CN115120600A - 薯蓣皂苷元及其类似物在制备预防或治疗糖尿病药物中的应用 - Google Patents
薯蓣皂苷元及其类似物在制备预防或治疗糖尿病药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种薯蓣皂苷元及其类似物在制备预防或治疗糖尿病药物中的应用，属于生物医学技术领域。为了提供使用小分子化合物用于治疗或预防糖尿病药物开发方法。本发明提供一种薯蓣皂苷元及其类似物在制备预防或治疗糖尿病药物中的应用。该应用可用于制备人工胰岛系统移植治疗糖尿病。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及薯蓣皂苷元及其类似物在制备预防或治疗糖尿病药物中的 应用。
背景技术
糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一类以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，包括Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖 尿病。I型糖尿病(T1DM)是由于胰岛β细胞受到破坏，胰岛素分泌的绝对不足而引起的一种糖尿病； II型糖尿病(T2DM)是由于胰岛β细胞功能失调造成胰岛素分泌的相对不足或胰岛素靶器官发生胰岛素 抵抗而引起的糖尿病，其会导致持续的高水平血糖，对病人心脏、肾脏和神经器官组织产生普遍性损伤， 进而引起多种并发症。据国际糖尿病联盟(IDF)的最新报告，2019年全球约4.63亿糖尿病患者(11个 人中有1个为糖尿病患者)；预计到2030年，糖尿病患者会达到5.784亿。
目前，已存在的治疗糖尿病的药物主要有胰岛素及其类似物、磺酰脲类、双胍类、噻唑烷二酮类等， 这类化学药物虽然降糖作用迅速，但其存在使用不方便、疗效低或毒性大等问题。胰岛移植可以有效降 低血糖，治疗一型或严重的二型糖尿病。然而胰腺供体严重不足，极大限制了胰岛移植治疗糖尿病疗法 的应用。胚胎干细胞和诱导多能干细胞是多能细胞，可以离体分化为多种细胞类型，包括胰岛的所有细 胞类型。目前通过细胞移植技术治疗糖尿病主要利用胚胎干细胞(ES)或诱导多能干细胞(iPS)，通过 七步法、九步法或更多步骤逐级诱导，每步添加多种细胞因子或小分子化合物，最后产生β细胞，此方 案耗时长，诱导方案复杂，添加的外源因子多，对细胞影响大。并且ES和iPS均为多能干细胞，在诱导 过程中如部分细胞不能充分分化，移植到病人体内有致瘤性风险。
成体胰腺导管和胆管在发育上有同源性，两种导管上皮细胞中都被认为存在导管祖细胞。通过显微 手术获得人总胆管上皮，或通过捐赠者来源的胰腺导管、肝内和肝外胆管上皮，通过离体二维或三维培 养可以获得大量导管和胆管上皮细胞，然而，目前没有有效办法使其向胰岛内分泌细胞高效分化。
相较于二甲双胍、胰岛素等西药治疗糖尿病以快速降糖为目标，中药治疗运用补脾气、滋脾阴、通 脾络等治法，具有作用温和持久、可延缓并发症等优点。中药扶正祛邪，促进胰岛再生，对改善机体代 谢有良好功效，在糖尿病治疗上有治本效果。近年来，利用中药提取物治疗糖尿病及并发症均有临床报 道。而其中具体促进β细胞再生的成分还不清楚。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种薯蓣皂苷元及其类似物在制备预防或治疗糖尿病药物中的应用。为了 提供使用小分子化合物用于治疗或预防糖尿病药物开发方法。
本发明提供一种式I所示化合物及其羟基化修饰、甲基化修饰、糖基化修饰、双键还原中一种或多 种，或上述化合物药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物作为活性成分在制备治疗和/或预防糖尿病的 药物中应用，
式I：
进一步地限定，式I所示化合物羟基/甲基化修饰：
进一步地限定，式I所示化合物糖基化修饰：
进一步地限定，式I所示化合物双键还原为：
进一步地限定，所述药物是促进胰岛素分泌细胞或β细胞产生的药物。
进一步地限定，式I所示化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物作为活性成分诱导肝内 胆管上皮、肝外胆管上皮、胰腺导管上皮、胃上皮、肠上皮细胞产生胰岛细胞。
进一步地限定，式I所示化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物作为活性成分诱导胰腺 祖细胞、胚胎干细胞、神经祖细胞、骨髓间充质干细胞、肝干细胞、脐带血细胞、血源子宫内膜干细胞、 牙髓间充质干细胞分化为胰岛β细胞。
进一步地限定，所述药物是促进胰岛素分泌细胞或胰岛β细胞分化的药物。
进一步地限定，所述药物是以式I所示化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物为活性成 分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物。
进一步地限定，所述的式I所示化合物及其羟基化修饰、甲基化修饰、糖基化修饰、双键还原中一 种或多种，或上述化合物药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物作为分化诱导剂在利用胰腺祖细胞制 备胰岛素分泌细胞或胰岛β细胞中的应用。
