CN115120571A - 一种姜黄素核壳纳米粒子的制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含有姜黄素的核壳纳米粒子及其制备方法和应用。核壳纳米粒子为球形，内核为块状姜黄素纳米晶，壳为含敏感聚合物；其中，内核占姜黄素核壳纳米粒子质量的60‑95％；敏感聚合物为按质量比为1：0.1‑5的酸敏感聚合物和碱敏感聚合物。本发明所得粒子可达到治疗溃疡性结肠炎的作用。体外溶出实验显示该纳米粒子具有pH依赖性；体内抗炎实验表明，该纳米粒子可以缓解溃疡性结肠炎。同时，该纳米粒子载药量高，辅料安全，制备工艺简单，可以靶向结肠炎炎症部位，使炎症得到显著缓解，具有良好的临床应用前景。

Description

一种姜黄素核壳纳米粒子的制备和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含有姜黄素的核壳纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种以结肠和直肠最内层炎症和上皮黏膜损伤为特征的复发性疾病。该病病因复杂，治愈难度大，复发率高且有家族遗传倾向。目前，全球发病率急剧上升，给病人及公共医疗带来沉重的负担。
姜黄素(Curcumin,CUR)，是存在于姜黄根茎中的一种天然二酮类化合物，化学式为C21H20O6，分子量为368.39，结构式如下。姜黄素为橙黄色结晶粉末，可溶于冰醋酸、乙醇、丙酮、氯仿等溶剂，不溶于水。姜黄素具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、抗菌、抗氧化应激、抗炎等。姜黄素主要是通过抑制炎症介质如环氧合酶、脂肪氧化酶、肿瘤坏死因子以及干扰素等的表达，来达到抗炎的疗效。
Figure BDA0003690561430000011
作为一种植物药，姜黄素获得了美国食品和药物管理局的批准。与其他抗炎药相比，姜黄素具有较高的安全性。然而，姜黄素在用于治疗溃疡性结肠炎时，面临许多问题，如溶解速率低、结肠递送效率有限等，这些问题降低了姜黄素口服给药后的治疗效果。为了提高姜黄素的溶解速率，目前已经开发了多种递药系统，例如固体分散体、脂质体、纳米凝胶等。然而，载药量低和辅料安全性问题是阻碍这些递药系统临床应用的内在限制。因此，亟待开发能够提高姜黄素载药量、溶解速率及结肠递送效率的制剂，该制剂在治疗溃疡性结肠炎的同时，还应具有辅料安全的特点，以满足临床需求，最终实现产业化。
纳米晶体技术(Nanocrystals,NCs)具有药物溶解迅速、载药量高及辅料用量少的显著优势，是开发难溶性药物的重要技术手段。然而，口服给药后，纳米晶在到达发炎的结肠区域之前会迅速溶解在上消化道中，这会影响药物在炎症部位的有效释放。因此，设计一种先进的靶向给药系统对于溃疡性结肠炎的治疗至关重要。
核壳纳米粒子在提高靶向递送效率方面表现出独特的优势。通过使用不同性质的材料制备外壳，可以实现药物在病变部位的特异性释放。正常结肠区的pH值为7.0±0.7，而溃疡性结肠炎患者的pH值会从7.0下降到3.0左右。因此，药物在口服给药后到达炎症部位之前会经历一个pH变化的过程(胃pH 1.2-小肠pH 6.8-发炎的结肠pH 3.0)。这种独特的pH值变化为药物靶向递送提供了机会。因此，如何基于这种pH变化的胃肠环境，开发一种载药量高、溶出速率快、能靶向递送到结肠炎炎症部位的核壳纳米粒子是目前急需解决的技术问题。
发明内容
为了克服现有的技术缺陷，本发明目的在于提供一种含有姜黄素的核壳纳米粒子及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种姜黄素核壳纳米粒子，核壳纳米粒子为球形，内核为块状姜黄素纳米晶，壳为含敏感聚合物；其中，内核占姜黄素核壳纳米粒子质量的60-95％；敏感聚合物为按质量比为1：0.1-5的酸敏感聚合物和碱敏感聚合物。
所述粒子中按质量百分比计，姜黄素60-90％、稳定剂0.1-10％、酸敏感聚合物1-10％、碱敏感聚合物1-20％、余量为磷酸盐；
