为检测抗体本底较高，排除该配对抗体方案。

表1-11 ELISA结果

根据上步实验选择最适包被抗体和检测抗体的工作浓度，继续调试实验在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，设置不同浓度的标准品梯度，并通过双抗夹心ELISA法检测反应值，确定试剂盒最高灵敏度，实验结果如表1-12所示，包被scFv2抗体配对scFv1 抗体标记生物素作为检测抗体灵敏度最高，可达到4pg/ml。本次实验每一个标准品浓度设置 3个复孔，表中OD450为平均值,具体实验步骤如下：

包被：用包被液(0.05M NaHCO₃，pH9.6)将scFv2，scFv3抗体稀释至最适工作浓度，100ul/孔，4℃包被过夜。除去包被液，用PBST溶液洗涤3次。

封闭：除去包被液，PBS溶液洗涤3次。每孔加入0.3ml封闭液(5％BSA+PBS)于37℃保温2小时。

标准品加样：将Benzonase样品稀释至9ng/ml、6ng/ml、3ng/ml、1.5ng/ml、0.5ng/ml、0.1ng/ml、0.037ng/ml、0.012ng/ml、0.004ng/ml，稀释缓冲液为含2％BSA的PBS，各孔加入100ul稀释样品，单加稀释缓冲液的孔作为阴性对照。于37℃保温1小时，除去样品溶液，PBS溶液洗涤两次。

生物素标记scFv4、scFv5检测抗体加样：每孔加入最适浓度的生物素标记抗体100ul,37℃保温0.5h后除去生物素标记抗体，PBST溶液洗涤3次。

标记物HRP偶联链霉素加样：每孔加入用稀释缓冲液以1：5000稀释的HRP偶联的抗生物素的蛋白100μl，37℃保温0.5h后除去酶标液，PBS溶液洗涤3次。

比色及结果计算：每孔中加入100μl TMB显色液，室温避光作用15分钟后加2MH₂SO₄ 0.05ml终止液终止反应，并用酶标比色仪测定OD450值。

表1-12

根据前两步实验，选择最高灵敏度包被抗体scFv2和生物素标记scFv1检测抗体搭配，以及他们所能检测的标准品浓度范围，在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，设置七个不同浓度的标准品梯度。每个浓度作三个平行样，以尽可能减少实验操作误差的干扰。按照上述实验所述的方法在同一块板条上ELISA检测检测反应值，并以此绘制标准曲线。标准品浓度及对应的反应值如表1-13所示。

表1-13标准曲线数据

由表数据，分析发现，数据具有明显的梯度，复孔之间差异很小，可以满足ELISA的实验需求。利用用线性拟合法绘制标准曲线，如图8所示。由图8可知，标准曲线R²为0.9991，可信度较高。

序列表

<110> 翌圣生物科技（上海）股份有限公司

<120> Benzonase免疫噬菌体展示抗体库的构建方法、单克隆抗体、编码基因和试剂盒

<141> 2022-03-17

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> Artifical Sequence

<400> 1

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro Leu

1 5 10 15

Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Trp Met

20 25 30

Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val

35 40 45

Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg

50 55 60

Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr Ser

65 70 75 80

Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Ser Ser

85 90 95

Asp Trp Asn Ala Tyr Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile

100 105 110

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Gly

130 135 140

Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

165 170 175

Ile Tyr Gln Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

180 185 190

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln

195 200 205

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Trp Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Thr Asp Ala Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Leu Gly

225 230 235 240

Arg Ser Gly Pro

<210> 2

<211> 244

<212> PRT

<213> Artifical Sequence

<400> 2

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asn Trp Gly Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly His

100 105 110

Gly His Arg Leu Leu Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala

130 135 140

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser

165 170 175

Gly Ala Ser Pro Lys Pro Leu Ile His Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser

180 185 190

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

225 230 235 240

Glu Ile Lys Arg

<210> 3

<211> 241

<212> PRT

<213> Artifical Sequence

<400> 3

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro Leu

1 5 10 15

Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ala Leu Ser Gly Tyr Tyr Met

20 25 30

Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ile

35 40 45

Thr His Pro Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly Arg

50 55 60

Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Thr Thr Val Asp Leu Arg Ile Thr Ser