进一步地限定，所述的式I所示化合物及其羟基化修饰、甲基化修饰、糖基化修饰、双键还原中一 种或多种，或上述化合物药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物促进人胆管或胰腺导管产生胰岛素分 泌细胞或胰岛β细胞。
有益效果：本发明公开用于诱导肝内胆管上皮、肝外胆管上皮、胰腺导管上皮、胃上皮、肠上皮细 胞产生胰岛素分泌细胞或胰岛β细胞的薯蓣皂苷元及其类似物和方法。通过构建上皮类器官(epithelial organoids，EPOs)，经处理后，可以发现薯蓣皂苷元类似物，如重楼皂苷VI和薯蓣次皂苷A能够显著 促进EPOs的分化，其明显促进胰岛细胞相关基因的表达，这种促分化过程中观察到胰腺内分泌祖细胞标 志性基因ngn3的上调表达。分化后的细胞能响应葡萄糖刺激，改善糖尿病鼠血糖及葡萄糖耐量，具有成 熟β细胞的生理功能。
重楼皂苷VI和薯蓣次皂苷A不仅能够显著促进小鼠胆管类器官(Mousebileductorganoid，mBDOs) 胰岛素相关基因Insulin 2的表达。分化后的mBDOs在葡萄糖刺激下可检测到合成胰岛素标志物C肽的 分泌，证明其具有与成熟β细胞相同的葡萄糖刺激的生理响应。加入低于4μmol/L重楼皂苷VI或薯蓣次 皂苷A，类器官生长和细胞活性没有任何影响，证明其是一种安全、有效，具有很好应用潜能的活性分 子。同时，通过体内移植经重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A预处理的mBDOs或人胆管类器官(human extrahepatic bileduct organoid，hBDOs)实验，结果证明其具有缓解糖尿病鼠高血糖症状、改葡萄糖耐量 等体内活性作用。证明薯蓣皂苷元衍生物可促进Insulin2的表达，并且C3位的糖基化修饰的皂苷具有更 好的向β细胞分化效果，将分化细胞移植可以治疗糖尿病。
附图说明
图1为无Insulin+细胞的小鼠胆管类器官(mBDOs)的建立及鉴定。图1A为mBDOs第2代，第7 代细胞状态图；图1B为免疫染色鉴定结果。
图2为重楼皂苷VI和薯蓣次皂苷A的结构及细胞安全性检测结果图。图2A为重楼皂苷VI和薯蓣 次皂苷A的结构图；图2B为CCK8检测重楼皂苷VI和薯蓣次皂苷A的细胞毒性结构图。
图3为重楼皂苷VI和薯蓣次皂苷A体外有效促进mBDOs向胰腺胰岛细胞分化。图3A为加入重楼 皂苷培养后定量PCR图；图3B为加入薯蓣次皂苷A培养后荧光定量PCR结果图；图3C为加入重楼皂 苷培养14天后免疫荧光结果图；图3D为加入薯蓣次皂苷A培养14天后免疫荧光结果图；图3E为加入 重楼皂苷养mBDOs 14天后进行葡萄糖刺激，ELISA检测小鼠C肽和insulin分泌；图3F为加入薯蓣次 皂苷A培养mBDOs 14天后进行葡萄糖刺激，ELISA检测小鼠C肽和insulin分泌；
图4为经重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A诱导分化的mBDOs进行体内移植从而改善糖尿病。图4A为 移植经重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A处理的mBDOs到STZ诱导糖尿病小鼠肾包囊后血糖的变化图；图 4B为移植经重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A处理的mBDOs 8周后小鼠葡萄糖耐量变化；图4C为葡萄糖刺 激前后移植小鼠血清中Insulin水平的变化。
图5为重楼皂苷VI和薯蓣次皂苷A体外促进mPDOs向胰腺细胞分化结果。荧光定量PCR检测β细 胞标志基因Isulin2结果如图所示。
图6为重楼皂苷VI和薯蓣次皂苷A体外有效促进hBDOs向胰腺细胞分化。图6A为加入重楼皂苷 培养后定量PCR图；图6B为加入薯蓣次皂苷A培养后荧光定量PCR结果图；图6C为加入重楼皂苷培 养14天后免疫荧光结果图；图6D为加入薯蓣次皂苷A培养14天后免疫荧光结果图；图6E为加入重楼 皂苷养hBDOs 14天后进行葡萄糖刺激，ELISA检测人C肽和insulin分泌；图6F为加入薯蓣次皂苷A 培养hBDOs 14天后进行葡萄糖刺激，ELISA检测人C肽和insulin分泌；
图7为经重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A诱导分化的hBDOs进行体内移植从而改善糖尿病。图7A为 移植经重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A处理的hBDOs到STZ诱导糖尿病小鼠肾包囊后血糖的变化图；图7B 为移植经重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A处理的hBDOs后小鼠葡萄糖耐量变化；图7C为小鼠血清中Insulin 水平的变化。
图8为不同薯蓣皂苷元衍生物体外促进mBDO向胰腺细胞分化结果图。荧光定量PCR检测β细胞标 志基因Isulin2结果如图所示。
具体实施方式
“EM培养基”是指补充了激活Wnt信号转导激活剂和TGFβ受体抑制剂，以及用于促进类器官形成 的生长因子的基础细胞培养基，例如，D/F12培养基、DMEM培养基或MEM培养基，其含有2％B27、 1％Glutamax，1％N2 supplement,A8301,noggin,尼克酰胺和N-乙酰基-L-半胱氨酸以及补充了EGF， R-spondin 1，FGF10，PGE2，Gastrin等细胞因子。