优选，所述粒子中按质量百分比计，姜黄素70-85％、稳定剂5-10％、酸敏感聚合物1-5％、碱敏感聚合物2-10％、余量为磷酸盐；
所述酸敏感聚合物选自壳聚糖(CH)及丙烯酸树脂EPO(EPO)中的一种或多种，优选为丙烯酸树脂EPO(EPO)；所述碱敏感聚合物选自海藻酸钠(AG)、透明质酸钠(HA)、丙烯酸树脂L100(L100)中的一种或多种，优选为丙烯酸树脂L100(L100)。
所述的稳定剂为泊洛沙姆188(F68)、泊洛沙姆407(F127)、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、聚乙烯吡咯烷酮K12(PVP-K12)、聚乙烯吡咯烷酮K17(PVP-K17)、聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯(HS-15)、聚氧乙烯(35)蓖麻油(ELP-35)、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(Tween-80)以及卵磷脂(Lecithin)中的一种或多种，优选为泊洛沙姆188(F68)、泊洛沙姆407(F127)、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)中的一种或多种。
一种姜黄素核壳纳米粒子的制备方法，采用层层包覆法制备：
1)将姜黄素分散于溶剂中，在磁力搅拌下混合均匀，得粗混悬液A；
2)将稳定剂经磁力搅拌分散于步骤(1)得到的粗混悬液中，得粗混悬液B，而后研磨，即得的姜黄素纳米晶(CNs)；
3)将酸敏感聚合物溶解在磷酸盐缓冲液中，得溶液C；
4)将步骤2)所得的姜黄素纳米晶与溶液C混合，并在恒温下孵育，得混悬液D，将混悬液D冻干，得粉末E；
5)将碱敏感聚合物溶解在磷酸盐缓冲液中，得溶液F；
6)将步骤4)所得的粉末E与步骤5)所得的溶液F于磁力搅拌下混合均匀，并在恒温下孵育，得混悬液G，混悬液G冻干，得到具有pH依赖性的姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)。
所述步骤2)中研磨为将粗混悬液B加入到含有二氧化锆研磨珠的研磨罐中，再将研磨罐放入行星式球磨机中研磨，其中，二氧化锆研磨珠与粗混悬液B的体积比为1:0.1-1:1.5；行星式球磨机的转速为20-35Hz，研磨时间为1-10min，冷却时间为2-5min，总研磨时间设置为1-6，此研磨工艺参数的设定，在耗能低的前提下可获得粒径分布小且均匀、稳定好的姜黄素纳米晶(CNs)。二氧化锆研磨珠的尺寸为0.1-0.8mm。
当以31Hz的功率运行3-4h时，其粒径最小(200-400nm)、最均匀、稳定性最高。
所述步骤3)中，磷酸盐缓冲液pH值为1-5，优选pH值为3.5-4.5；所述步骤5)中，磷酸盐缓冲液pH值为6-8，优选pH值为6.8-7.4。
所述步骤4)和步骤6)中，恒温温度为37℃，孵育时间为2h。
所述步骤4)及步骤6)中，冻干的条件为：预冻温度为-50℃—-25℃，预冻时间为4-10h，然后置于冷冻干燥设备中，在-5—10℃温度下冻干18-24h。
上述采用湿法球磨技术制备出的姜黄素纳米晶(CNs)粒径小且均匀、稳定性良好，在电子显微镜下观测形态为均匀的块状。
上述制备的姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)使用透射电子显微镜进行观察，形态为球形；通过DSC进行表征，证明制备过程不会对姜黄素的晶型造成影响。
一种姜黄素核壳纳米粒子的应用，所述的姜黄素核壳纳米粒子在作为靶向溃疡性结肠炎的药物中的应用。
上述获得具有pH依赖性的姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)。该体系优选使用泊洛沙姆407(F127)作为稳定剂，通过研磨制得粒径小且均一的姜黄素纳米晶(CNs)。以姜黄素纳米晶(CNs)为核，丙烯酸树脂EPO和丙烯酸树脂L100作为双层壳，对体系进行孵育、冻干后，得到具有pH依赖性的姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)。该体系可以靶向结肠炎部位。体外溶出试验表明，该纳米粒子在不同pH值的介质中，溶出行为不一致，表明姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)具有pH依赖性。体外药效学实验表明，将姜黄素制备成纳米晶后，抗炎效果显著提升。体内药效学实验表明，口服给药后，该纳米粒子可以有效地缓解溃疡性结肠炎。同时，该制剂所应用全部的辅料经FDA批准，安全性得到保障，具有产业化价值，对于治疗溃疡性结肠炎具有重要意义。