65 70 75 80

Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Val Trp Thr

85 90 95

His Tyr Ser Ser Gly Gly Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val

130 135 140

Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Lys

145 150 155 160

Asn Asn Asp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

165 170 175

Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg

180 185 190

Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly

195 200 205

Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser

210 215 220

Gly Asp Asn Val Val Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val

225 230 235 240

Lys

<210> 4

<211> 244

<212> PRT

<213> Artifical Sequence

<400> 4

Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ala Ser Leu

1 5 10 15

Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asn Tyr Trp

20 25 30

Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Cys Ile Tyr Thr Gly Thr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Glu Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu

65 70 75 80

Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ser

85 90 95

Lys Asn Thr Tyr Gly Tyr Ala Leu Ala Ala Arg Leu Asp Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser

130 135 140

Val Glu Val Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser

145 150 155 160

Gln Ser Ile Gly Ser Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln

165 170 175

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ala

180 185 190

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr

195 200 205

Ile Thr Asp Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly

210 215 220

Asp Tyr Ser Ser Gly Asn Asp Asn Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val

225 230 235 240

Val Val Lys Ala

<210> 5

<211> 241

<212> PRT

<213> Artifical Sequence

<400> 5

Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro Gly Gly Thr Leu

1 5 10 15

Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Trp Met

20 25 30

Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ile

35 40 45

Ile Ser Asn Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg

50 55 60

Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Arg Ile Thr Ser

65 70 75 80

Pro Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Phe Ala

85 90 95

Gly Val Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

115 120 125

Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly Gly Thr Val

130 135 140

Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Lys Asn Leu

145 150 155 160

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr

165 170 175

Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser

180 185 190

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala

195 200 205

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Asp Thr Asn Val Gln

210 215 220

Asn Leu Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Ala Ala Ala Gly

225 230 235 240

Ala

<210> 6

<211> 243

<212> PRT

<213> Artifical Sequence

<400> 6

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu

1 5 10 15

Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr Trp Met

20 25 30

Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys

35 40 45

Ile Asp Thr Gly Ser Ser Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ala Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln

65 70 75 80

Met Thr Ser Val Thr Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg

85 90 95

His Leu Arg Tyr Ser Thr Asn Asn Asn Asp Trp Asp Leu Trp Gly Pro

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val

130 135 140

Glu Ala Ala Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln

145 150 155 160

Ser Ile Tyr Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

165 170 175

Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Gly Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Ala

210 215 220

Tyr Ser Thr Tyr Gly Asp Asn Gly Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val

225 230 235 240

Val Lys Ala

<210> 7

<211> 732

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 7

cagctggtgg agtccggagg aggcctggta acgcctggga cacccctgac actcacctgc 60

acagcctctg gattctccct cagtagctac tggatgagct gggtccgcca ggctccaggg 120

aaggggctgg aatggatcgg ggtcattagt agtagtggta gcacggacta cgcgagctgg 180

gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa aatcaccagt 240

ctgacaaccg aggacacggc catctatttc tgtgccagat atagtagtga ctggaatgcc 300

tatgatttgt ggggccaagg caccctggtc actatctcct caggaggtgg aggttctgga 360

ggaggtggta gtggtggtgg aggatctgtg ctgacccaga ctccatcccc cgtgtctgcg 420

gctgttggag gcacagtcac catcagttgc caggccagtc agagtgttta tggtaacaac 480

tatttatcct ggtttcaaca gaaaccaggg cagcctccca agctcctgat ctaccaggca 540

tccactctgg catctggggt cccatcgcgg ttcagcggca gtggatctgg gacacagttc 600

tctctcacca tcagcggcgt gcagtgtgac gatgctgcca cttactactg tgcaggatgg 660

agtggtagtg gtactgatgc tgttgctttc ggcggaggga ccgagctgga gatcctaggc 720

cgatctggcc cg 732

<210> 8

<211> 732

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 8

caggtgaagc tgcagcagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60

acatgcaccg tctcagggtt ttcattaacc agctatggtg tacactgggt tcgccagcct 120

ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatgggctg gtggaagcac aaactataat 180