“EPOs”是指源于肝、胆、胰、胃肠道上皮细胞培养形成的类器官；“mBDOs”指源于小鼠胆管细 胞培养形成的类器官；“mPDOs”指源于小鼠胰腺导管细胞培养形成的类器官；“hBDOs”指源于人胆 管上皮细胞培养形成的类器官；上述类器官可为原代培养(例如，未经传代的培养物)，或可为二次或 随后传代培养物(例如，已继代培养或传代一次或更多次的细胞群)。
“标记物”是指生物标志物(Biomarker)，可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构，或功能 的改变或可能发生改变的生化指标。本文胰腺内分泌细胞中，β细胞标志物选择胰岛素，α细胞标记物为 胰高血糖素，δ细胞标记物为生长抑素，胰岛PP细胞标记物为胰多肽。
“胰腺体细胞”是指胰腺组织中存在的胰腺细胞类型，包括胰腺导管、胰岛、腺泡细胞。
在优选的实施方案中，上皮类器官来自于胆管细胞。细胞可以从哺乳动物例如人、猴、猪等可以移 植的供体获得。
7-8周龄健康Nu/Nu小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物饲养及使用由东北林业 大学动物伦理委员会批准，按照SPF级实验动物房的要求饲养，在室温下进行12小时的光/暗循环，并 由设施工作人员定期喂食食物和水。
重楼皂苷VI和薯蓣次皂苷A的各种类型是购买的标准品，也可以利用穿龙薯蓣皂苷有效成分提取分 离技术包括水提法、醇提法、微波提取法、微波辅助提纯法、微波辅助水提法、柱前衍生化法、树脂吸 附法、超临界CO2萃取法、超滤法等。
胰腺导管上皮祖细胞、胆管上皮祖细胞、胚胎干细胞、神经祖细胞、骨髓间充质干细胞、肝干细胞、 脐带血细胞、血源子宫内膜干细胞、牙髓间充质干细胞都可以在体外诱导分化为胰岛β细胞。
作为市售的ECM，如细胞外基质蛋白质(英杰公司制)、来源于Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉 瘤细胞的基底膜制备物(如Matrigel(BD生物科技公司制))等。可使用ProNectin(SigmaZ378666)等合成 ECM。此外，可使用天然ECM和合成ECM的混合物。水凝胶，三维类器官培养用水凝胶包含选自来自 Yeasen多肽水凝胶等市售用于制备类器官的水凝胶。
实施例1.一种培养胰岛细胞的培养基或诱导剂
人增殖培养基(human expansion medium，hEM)配方：1％Penicillin-Streptomycin Solution(HyClone； SV30010)，1％谷氨酰胺添加剂(gibco；35050-061)，1％B27 without vitamin A(Thermo；12587010)， 50ng/mL EGF(MCE；HY-P7067)，50ng/mLFGF10(PeproTech；100-26-25)，25ng/mL NOGGIN(PeproTech； 120-10C-20)，1％N2(Thermo；17502001)，10nM Gastrin(SIGMA；G9145)，3μM PGE2(SIGMA； P0409)，5μM A83-01(MCE；HY-10432)，1mM Nicotinamide(Sigma；N0636)，1mM N-乙酰基-L- 半胱氨酸(Sigma；A9165)，100ng/mL R-Spondin-1(R&D；7150-RS)，加D/F12补至40mL(HyClone；SH30022.01)；
小鼠增殖培养基(mouse expansion medium，mEM)配方：1％Penicillin-Streptomycin Solution(HyClone； SV30010)，1％谷氨酰胺添加剂(gibco；35050-061)，1％B27 without vitamin A(Thermo；12587010)， 50ng/mL EGF(MCE；HY-P7067)，50ng/mLFGF10(PeproTech；100-26-25)，25ng/mL NOGGIN(PeproTech； 120-10C-20)，1mMNicotinamide(Sigma；N0636)，1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸(Sigma；A9165)， 100ng/mLR-Spondin-1(R&D；7150-RS)，加D/F12补至40mL(HyClone；SH30022.01)；制备在上 述的EM培养基或诱导剂中含有终浓度为0.5、1、2、4μM的重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A。
实施例2.一种获得胰岛β细胞的方法
体外获得胰岛β细胞的方法如下：
1.培养小鼠胆管及胰管类器官
小鼠胆管/胰管上皮细胞起始接种在细胞外基质中，用mEM培养基在37℃，5％CO2培养箱条件下 培养。
(1)小鼠胆管类器官(Mouse bileductorganoid，mBDOs)的原代培养：利用机械法在解剖镜下直接 剥离小鼠肝外及肝内胆管(bileduct，BD)和胰腺导管(pancreaticduct，PD)，将获得的BD和PD分别 置于含有胶原酶IV的EP管中，使用手术剪剪碎。37℃消化20min，每5min取出，用1mL枪头反复吹 打，冰上终止消化。离心弃上清，无菌PBS洗3遍，Matrigel(Corning，54234)分别重悬消化好的细胞 后，滴于24孔板中37℃静置5min，使基质胶凝固。每孔加入800μL小鼠增殖培养基(mouse expansion medium，mEM)进行培养。