本发明的优势在于：
本发明采用层层包覆法制备姜黄素核壳纳米粒子，达到治疗溃疡性结肠炎的作用。同时，该纳米粒子载药量高，辅料安全，制备工艺简单，可以靶向结肠炎炎症部位，使炎症得到显著缓解，具有良好的临床应用前景；进一步的说：
1)本发明核壳纳米粒子具有pH依赖性，该姜黄素核壳纳米粒子以姜黄素纳米晶为核，以酸敏感聚合物和碱敏感聚合物为双层壳；并且于核内添加稳定剂，即可将姜黄素制成粒径小且均一、在长时间内不会发生聚集和沉降的姜黄素纳米晶；2)本发明核壳纳米粒子中双层壳辅料的所用是经FDA批准，无毒、无害、无污染；
3)本发明所制备的制剂，工艺简单，具有产业化前景，并且冻干过程中不需额外添加冻干保护剂，即得疏松多孔的粉末，易于保存与运输；
4)本发明制备所得核壳纳米粒子提高了姜黄素的载药量和溶解度，并且能靶向递送到溃疡性结肠炎部位，通过口服给药后，炎症得到显著缓解，提高患者的依从性，为治疗溃疡性结肠炎的治疗提供新思路；给临床治疗溃疡性结肠炎提供更多的选择。
附图说明：
图1为本发明实施例提供的中的姜黄素纳米晶(CNs)、经EPO包覆的姜黄素纳米晶(CNs@EPO)和姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)透射电子显微镜图。A.姜黄素纳米晶(CNs)，B.经EPO包覆的姜黄素纳米晶(CNs@EPO)，C.姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)。
图2为本发明实施例6中的姜黄素原料药(CUR)、泊洛沙姆407(F127)、丙烯酸树脂EPO(EPO)、丙烯酸树脂L100(L100)、姜黄素纳米晶物理混合物(PMCNs)、经EPO包覆的姜黄素纳米晶物理混合物(PMCNs@EPO)、姜黄素核壳纳米粒子物理混合物(PM CNs@EPO@L100)、姜黄素纳米晶(CNs)、经EPO包覆的姜黄素纳米晶(CNs@EPO)和姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)的DSC图。
图3为本发明实施例7中姜黄素原料药(CUR)、姜黄素纳米晶(CNs)、经EPO包覆的姜黄素纳米晶(CNs@EPO)和姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)在不同pH值的溶出介质中的体外溶出图。A.溶出介质的pH值为1.2，B.溶出介质的pH值为3.0，C.溶出介质的pH值为6.8。
图4为本发明实施例8中姜黄素原料药(CUR)、姜黄素纳米晶(CNs)、经EPO包覆的姜黄素纳米晶(CNs@EPO)和姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)在动态pH值变化的溶出介质中的体外溶出图。
图5为本发明实施例9中RAW 264.7细胞的显微图像。A.Control组，B.LPS+PBS组，C.LPS+CUR组，D.LPS+CNs组
图6为本发明实施例9中Control组，LPS+PBS组，LPS+CUR组和LPS+CNs组培养液中TNF-α和IL-6的浓度图。A.TNF-α的浓度，B.IL-6的浓度。
图7为本发明实施例9中ROS的荧光图。A.Control组，B.LPS+PBS组，C.LPS+CUR组，D.LPS+CNs组
图8为本发明实施例10中对照组、UC模型组、CUR组、CNs组、CNs@EPO组、CNs@EPO@L100组的小鼠体重图。
图9为本发明实施例10中对照组、UC模型组、CUR组、CNs组、CNs@EPO组、CNs@EPO@L100组的小鼠DAI评分结果。