tcagctctca aatccagact gaacatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctccaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag aaactggggc 300

agctactggt acttcgatgt ctggggccaa ggccacggtc accgtctcct cagtggaggc 360

ggttcaggcg gaggtggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggacat tgagctcacc 420

cagtctccag caatcatgtc tgcatctcca ggggaaaagg tcaccatgac ctgcagggcc 480

agctcaagta taagttccag ttacttgcac tggtaccagc agaagtcagg cgcttccccc 540

aaacccttga ttcataggac atccaacctg gcttctggag tcccagctcg cttcagtggc 600

agtgggtctg ggacctctta ctctctcaca atcagcagcg tggaggctga agatgatgca 660

acttattact gccagcagtg gagtggttac ccattcacgt tcggtgctgg gaccaagctc 720

gagatcaaac gg 732

<210> 9

<211> 723

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 9

cagctggtgg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 60

acagcctctg gattcgccct cagtggctac tacatgacct gggtccgcca ggctccaggg 120

aaggggctgg aatggatcgg gatcacacat cctagtggta gcacatacta cgcgagctgg 180

gtgaaaggcc gattcaccat ctccaaggcc tcgaccacgg tggatctgag aatcaccagt 240

ccgacaaccg aggacacggc cacctatttc tgtgccagag tatggactca ttatagtagt 300

ggtggtgggg acttgtgggg cccaggcacc ctggtcacca tctcttcagg aggtggaggt 360

tctggaggag gtggtagtgg tggtggagga tctgatctga cccagactcc atcctccgtg 420

tctgcagctg tgggaggcac agtcaccatc aattgccagt ccagtgagag tgtttataag 480

aacaacgact tatcctggta tcagcagaaa ccagggcagc ctcccaagct cctaatcagt 540

gctgcatcca ctctggcatc tggggtccca tcccggttca aaggcagtgg atctgggaca 600

cagttcactc tcaccatcag cggcgtgcag tgtgacgatg ctgccactta ctactgtcaa 660

cagggttata gtggtgataa tgttgtgaat actttcggcg gagggaccga ggtggtggtc 720

aaa 723

<210> 10

<211> 732

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 10

cagctgatgg agtccggggg aggcctggtc cagcctgggg catccctgac actcacctgc 60

acagcctctg gattctcctt cagtagcaac tactggatat gctgggtccg ccaggctcca 120

gggaaggggc tggagtggat cggatgcatt tatactggta ctagtggtac cacttactac 180

gcgagctggg cgaaaggccg attcaccatc tccgaaacct cgtcgaccac ggtgactctg 240

caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccacctatt tctgttcaaa gaatacttat 300