上述方法获得细胞在Matrigel中培养，约第5天可观察到明显类器官结构的形成，随着培养时间的 延长，在第10天左右，mBDOs的细胞密度显著增加，培养约14天左右，细胞增长至充满Matrigel，可 以进行传代培养及冻存。
(2)小鼠胆管/胰管类器官的传代培养：使用预冷的高糖DMEM培养基(HyClone；SH30022.01) 将类器官吹碎重悬，离心去上清后，沉淀利用Matrigel及mEM进行传代培养。根据细胞密度，每7～8天 以1:3-1:5的比例传代一次。
(3)小鼠胆管/胰管类器官的冻存：使用预冷的高糖DMEM培养基(HyClone；SH30022.01)将类 器官吹碎重悬，离心去上清后，加入1mL预冷的类器官冻存液，重悬的类器官移入细胞冻存管，冻存管 置于冻存盒后，移入-80℃冰箱放过夜，第二天将冻存管移入液氮中保存。
本研究获得的mBDOs/mPDOs可以长期进行传代，有稳定的增殖及传代能力，传至第7代时，依旧 能够维持良好的细胞状态，mBDO传代结果如图1A所示。重楼皂苷VI和薯蓣次皂苷A的结构式如图2A 所示。
分别利用含有终浓度的0.1、0.5、1、2、4μM的重楼皂苷VI(成都普瑞法，BP1131)或薯蓣次皂苷 A(成都普瑞法，BP1151)的EM培养基，培养上述类器官，诱导时间为14天，最后获得胰岛细胞。
利用下述实验验证实验效果：
(1)无胰岛素表达小鼠胆管类器官的鉴定：
免疫染色：PBS清洗mBDOs，加入4％PFA固定20min，冷PBS重复清洗3次，将细胞悬液滴加至 载玻片上，37℃烘干，直至类器官固定在载玻片上。使用0.3％的Triton X-100 37℃打孔1h，抗原修复液 (碧云天，P0090)室温修复10min，10％马血清37℃封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵 育2h，Hochest 33342(1:1000)染色15min，利用抗荧光猝灭封片(碧云天，P0126)。使用高分辨率活 细胞成像系统DeltaVision进行荧光照相。抗体货号及使用浓度见表2。
表1抗体来源及使用浓度
结果：制备的小鼠胆管类器官(mouse bile duct organoid，mBDO)和可以连续传代培养7代以上(图 1A)。免疫染色结果显示，制备的mBDO表达胰腺祖细胞标记基因(PDX1)和多能干细胞标记基因 (EpCAM),并且不表达胰腺内分泌细胞标志基因(Insulin，GCG，Amylase)(结果如图1B所示)
(2)细胞活性检测：利用胰蛋白酶将mBDOs消化为单细胞，使用预冷的Matreigel重悬，以1x103/ 孔的密度铺在96孔板中，分别加入含有0、0.5、1、2、4、8、10μM重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A的mEM 培养基，培养14天后进行CCK8检测。检测当日，弃去96孔板中培养基，以1:9的比例将Cell Counting Kit-8试剂(bimake；B34302)与D/F12混匀后加入到96孔板中，每孔100μL，37℃避光孵育4小时后在 450nm处检测吸光度。
结果：为了确定利用重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A诱导mPBDOs分化的安全浓度，利用CCK8进行 了重楼皂苷VI和薯蓣次皂苷A对细胞活性影响的检测，发现1-4μmol/L浓度的药物对细胞生长没有任何 影响，而当浓度达到8μmol/L时，重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A够明显抑制细胞的增殖活性，表明前述所 使用的1μmol/L浓度是非常安全的(图2B)。
(3)荧光定量PCR：分别在mBDOs中加入重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A培养3、7、10和14天， 离心收集并使用TRIZOL中裂解，提取总RNA。使用PrimerscriptRT master试剂盒(Vazyme，R323-01) 将总RNA反转为cDNA。反应体系及条件参考ChamQ Universal SYBRqPCR Master Mix说明书(Vazyme， Q711-02)(引物见表2)，并使用Roche Light Cycle 480荧光定量PCR仪进行检测。分析使用Light Cycler 480自带软件分析模块，通过Abs Quant/2nd Derivative Max计算Ct值，并用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表 达量。
表2小鼠引物序列
(4)免疫染色：利用含有1μM重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A的mEM培养mBDOs 14天后，PBS清 洗mBDOs，加入4％PFA固定20min，冷PBS重复清洗3次，将细胞悬液滴加至载玻片上，37℃烘干， 直至类器官固定在载玻片上。使用0.3％的Triton X-100 37℃打孔1h，抗原修复液(碧云天，P0090)室 温修复10min，10％马血清37℃封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2h，Hochest 33342 (1:1000)染色15min，利用抗荧光猝灭封片(碧云天，P0126)。使用高分辨率活细胞成像系统DeltaVision 进行荧光照相。抗体货号及使用浓度见表3。