图10为本发明实施例10中对照组、UC模型组、CUR组、CNs组、CNs@EPO组、CNs@EPO@L100组的小鼠结肠长度图。
具体实施方式：
实施例1：姜黄素纳米晶稳定剂种类及用量的筛选
首先，将3.0g姜黄素分散于30mL水中，在磁力搅拌下混合均匀，得粗混悬A；将按照表1记载不同量的泊洛沙姆188(F68)、泊洛沙姆407(F127)、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、聚乙烯吡咯烷酮K12(PVP-K12)、聚乙烯吡咯烷酮K17(PVP-K17)以及卵磷脂(Lecithin)分别加入到上述粗混悬A中，在磁力搅拌下充分混合，得粗混悬B。其中，稳定剂与姜黄素的质量比分别为1:50、1:25、1:10、1:5、2:5、1:1。将粗混悬B转移到含有105g二氧化锆球磨珠(0.4-0.6mm)的球磨罐中。利用行星式球磨机研磨，参数设定为31Hz，研磨240min(每研磨5min后暂停3min)。测定各处方的粒径(Z-average)、多分散指数(PDIs)与ξ-电位，结果如表1所示。表1数据结果表明，不同稳定剂的稳定作用能力不同，最终确定稳定剂为泊洛沙姆407(F127)且与姜黄素质量比为1:10时的粒径较小且分布较为均匀，无大颗粒，其余稳定剂制备的姜黄素纳米结晶粒径较大且PDIs较大，表明分布不均匀，稳定作用较差。
表1稳定剂种类和用量对姜黄素纳米晶粒径及电位的影响
Figure BDA0003690561430000052
Figure BDA0003690561430000051
Figure BDA0003690561430000061
即获得姜黄素纳米晶(CNs)的最优处方
以泊洛沙姆407(F127)为稳定剂，制备姜黄素纳米晶，具体处方组成及用量如下：
表2处方组成及用量
物料名称 用量(重量体积比) 处方量
姜黄素 10.0％ 1g
泊洛沙姆407 1.0％ 0.1g
水 适量 适量
实施例2：姜黄素核壳纳米粒子的双层壳种类及用量的筛选
首先，将不同种类及用量的酸敏感聚合物溶解在pH值为4.0的磷酸盐缓冲液中；其中，酸敏感聚合物为壳聚糖或丙烯酸树脂EPO。
将利用上述最优处方获得的姜黄素纳米晶(CNs)与上述含不同酸敏感聚合物溶液在37℃下恒温孵育2h，酸敏感聚合物对CNs进行充分包覆后，将样品冻干。
随后，按表3记载将不同种类及用量的碱敏感聚合物溶解在pH值为7.0的磷酸盐缓冲液中。其中，碱敏感聚合物为海藻酸钠、透明质酸钠、丙烯酸树脂L100。将上述冻干粉末与碱敏感聚合物溶液于磁力搅拌下混合均匀后，在37℃下恒温孵育2h，再次冻干，即得姜黄素核壳纳米粒子。
两次冻干的条件为：预冻温度-50℃，预冻时间4h，随后，在-5℃温度下冻干6h。
将冻干的姜黄素核壳纳米粒子粉末加水复溶，测定各处方的粒径(Z-average)、多分散指数(PDIs)与ξ-电位，结果如表3所示。表3数据结果表明，不同种类及比例的酸敏感聚合物及碱敏感聚合物对CNs的包覆效果不同。同时，在不额外填加冻干保护剂的条件下，当丙烯酸树脂EPO与丙烯酸树脂L100比例为1:2时，复溶后粒径最小，且分布较为均匀，其余聚合物制备的姜黄素核壳纳米粒子粒径和PDIs较大，作用较差。
表3酸敏感聚合物及碱敏感聚合物种类和用量对姜黄素核壳纳米粒子粒径及电位的影响
Figure BDA0003690561430000071
Figure BDA0003690561430000072
--表示明显发生沉降，未进行表征
由上述可见，姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)的最优处方
以泊洛沙姆407为稳定剂，制备姜黄素纳米晶。然后，以丙烯酸树脂EPO为酸敏感聚合物，以丙烯酸树脂L100为碱敏感聚合物，对姜黄素纳米晶进行双层包覆，制备姜黄素核壳纳米粒子，具体处方组成及用量如下：
表4姜黄素核壳纳米粒子处方组成及用量
Figure BDA0003690561430000073
对上述制备所得不同药剂进行性能测试：
