CN109913418A - 3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元在间充质干细胞诱导分化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了3β‑肉桂酰基薯蓣皂苷元在间充质干细胞诱导分化中的应用。Nestin为神经干细胞标记物中的一种，表达于胚胎发育早期；NSE是神经元细胞所特有的一种酸性蛋白；MAP‑2是一种主要存在于神经元细胞的胞体和树突中的蛋白，对突触的生长具有重要作用。Nestin、NSE和MAP‑2都是神经细胞的标记性蛋白，其表达水平可以反映间充质干细胞向神经细胞的分化水平。本发明发现，骨髓间充质干细胞经过3β‑肉桂酰基薯蓣皂苷元诱导后向神经细胞的分化能力增强，具有和阳性药类似的作用。因此，3β‑肉桂酰基薯蓣皂苷元可以用于体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化，可制成商品化的分化培养基。
Description
技术领域
本发明属于干细胞领域，涉及干细胞诱导分化，具体涉及3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元在间充质干细胞诱导分化中的应用。
背景技术
骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是来源于骨髓的多潜能干细胞，因其在一定环境作用下能分化成包括心肌细胞、成骨细胞、神经元样细胞等在内的多种细胞，且来源广，增殖能力强，是目前再生医学研究的热点。特别是作为种子细胞在替代来源受限的神经干细胞用于治疗中枢神经损伤修复方面，拥有重要的应用前景。
化学诱导是体外诱导BMSCs向神经样细胞分化的重要方法。Woodbury等首次通过丁羟基茴醚、二甲基亚砜等化合物在体外诱导BMSCs成神经样细胞分化(Woodbury D,Schwarz E J,Prockop D J,et al.Adult rat and human bone marrow stromal cellsdifferentiate into neurons[J].J Neurosci Res,2000,61:364-370)。Zhao等通过β-巯基乙醇诱导了BMSCs向神经样细胞分化(Zhao L,Lin Y D,Ma J,et al.Culture andneural differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro[J].Cell Biol Int,2007,31:916-923)。倪广晓等通过隐丹参酮诱导了BMSCs向神经样细胞分化(倪广晓等，隐丹参酮体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究，河北中医药学报，2018年第33卷第6期)。李鹏涛等发现黄芪甲苷Ⅳ可以诱导SAMR1小鼠BMSCs体外分化为神经细胞，40g/L浓度诱导12h效果较好。黄芪甲苷Ⅳ诱导分化过程中，通过提高β-catenin蛋白和mRNA的表达，抑制Notch1蛋白和mRNA的表达，从而促进BMSCs分化为神经细胞(李鹏涛等，黄芪甲苷Ⅳ诱导SAMR1小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的实验研究，河北医科大学学报，2018年第39卷第11期)。
薯蓣皂苷元是从薯蓣科植物盾叶薯、穿龙薯蓣等根茎中分离出来的一种甾体类化合物，其化学名称为Δ5-异螺旋甾烯-3β-醇，是合成甾体激素类药物和甾体避孕药的重要原料，具有降血脂、抗血栓、抗肿瘤等药理活性。
薯蓣皂苷元衍生物通常通过将薯蓣皂苷元的3-OH进行修饰得到，3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元就是其中一种。研究表明，薯蓣皂苷元衍生物通常具有比薯蓣皂苷元更为优异的活性。
目前尚未见薯蓣皂苷元及其衍生物在骨髓间充质干细胞神经分化方面的研究报道。
发明内容
本发明旨在提供3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元在间充质干细胞诱导分化中的应用，具体地，间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。
本发明目的通过以下技术方案实现：
薯蓣皂苷元衍生物在体外诱导间充质干细胞向神经细胞分化方面的应用。
进一步地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
进一步地，所述神经细胞为神经元细胞。
进一步地，所述薯蓣皂苷元衍生物为其3-OH衍生物。
更进一步地，所述3-OH衍生物为3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元。
3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元用于制备诱导间充质干细胞向神经细胞分化的培养基的用途。
进一步地，所述所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
进一步地，所述神经细胞为神经元细胞。
有益效果：
Nestin为神经干细胞标记物中的一种，表达于胚胎发育早期；NSE是神经元细胞所特有的一种酸性蛋白；MAP-2是一种主要存在于神经元细胞的胞体和树突中的蛋白，对突触的生长具有重要作用。Nestin、NSE和MAP-2都是神经细胞的标记性蛋白，其表达水平可以反映间充质干细胞向神经细胞的分化水平。本发明发现，骨髓间充质干细胞经过3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元诱导后向神经细胞的分化能力增强，具有和阳性药类似的作用。因此，3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元可以用于体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化，可制成商品化的分化培养基。
附图说明
图1为大鼠第3代BMSCs表面标记物CD34、CD45、CD90表达水平的流式测定结果；
图2为神经细胞标记蛋白Nestin、NSE、MAP-2的Western blot测定结果；其中，A泳道为菝葜皂苷元(低浓度)，B泳道为菝葜皂苷元(高浓度)，C泳道为对照组，D泳道为阳性药组，E泳道为薯蓣皂苷元，F泳道为3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元(低浓度)，G泳道为3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元(高浓度)。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来介绍本发明的实质性内容，但不能以此限定本发明保护范围。
一、实验材料
SPF级4周龄雄性SD大鼠，体重90～110g，由青龙山实验动物中心提供。
胎牛血清、DMEM/F12培养基、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)购自Gibco公司。
CD34、CD45、CD90、兔抗Nestin、NSE、MAP-2、β-Actin及二抗购自Abcam公司。