表3抗体来源及使用浓度
结果：定量PCR结果显示重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A培养mBDOs 7天时可显著上调胰腺内分泌祖 细胞基因ngn3的表达，培养14天后mBDOs胰腺内外分泌标志物的基因及蛋白表达显著上调(图4A-C)。
(5)葡萄糖刺激C肽分泌：利用含有1μM浓度重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A的mEM培养mBDOs 14 天后，使用无糖Krebs溶液重悬类器官，清洗2～3次，置于低吸附培养板中，孵育过夜。加入含有2mM 葡萄糖的Krebs溶液，孵育10min，离心收集上清。无糖Krebs清洗细胞后加入20mM葡萄糖的Krebs 溶液重悬，孵育10min，离心收集上清。按照标准方案，使用小鼠C肽和insulinELISA试剂盒(mlbio， ml001995和mlbio，ml001983)分析上清液样本中的C肽和insulin水平。
结果：重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A在体外可有效促进mBDOs分化为具有功能的β细胞，分化后的 mBDOs能够响应葡萄糖刺激分泌C肽和insulin(图3E和F)，具有成熟β细胞的葡萄糖刺激的生理响 应。
(6)活体移植实验：Nu/Nu小鼠移植前7天腹腔注射链脲佐菌素(160mg/kg)诱导糖尿病。血糖仪 测量尾静脉样本的非空腹血糖，选择血糖水平升高到16.8mM以上的作为糖尿病模型小鼠。将经2阶段 诱导分化后的mBDOs用胰酶打成单细胞后，按106个细胞/只移植到受体小鼠的肾包囊中，在移植后每7 天测量常规非空腹血糖。在移植第8周，进行了肾切除术，以检查移除移植的类器官或胰岛对血糖改善 的影响。
(7)葡萄糖耐量试验：葡萄糖耐量试验按照标准方案进行，小鼠饥饿过夜，腹腔注射2g/kg的葡萄 糖，检测0、15、30、60、90和120min血糖水平，同时采集葡萄糖注射前后的血清，采用ELISA法测 定C肽和胰岛素含量变化。
结果：经重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A诱导分化后的mBDOs移植到STZ诱导的糖尿病小鼠肾包囊中， 可明显观察到小鼠的血糖有所下降，并且分化的mBDOs具有与胰岛移植的阳性对照组更相似的缓解高血 糖的作用(图4A)，葡糖糖耐量实验表明与糖尿病对照组相比，经分化的mBDOs小鼠具有与胰岛移植 的阳性对照组相似的葡糖糖耐量(图4B)，同时血清中C肽和Insulin水平都有所提高(图4C)。对移 植肾切除后，小鼠血糖水平明显升高(图4A)，进一步证明确实是由于移植的mBDOs导致血糖的下降。
(8)荧光定量PCR：分别在mPDOs中加入重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A14天后，离心收集并使用 TRIZOL中裂解，提取总RNA。使用PrimerscriptRT master试剂盒(Vazyme，R323-01)将总RNA反转为 cDNA。反应体系及条件参考ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix说明书(Vazyme，Q711-02)(引 物见表2)，并使用Roche Light Cycle 480荧光定量PCR仪进行检测。分析使用Light Cycler 480自带软 件分析模块，通过Abs Quant/2nd DerivativeMax计算Ct值，并用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。
结果：定量PCR结果显示重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A培养mPDOs14天时可显著上调β细胞特异性 基因INSULIN2的表达(图5)。
2.培养人胆管类器官
人肝外胆管细胞起始接种在细胞外基质中，用hEM培养基在37℃，5％CO2培养箱条件下培养形成 类器官。
(1)人胆管类器官(human extrahepatic bile duct organoid，hBDOs)的原代培养：利用机械法在解剖 镜下直接剥离人肝内及肝外胆管(bile tree duct，BD)，将获得的BD置于含有胶原酶IV的EP管中，使 用手术剪剪碎。37℃消化20min，每5min取出，用1mL枪头反复吹打，冰上终止消化。离心弃上清， 无菌PBS洗3遍，Matrigel(Corning，54234)重悬消化好的细胞后，滴于24孔板中37℃静置5min，使 基质胶凝固。每孔加入800μL增殖培养基((human expansion medium，hEM)进行培养。
上述方法获得细胞在Matrigel中培养，增殖72h左右，形成明显的闭合结构，2周内大量增殖形成 形态显著的囊状样的类器官。当细胞增长至充满Matrigel，可以进行传代培养及冻存。