1)对最佳处方制备所得姜黄素纳米晶(CNs)、经EPO包覆的姜黄素纳米晶(CNs@EPO)以及姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)进行形态表征：
采用透射电子显微镜法(TEM)对所制备的姜黄素核壳纳米粒子形态进行表征。首先，将样品稀释并滴到220目碳膜的铜网格上。室温干燥后，用HT-7700透射电子显微镜进行观察。结果如图1所示，结果表明：姜黄素纳米晶(CNs)呈均匀的块状；只经EPO包覆后的CNs@EPO粒径和形状没有明显变化，但与CNs相比，表面更为粗糙；双层包覆的CNs@EPO@L100粒径显着增加，形态从块状变为球形。说明双层壳成功的包覆到CNs表面，并具有250nm左右的厚度。
2)对姜黄素核壳纳米粒子的物相确认：
为考察姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)的药物存在状态，将样品冻干。采用差示扫描量热法(DSC)对样品进行表征。条件为：仪器：DSC 250热分析仪(美国TA公司)；温度范围：40～200℃；升温速度：10℃/min。结果如图2所示。结果表明：姜黄素核壳纳米粒子在178.08℃附近的吸收峰与姜黄素原料药的吸收峰相一致，说明在制备过程中，姜黄素核壳纳米粒子晶型稳定，未受到层层包覆制备工艺的影响。
3)对姜黄素核壳纳米粒子的物理稳定性考察
对上述采用最佳处方获得姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)(即，未冻干)、以及所得姜黄素核壳纳米粒子(CNs@EPO@L100)经过不同冻干条件处理后的粒子进行物理稳定性的考察，冻干的条件为：预冻温度-50℃，预冻时间4h，随后，在-5℃温度下冻干6h；
或，冻干条件为：-25℃温度下冻干10h。
将上述不同冻干条件下以及未冻干的姜黄素核壳纳米粒子在室温中放置7天。然后测定各样品的粒径(Z-average)和多分散指数(PDIs)。结果如表5所示。
表5冻干过程对姜黄素核壳纳米粒子物理稳定性的影响
Figure BDA0003690561430000081
Figure BDA0003690561430000082
--表示明显发生沉降，未进行表征
结果表明冻干过程会影响姜黄素核壳纳米粒子的放置稳定性，只有在特定的冻干的条件下制备的黄素核壳纳米粒子的粒径较小且分布较为均匀，无大颗粒。
4)对姜黄素核壳纳米粒子在不同介质中的体外溶出实验
为考察姜黄素核壳纳米粒子的pH依赖性，在不同pH值的介质中进行了溶出测试。分别以pH 1.2盐酸缓冲液、pH 6.8磷酸盐缓冲液和pH 3.0磷酸盐缓冲液为溶出介质，并加入0.5％Tween-80(v/v)以促进姜黄素的溶解。其中，pH 1.2、pH 6.8和pH 3.0的水溶液分别用于模拟胃、小肠和发炎结肠的环境。分别将含9mg姜黄素的姜黄素原料药(CUR)、姜黄素纳米晶(CNs)、只经EPO包覆的姜黄素纳米粒子(CNs@EPO)以及双层包覆的姜黄素纳米粒子(CNs@EPO@L100)分散于在37℃、体积为900mL的溶出介质中。于10min、30min、60min、120min、240min时取样，经0.22μm的微孔滤膜过滤后，使用Varioskan Flash多板阅读器(ThermoFisher，芬兰)分析样品。激发波长和发射波长分别设置为452nm和560nm。溶出曲线见图3。由图可见：CNs由于比表面积的增加，在不同pH值的介质中均迅速溶解，其溶出行为不具有pH依赖性；CNs@EPO在pH 1.2和pH 3.0的溶出介质中，释放行为与CNs一致，而在pH6.8的溶出介质中，药物释放明显变慢，说明EPO可以阻止姜黄素纳米晶在pH 6.8的介质中的溶出；CNs@EPO@L100在这3种介质中均表现出较慢的药物释放行为，说明EPO和L100对CNs具有协同保护作用。
5)对姜黄素核壳纳米粒子在动态pH变化的介质中的体外溶出实验