ggttatgctt tggctgctcg gttggatctc tggggccagg gcaccctggt caccatctct 360

tcaggaggtg gaggttctgg aggaggtggt agtggtggtg gaggatctga tatgacccag 420

actccagcct ctgtggaggt agctgtggga ggcacagtca ccatcaagtg ccaggccagt 480

cagagcattg gtagtgactt agcctggtat cagcagaaac taggccagcc tcccaaactc 540

ctgatctatt atgcatccac tctggaatct ggggccccag cgcggttcag cggcagtgga 600

tctgggacag agtacactct caccatcacc gacgtgcagt gtgacgatgc tgccacttac 660

tactgtgcag gcgattatag tagtggtaat gataatggtt tcggcggagg gaccgaggtg 720

gtggtcaaag cg 732

<210> 11

<211> 723

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 11

cagctgatgg agtccggagg aggcctggta acgcctggag gaaccctgac actcacctgc 60

acagcctctg gattctccct cagtaactac tggatgagct gggtccgcca ggctccaggg 120

aaggggctgg aatggatcgg catcattagt aattatggta gtacatatta cgcgagctgg 180

gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgag aatcaccagt 240

ccgacaatcg aggacacggc cacctatttc tgtgccagag aatttgctgg tgtctttaac 300

ttgtggggcc caggcaccct ggtcaccgtc tcctcaggag gtggaggttc tggaggaggt 360

ggtagtggtg gtggaggatc tgatatgacc cagactccag cctccgtgtc tgaacctgtg 420

ggaggcacag tcaccatcaa ctgccaggcc agtcagagtg tttataataa caaaaattta 480

gcctggtatc agcagaaacc ggggcagcct cccaaggtcc tgatctacaa ggcatccact 540

ctggcatctg gggtctcatc gcggttcaaa ggcagtggat ctgggacaga gttcactctc 600

accatcagcg acctggagtg tgccgatgct gccacttact actgtcaaca gggtcatgat 660

accaacgtcc aaaatctttt cggcggaggg accgaggtgg tcgtcaaagc ggccgcaggt 720

gcg 723

<210> 12

<211> 729

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 12

cagctggtgg agtccggggg agacctggtc aagcctgggg catccctgac actcacctgc 60

acagcctctg gattcaccct cagtagctac tggatgtgct gggtccgcca ggctccaggg 120

aaggggctgg agtggatcgg atgcattgat actggtagta gtgatagcac ttactacgcg 180

aactgggcga aaggccgatt caccatctcc aaagcctcgt cgaccacggt gactctgcaa 240

atgaccagtg tgacacccgc ggacacggcc acctatttct gtgcgagaca tctccgatat 300

agtactaata ataatgattg ggacttgtgg ggcccaggca ccctggtcac cgtctcctca 360

ggaggtggag gttctggagg aggtggtagt ggtggtggag gatctgatct gacccagact 420

ccagcctccg tggaggcagc tgtgggagac acagtcacca tcaagtgcca ggccagtcag 480

agcatttaca actacttagc ctggtatcag cagaaaccag ggcagcctcc caaggtcctg 540

atctatgctg catccaatct ggcatctggg gtcccatcgc ggttcagcgg cagtggatct 600

gggacacagt tcactctcac catcagcggc gtgcagtgtg acgatgctgc cacttactac 660

tgtgcaggcg cttatagtac gtatggtgat aatggtttcg gcggagggac cgaggtggtg 720

gtcaaagcg 729

Claims

1.一种Benzonase免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征在于其步骤包括：

(4)特异性富集噬菌体单链抗体库，从中筛选出阳性克隆。

2.权利要求1所述的Benzonase免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征为：步骤(2)中PCR技术使用的引物如下：

3.根据权利要求2所述的Benzonase免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征为：步骤(2)中重链VH上游引物和下游引物两两混合以步骤(1)的cDNA为模板进行PCR，轻链VLK上游引物和下游引物两两混合以步骤(1)的cDNA为模板进行PCR，轻链VLlamda-F和VLlamade-R引物混合以步骤(1)的cDNA为模板进行PCR，将获得的轻链VL和重链VH的PCR产物回收并等摩尔混合作为模板，使用引物表中相对应的重链上游引物和轻链下游引物进行PCR。

4.根据权利要求3所述的原核表达载体，其特征在于：步骤(4)中特异性富集噬菌体单链抗体库具体指取抗原用PBS，混匀后包被于免疫管，用封闭液，添加噬菌体单链抗体库，加入BSA溶液孵育；

洗脱：加入pH 2.2Gly-HCl，静置后，用枪头用力吹打后收集，收集管内加入pH8.5Tris-HCl中和pH，再加入BSA溶液稀释；

5.一种Benzonase单克隆抗体scFv，其特征在于其序列为SEQ ID No.1～6中任一所述。

6.一种Benzonase单克隆抗体scFv编码基因，其特征在于其序列为SEQ ID No.7～12中任一所述。

7.一种Benzonase检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求5所述的Benzonase单克隆抗体scFv。

8.根据权利要求7所述的Benzonase检测试剂盒，其特征在于：含有序列如SEQ ID No.2所示的抗体作为包被抗体，还含有标记生物素的序列如SEQ ID No.1所示的抗体。