(2)人胆管类器官(human extrahepatic bile duct organoid，hBDOs)的传代培养：使用预冷的高糖 DMEM培养基(HyClone；SH30022.01)将类器官吹碎后重悬，离心去上清后，沉淀利用Matrigel及hEM 进行传代培养。根据细胞密度，每7～8天以1:3-1:5的比例传代一次。
(3)人胆管类器官(human extrahepatic bile duct organoid，hBDOs)的冻存：使用预冷的高糖DMEM 培养基(HyClone；SH30022.01)将类器官吹碎重悬，离心去上清后，加入1mL预冷的类器官冻存液， 重悬的类器官移入细胞冻存管，冻存管置于冻存盒后，移入-80℃冰箱放过夜，第二天将冻存管移入液氮 中保存。
本研究获得的hBDOs可以长期进行传代，有稳定的增殖及传代能力，即使传至第20代时，依旧能 够维持良好的细胞状态，结果如图5所示。
分别利用含有终浓度的0.1、0.5、1、2、4μM的重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A的EM培养基，培养 上述人单管上皮细胞，诱导时间为14天，最后获得胰岛细胞。
利用以下实验验证实验效果：
(1)荧光定量PCR：hBDOs经重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A诱导3、7、10和14天后，离心收集并 使用TRIZOL裂解，提取总RNA。使用PrimerscriptRT master试剂盒(Vazyme，R323-01)将总RNA反转 为cDNA。反应体系及条件参考ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix说明书(Vazyme，Q711-02)(引 物见表4)，并使用Roche Light Cycle 480荧光定量PCR仪进行检测。分析使用Light Cycler 480自带软 件分析模块，通过Abs Quant/2nd DerivativeMax计算Ct值，并用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。
表4人引物序列
(2)免疫染色：hBDOs经重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A诱导14天后，用PBS清洗hBDOs，加入4％ PFA固定20min，冷PBS重复清洗3次，将细胞悬液滴加至载玻片上，37℃烘干，直至类器官固定在载 玻片上。使用0.3％的Triton X-100 37℃打孔1h，抗原修复液(碧云天，P0090)室温修复10min，10％ 马血清37℃封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2h，Hochest 33342(1:1000)染色15min， 利用抗荧光猝灭封片(碧云天，P0126)。使用高分辨率活细胞成像系统DeltaVision进行荧光照相。抗体 货号及使用浓度见表3。
结果：1μM重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A在体外可有效促进hBDOs向胰岛细胞分化，分化后的hBDOs 胰腺β细胞标志基因(INSULIN2)mRNA表达显著上调，胰腺内外分泌标志物基因(INS,GCG,SST，AMY) 蛋白表达均显著上调(图6A-D)。
(3)葡萄糖刺激C肽分泌：使用无糖Krebs溶液重悬分化后的类器官，清洗2～3次，置于低吸附培 养板中，孵育过夜。加入含有2mM葡萄糖的Krebs溶液，孵育10min，离心收集上清。无糖Krebs清洗 细胞后加入20mM葡萄糖的Krebs溶液重悬，孵育10min，离心收集上清。按照标准方案，使用人C肽 ELISA试剂盒(mlbio，ml057572)和人insulin ELISA试剂盒(mlbio，ml064302)分析上清液样本中的 C肽和insulin水平。
结果：经重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A诱导分化14天的hBDOs能够响应葡萄糖刺激分泌C肽和Insulin (图6E和F)，具有成熟β细胞的葡萄糖刺激的生理响应。
(4)活体移植实验：Nu/Nu小鼠移植前7天腹腔注射链脲佐菌素(160mg/kg)诱导糖尿病。血糖仪 测量尾静脉样本的非空腹血糖，选择血糖水平升高到16.8mM以上的作为糖尿病模型小鼠。将经重楼皂 苷VI或薯蓣次皂苷A诱导分化后的hBDOs用胰酶打成单细胞后，按106个细胞/只移植到受体小鼠的肾 包囊中，在移植后每7天测量常规非空腹血糖。在移植第8周，进行了肾切除术，以检查移除移植的类 器官或胰岛对血糖改善的影响。
(5)葡萄糖耐量试验：葡萄糖耐量试验按照标准方案进行，小鼠饥饿过夜，腹腔注射2g/kg的葡萄 糖，检测0、15、30、60、90和120min血糖水平，同时采集葡萄糖注射前后的血清，采用ELISA法(mlbio， ml064302)测定葡萄糖刺激前后胰岛素含量变化。
结果：经重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A诱导分化后的hBDOs移植到STZ诱导的糖尿病小鼠肾包囊中， 可明显观察到小鼠的血糖有所下降(图7A)，葡糖糖耐量实验表明与对照组相比，移植hBDOs小鼠的 葡糖糖耐量有所缓解(图7B)，同时血清中C肽和胰岛素水平有所提高(图7C)。对移植肾切除后， 小鼠血糖水平明显升高(图7A)，进一步证明确实是由于移植的hBDOs导致血糖的下降。