为了进一步研究pH值对溶出速率的影响，使用pH动态变化的溶出介质来模拟胃肠道中的pH变化。首先，将上述样品置于900mL pH 1.2的盐酸缓冲液中，并在37℃下振荡1h。然后，通过加入磷酸氢二钾和氢氧化钠将溶出介质的pH值调节至6.8，实验持续2h。最后，向溶出介质中加入盐酸将pH值调节至3.0，并继续振荡1h。如上述体外溶出实验中的方法分析样品。结果如图4所示。结果表明：CNs@EPO在不同pH的值溶出介质中的溶出行为与CNs相似，这是因为EPO层在pH 1.2的介质中溶解，不能减缓药物在后续溶出介质的释放；CNs@EPO@L100在不同pH的值溶出介质中，释放行为不同，在pH 1.2的介质中无突释现象，在pH 6.8的介质中药物释放持续增加，而当pH调节至3.0后，药物释放迅速加快。该结果表明，CNs@EPO@L100可以实现药物在溃疡性结肠炎炎症部位特异性释放。
6)姜黄素核壳纳米粒子体外的抗炎活性
为了研究姜黄素核壳纳米粒子的体外抗炎作用，使用LPS激活的RAW264.7细胞模拟炎症状态。将RAW 264.7细胞以1×105个/孔接种在24孔板中，在37℃、90％相对湿度和5％CO2的条件下，放置于含有10％(v/v)FBS的DMEM溶液中培养。培养12h后，用含有PBS的空白DMEM以及含有相同浓度姜黄素的粗混悬液(即实施例1中，粗混悬A)和最佳处方制备所得姜黄素纳米晶(CNs)(表2)的DMEM替换培养基(即，将实施例1获得粗混悬A和最佳处方制备所得姜黄素纳米晶分别经DMEM进行稀释至36.8μg/mL)，并与LPS充分混合，分别记作LPS+PBS组、LPS+CUR组和LPS+CNs组；混合后各组中LPS的终浓度为0.5μg/mL，以未经过处理的上述细胞作为对照，按照上述培养条件继续培养24h后，用ELISA试剂盒测定上清液中的TNF-α和IL-6的浓度。为分析活性氧(ROS)的水平，用PBS洗涤上述细胞，并用10μM的DCFH-DA进行处理。孵育30min后，PBS洗涤细胞去以除游离的DCFH-DA，使用IX71倒置荧光显微镜进行观察。
RAW 264.7细胞的显微图像如图5所示，正常巨噬细胞体积小，多呈圆形或椭圆形。而经LPS刺激24h后，细胞形态发生明显变化，如细胞体积变大、形状由圆形变为纺锤形。而LPS+CUR组和LPS+CNs组的巨噬细胞，体积增加和形状变化被有效抑制，这表明CUR和CNs都可以抑制炎症。但与LPS+CUR组相比，LPS+CNs组的细胞形态更规则，梭形细胞较少，说明CNs的抗炎作用更强。
炎症因子失衡是炎症反应的主要标志。检测了TNF-α和IL-6的浓度，来进一步评估药物的抗炎作用。结果如图6所示，LPS+CUR组的细胞中IL-6浓度显着降低，而TNF-α的浓度与LPS+PBS组相似，表明抗炎作用有限。而LPS+CNs组的TNF-α和IL-6水平均显着降低。因此，与CUR相比，CNs的抗炎作用更显着。
ROS的含量与炎症的严重程度呈正关。ROS的荧光图如图7所示，结果表明，对照组几乎没有ROS。而在LPS+PBS组的细胞中，观察到较高浓度的ROS，这表明细胞处于炎症状态。虽然LPS+CUR组和LPS+CNs组中，均观察到ROS有所减少，但LPS+CNs组的ROS表达显著低于LPS+CUR组，进一步验证了CNs的抗炎作用优于CUR。
7)姜黄素核壳纳米粒子的体内抗炎活性
为考察姜黄素核壳纳米粒子的体内抗炎活性，连续给小鼠喂食6天含有3％DSS的饮用水以建立小鼠溃疡性结肠炎模型(UC模型组)。将溃疡性结肠炎小鼠随机分成5组(n＝5)：UC模型组(不给予任何药物治疗)、CUR组(按小鼠体重给予100mg/kg姜黄素粗混悬液，即实施例1中，粗混悬A)、CNs组(按小鼠体重给予100mg/kg姜黄素纳米晶，即按表2最佳处方制备所得姜黄素纳米晶)、CNs@EPO组(按小鼠体重给予100mg/kg只经EPO包覆的姜黄素纳米粒子(CNs@EPO))、CNs@EPO@L100组(按小鼠体重给予100mg/kg双层包覆的姜黄素纳米粒子(CNs@EPO@L100)，即按表4制备所得姜黄素纳米粒子(CNs@EPO@L100))。以喂食不含DSS饮用水的小鼠作为对照组。记录每组小鼠的疾病活动指数评分(DAI)。治疗5天后，处死小鼠，收集结肠以进一步评估结肠炎的严重程度。