薯蓣皂苷元、3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元纯度不低于95％。
二、实验方法
1、大鼠BMSCs的分离、培养、纯化和表型鉴定
将大鼠麻醉后脱颈处死，无菌条件下用75％酒精消毒，PBS冲洗干净，用手术剪将大鼠右腿胫骨及股骨剪下，并将胫骨及股骨骨端剪掉，暴露骨髓腔，针头穿刺，用DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔，1500r/min离心10min，收集细胞沉淀并重悬，培养于含有12％胎牛血清的DMEM/F12培养基(完全培养基)中，每隔3d换液，将不贴壁细胞去除，在细胞融合程度达到80％时候传代，取第3代细胞进行表型鉴定和后续实验。
取第3代BMSCs，胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，并调节细胞密度为1×106个/mL，置于EP管中，分别加入FITC标记的CD34、CD45、CD90单克隆抗体，室温避光孵育30min，PBS洗涤没有结合的抗体，最后加入PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。
2、对BMSCs神经分化的诱导作用(Western blot法)
取第3代BMSCs，胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，以细胞密度1×104个/mL接种于24孔板，每孔1.5mL，于37℃、5％CO2条件培养，待细胞贴壁后，吸弃上清液，实验组和阳性药组先用含5ng/mL的bFGF的完全培养基培养24h，实验组再用含10μM薯蓣皂苷元或2μM、5μM 3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元的完全培养基培养诱导培养7d，阳性药组再用含20ng/mL的bFGF的完全培养基培养诱导培养7d，对照组全程使用完全培养基培养(即先用完全培养基培养24h，再同步换液使用新鲜的完全培养基继续培养7d)。
培养结束后，弃上清，PBS充分洗涤，收集细胞，加入预冷的蛋白裂解液充分裂解，裂解后离心12000r/min离心10min，取上清液，测定蛋白浓度。制作蛋白浓缩胶及分离胶，蛋白上样(每泳道40μg)，进行SDS-PEGE电泳，湿法转膜，5％脱脂奶粉封闭1h，加入稀释的兔抗Nestin、NSE、MAP-2及β-Actin多克隆抗体一抗溶液，4℃过夜孵育，PBS冲洗，加入二抗溶液室温孵育2h，PBS冲洗，用凝胶系统分析各蛋白条带灰度值，以各蛋白条带与内参灰度值比值表示蛋白表达水平。
3、对BMSCs活力的影响(MTT法)
取第3代BMSCs，胰酶消化后制成单细胞悬液，以细胞密度1×105个/mL接种于96孔板，每孔100μL，于37℃、5％CO2条件培养，待细胞贴壁后，吸弃上清液，实验组分别加入含2μM、5μM 3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元的完全培养基，对照组加入等量完全培养基，每组设3个复孔，于培养箱中继续培养48、72h后，每孔加20μL 5g/L的MTT溶液，继续孵育4h，弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜，混合均匀，于酶标仪490nm波长处检测吸光度值。
4、统计学处理
实验数据均以平均值±标准偏差表示，组间差异比较采用t检验。
三、实验结果
1、大鼠BMSCs的表型鉴定结果
经流式细胞术检测BMSCs表面标志物，结果表明CD90呈强阳性表达，阳性率高于95％；CD34及CD45呈弱阴性表达，阳性率均低于1％，符合BMSCs的特点，表明分离纯化得到的BMSCs均一性较好，纯度高。流式细胞术检测结果如图1所示。
2、BMSCs神经分化的诱导结果
Western blot测定结果如表1和图2所示，与对照组相比，阳性药组、低浓度和高浓度3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元实验组均呈现明显的神经细胞分化，其中高浓度3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元实验组向神经细胞的分化程度高于阳性药组。薯蓣皂苷元实验组与对照组相比分化不明显。
表1 Nestin、NSE、MAP-2蛋白的表达水平
Nestin为神经干细胞标记物中的一种，表达于胚胎发育早期；NSE是神经元细胞所特有的一种酸性蛋白；MAP-2是一种主要存在于神经元细胞的胞体和树突中的蛋白，对突触的生长具有重要作用。Nestin、NSE和MAP-2都是神经细胞的标记性蛋白，其表达水平可以反映间充质干细胞向神经细胞的分化水平。本发明发现，骨髓间充质干细胞经过3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元诱导后向神经细胞的分化能力增强，具有和阳性药类似的作用。因此，3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元可以用于体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化，可制成商品化的分化培养基。
3、BMSCs活力检测结果
MTT法测定结果如表2所示，3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元可以促进BMSCs的增殖活力，且呈现明显的时间依赖性和剂量依赖性。
表2各组490nm波长处吸光度值
| 48h | 72h | |
| 对照组 | 0.352±0.087 | 0.574±0.079 |
| 实验组(2μM) | 0.643±0.075 | 0.887±0.095 |
| 实验组(5μM) | 0.916±0.092 | 1.253±0.084 |
上述实施例用来介绍本发明的实质性内容，但不能以此限定本发明保护范围。
Claims (6)
1.薯蓣皂苷元衍生物在体外诱导间充质干细胞向神经细胞分化方面的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的应用，所述薯蓣皂苷元衍生物为其3-OH衍生物。
4.根据权利要求3所述的应用，所述3-OH衍生物为3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元。
5.3β-肉桂酰基薯蓣皂苷元用于制备诱导间充质干细胞向神经细胞分化的培养基的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
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| CN115120600A (zh) * | 2022-05-19 | 2022-09-30 | 东北林业大学 | 薯蓣皂苷元及其类似物在制备预防或治疗糖尿病药物中的应用 |
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| CN115120600B (zh) * | 2022-05-19 | 2023-11-28 | 东北林业大学 | 薯蓣皂苷元及其类似物在制备预防或治疗糖尿病药物中的应用 |
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