实施例3.胰岛β细胞的应用
细胞可用于制备人工胰岛系统以及体内应用治疗糖尿病的方法：
将实施例2获得的胰岛β细胞与药用载体包括细胞外基质、纳米材料或微流体混合，植入到动物体 内，或者将胰岛β细胞与氯化钠、氯化镁、乙二胺四乙酸钙钠和注射液用水混合支撑注射液，植入到动 物体内，进行治疗。具体步骤如下：
Nu/Nu小鼠移植前7天腹腔注射链脲佐菌素(160mg/kg)诱导糖尿病。血糖仪测量尾静脉样本的非 空腹血糖，选择血糖水平升高到16.8mM以上的作为糖尿病模型小鼠。将重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A 诱导分化后的EPOs用胰酶打成单细胞后，按106个细胞/只移植到受体小鼠的肾包囊中，在移植后每7天 测量常规非空腹血糖。葡萄糖耐量试验按照标准方案进行，小鼠饥饿过夜，腹腔注射2g/kg的葡萄糖，检 测0、15、30、60、90和120min血糖水平，同时采集葡萄糖注射前后的血清，采用ELISA法测定。在 移植第8周，进行了肾切除术，以检查移除移植的类器官或胰岛对血糖改善的影响。
结果：在二维或三维培养条件下，重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A能够促进肝胆胰胃肠道上皮中PDX1 阳性细胞，从而形成的类胰岛细胞，移植到糖尿病动物中，可以有效降糖，改善糖耐量，治疗糖尿病。 这种方法可以避免免疫排斥的多肽及其衍生物形成的水凝胶结合从而降低免疫排斥。
实施例4.一种诱导导管细胞向胰岛细胞分化的方法
导管类器官培养阶段(阶段I)和诱导分化为胰岛细胞阶段(阶段II)。
(1)阶段I包括下列步骤：(a)利用机械法在解剖镜下剥离，通过酶消化法获得肝内胆管上皮细胞、 肝外胆管上皮细胞或胰腺导管上皮细胞，将其包埋在基质胶中；(b)增殖培养基(expansion medium，EM) 中扩增，当细胞增长至充满基质胶时即可传代(约10-14天)后，每7～8天传代一次。
在阶段I中增殖培养基添加的小分子包括B27(无维生素A型B-27添加剂)，EGF(表皮生长因 子)，FGF10(成纤维细胞生长因子10)，NOGGIN(Noggin蛋白)，N2(Thermo；17502001)，Gastrin (SIGMA；G9145)，PGE2(SIGMA；P0409)，A83-01(MCE；HY-10432)，Nicotinamide(尼克酰胺)， N-乙酰基-L-半胱氨酸，和R-spondin 1。
(2)阶段II包括：添加1μM浓度重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A到EPOs的EM培养基中，培养14 天。阶段II添加的重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A。
结果：重楼皂苷VI或薯蓣次皂苷A功能性诱导的胰岛内分泌细胞，主要包括β细胞。在实施方案中， 诱导的胰岛内分泌细胞表达至少一种细胞标记物：β细胞标记物胰岛素(Insulin；INS)，α细胞标记物胰 高血糖素(Glucagon；GCG)，δ细胞标记物生长抑素(Somatostatin；SST)，pp细胞标记物胰多肽(panoreatio polypeptide；PP)。
实施例5.薯蓣皂苷元衍生物的应用
Diosgenin(薯蓣皂苷配基)为基础的皂苷元结构如下所示。
基于上述基本的皂苷元结构，而后在其基础皂苷元结构上进行不同的糖基化修饰，形成不同的衍生 物。利用mBTO对以上所有皂苷类进行了筛选，利用胰蛋白酶将mBDOs消化为单细胞，使用预冷的 Matrigel重悬，以1x103/孔的密度铺在96孔板中，添加浓度为1μM处理14天后进行了荧光定量PCR验 证，结构如下所示，结果图如图8所示，证明薯蓣皂苷元衍生物可促进Insulin2的表达，并且C3位的糖 基化修饰的皂苷具有更好的向β细胞分化效果。
基于上述基本的皂苷元结构的化合物如表5所示，利用胰蛋白酶将mBDOs消化为单细胞，使用预冷 的Matrigel重悬，以1x103/孔的密度铺在96孔板中，均添加浓度为1μM处理14天后进行了荧光定量PCR 验证，结果均是可促进Insulin2的表达，具有促进向β细胞分化效果。
表5基于薯蓣皂苷元结构的衍生物
SEQUENCE LISTING
<110> 东北林业大学
<120> 薯蓣皂苷元及其类似物在制备预防或治疗糖尿病药物中的应用
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ccctaagtga tccgctacaa tc 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cttgacaaaa gcctgggtg 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cggatgacgc caaacttaca a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tttccactag cacccaccac 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ccatttactt tgtggctgga ttgc 24