各组小鼠的体重如图8所示，UC模型组的小鼠体重减轻最为明显，CUR组、CNs组、CNs@EPO组和CNs@EPO@L100组的小鼠体重显著高于UC模型组，但CNs@EPO@L100组的小鼠体重减轻最少。这表明，CNs@EPO@L100具有较好的治疗结肠炎的效果。DAI评分结果如图9所示，对照组小鼠的DAI评分相对稳定，UC模型组的小鼠DAI评分逐渐增加(第5天达到最大值，评分为12)。而用CNs@EPO@L100治疗的小鼠的DAI评分显着低于UC模型组，表明炎症得到明显抑制。
结肠的长度与UC的严重程度成反比。测量结肠长度以进一步评估UC水平(图10)。对照组中，健康小鼠的结肠长度约为9.1cm。UC模型组的结肠长度缩短至7.0cm。在口服CNs治疗的小鼠中，结肠长度与UC模型组小鼠相似(分别为～7.0和～7.7cm)。而口服CNs@EPO@L100后，结肠长度明显高于UC模型组，表明结肠炎得到了有效缓解。

Claims (9)

1.一种姜黄素核壳纳米粒子，其特征在于：核壳纳米粒子为球形，内核为块状姜黄素纳米晶，壳为含敏感聚合物；其中，内核占姜黄素核壳纳米粒子质量的60-95％；敏感聚合物为按质量比为1：0.1-5的酸敏感聚合物和碱敏感聚合物。
2.如权利要求1所述的姜黄素核壳纳米粒子，其特征在于：所述粒子中按质量百分比计，姜黄素60-90％、稳定剂0.1-10％、酸敏感聚合物1-10％、碱敏感聚合物1-20％、余量为磷酸盐；所述酸敏感聚合物选自壳聚糖及丙烯酸树脂EPO中的一种或多种；所述碱敏感聚合物选自海藻酸钠、透明质酸钠、丙烯酸树脂L100中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的姜黄素核壳纳米粒子，其特征在于：所述的稳定剂为泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯、聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯、聚氧乙烯(35)蓖麻油、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯以及卵磷脂中的一种或多种。
4.一种如权利要求1所述的姜黄素核壳纳米粒子的制备方法，其特征在于，
1)将姜黄素分散于溶剂中，在磁力搅拌下混合均匀，得粗混悬液A；
2)将稳定剂经磁力搅拌分散于步骤(1)得到的粗混悬液中，得粗混悬液B，而后研磨，即得的姜黄素纳米晶；
3)将酸敏感聚合物溶解在磷酸盐缓冲液中，得溶液C；
4)将步骤2)所得的姜黄素纳米晶与溶液C混合，并在恒温下孵育，得混悬液D，将混悬液D冻干，得粉末E；
5)将碱敏感聚合物溶解在磷酸盐缓冲液中，得溶液F；
6)将步骤4)所得的粉末E与步骤5)所得的溶液F于磁力搅拌下混合均匀，并在恒温下孵育，得混悬液G，混悬液G冻干，得到具有pH依赖性的姜黄素核壳纳米粒子。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中研磨为将粗混悬液B加入到含有二氧化锆研磨珠的研磨罐中，再将研磨罐放入行星式球磨机中研磨，其中，二氧化锆研磨珠与粗混悬液B的体积比为1:0.1-1:1.5；行星式球磨机的转速为20-35Hz，研磨时间为1-10min，冷却时间为2-5min，总研磨时间设置为1-6h。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，磷酸盐缓冲液pH值为1-5，所述步骤5)中，磷酸盐缓冲液pH值为6-8。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)和步骤6)中，恒温温度为37℃，孵育时间为2h。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)及步骤6)中，冻干的条件为：预冻温度为-50℃—-25℃，预冻时间为4-10h，然后置于冷冻干燥设备中，在-5—10℃温度下冻干18-24h。
9.一种如权利要求1所述的姜黄素核壳纳米粒子的应用，其特征在于，
所述的姜黄素核壳纳米粒子在作为靶向溃疡性结肠炎的药物中的应用。
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