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
atgtgccctg tgagtggcgt tt 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gacacctgag cagatggcac aat 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ccacgggctg aagacaagag 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
tctggaagac attcacatcc tg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
tctaatgcag ggtcaagttg ag 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
ggagtagcag ggttcagact tg 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
actaccttta attgcctcac cac 23
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
cacggcaaat tcaacggcac agtcaagg 28
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
gttcacaccc atcacaaaca tgg 23
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
ggcttcttct acacacccaa g 21
<210> 16
<211> 22
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<400> 16
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<212> DNA
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<400> 17
tgacgtggac atccgcaaag 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
ctggaaggtg gacagcgagg 20
Claims (10)
1.式I所示化合物及其羟基化修饰、甲基化修饰、糖基化修饰、双键还原中一种或多种，或上述化合物药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物作为活性成分在制备治疗和/或预防糖尿病的药物中应用，
式I：
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，式I所示化合物羟基/甲基化修饰：
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，式I所示化合物糖基化修饰：
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，式I所示化合物双键还原为：
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是用于产生胰岛素分泌细胞和/或胰岛细胞治疗糖尿病的药物。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，式I所示化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物作为活性成分诱导肝内胆管上皮、肝外胆管上皮、胰腺导管上皮、胃上皮、肠上皮细胞产生胰岛细胞。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，式I所示化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物作为活性成分诱导胰腺祖细胞、胚胎干细胞、神经祖细胞、骨髓间充质干细胞、肝干细胞、脐带血细胞、血源子宫内膜干细胞、牙髓间充质干细胞分化为胰岛β细胞。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是促进胰岛素分泌细胞产生的药物。
9.如权利要求1-8任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物是以式I所示化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物。
10.权利要求1所述的式I所示化合物及其羟基化修饰、甲基化修饰、糖基化修饰、双键还原中一种或多种，或上述化合物药学上可接受的盐、溶剂化物或多晶型物作为分化诱导剂在利用胰腺祖细胞制备胰岛素分泌细胞中的应用。
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Also Published As
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|---|---|
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