CN114376987A - 用于治疗溃疡性结肠炎的结肠靶向纳米粒及其制备方法 - Google Patents

用于治疗溃疡性结肠炎的结肠靶向纳米粒及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114376987A
CN114376987A CN202111489518.2A CN202111489518A CN114376987A CN 114376987 A CN114376987 A CN 114376987A CN 202111489518 A CN202111489518 A CN 202111489518A CN 114376987 A CN114376987 A CN 114376987A
Authority
CN
China
Prior art keywords
colon
aminosalicylic acid
sodium alginate
solution
chitosan
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111489518.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114376987B (zh
Inventor
胡容峰
邵良玉
王楠
方文悠
高松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Original Assignee
Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM filed Critical Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Priority to CN202111489518.2A priority Critical patent/CN114376987B/zh
Publication of CN114376987A publication Critical patent/CN114376987A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114376987B publication Critical patent/CN114376987B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/60—Salicylic acid; Derivatives thereof
    • A61K31/606—Salicylic acid; Derivatives thereof having amino groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5138—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyvinyl pyrrolidone, poly(meth)acrylates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于治疗溃疡性结肠炎的结肠靶向纳米粒及其制备方法，该制备方法包括：将海藻酸钠溶液滴加至5‑氨基水杨酸溶液中，制备海藻酸钠包覆5‑氨基水杨酸纳米晶；将壳聚糖溶液滴加至海藻酸钠包覆5‑氨基水杨酸纳米晶中，超声孵育后离心收集，得到壳聚糖包覆5‑氨基水杨酸纳米晶；将壳聚糖包覆5‑氨基水杨酸纳米晶悬浮在海藻酸钠溶液中，超声孵育后离心收集，得到壳聚糖‑海藻酸钠包覆5‑氨基水杨酸纳米晶；将壳聚糖‑海藻酸钠包覆5‑氨基水杨酸纳米晶在
Figure DDA0003397859580000011
S100溶液中超声孵育，得到5‑氨基水杨酸结肠靶向纳米粒。通过以上步骤制备得到的5‑氨基水杨酸结肠靶向纳米粒可以避免药物在胃肠道上部(胃和小肠)的释放，而在结肠环境中持续缓慢释放。

Description

用于治疗溃疡性结肠炎的结肠靶向纳米粒及其制备方法
技术领域
本发明属于医药工程的药物制剂领域，特别涉及一种用于治疗溃疡性结肠炎的结肠靶向纳米粒及其制备方法。
背景技术
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种原因尚不十分明确的慢性非特异性炎症性肠病。临床以腹痛、腹泻、体重减轻、黏液脓血便为特征。目前认为溃疡性结肠炎的病因主要与免疫、遗传、感染、饮食及精神等多种因素相互作用的结果，核心以肠屏障功能障碍、肠道共生微生物失衡和肠道免疫反应失调有密切关联，最终导致严重的炎症反应。近年来，随着生活方式的现代化和环境的暴露，UC的发病率和患病率迅速上升，且趋于年轻化。
5-氨基水杨酸(5-ASA)是治疗溃疡性结肠炎的一线药物，已被广泛用于治疗轻、中度和活动性UC。据报道，其主要作用部位为肠道黏膜发生炎症的区域，作用机制为通过抑制结肠黏膜炎症介质(白三烯、前列腺素)和促炎性细胞因子的合成与释放，抑制炎性细胞的黏附、迁移和抗炎作用，并可清除活性氧自由基等损伤因子，达到治疗炎症的效果。尽管5-ASA对UC有效，但其治疗效果由于其水溶性差和溶解度低而受到很大限制。此外，5-ASA口服常规剂型在上肠区吸收迅速、广泛而需要非常大剂量的5-ASA来进行治疗增加了副作用的表现以及伴随腹泻影响在肠道滞留时间短，并导致在结肠区域药物局部浓度低，因此治疗UC的疗效较低为了提高药物的疗效，改善药物的溶解性及有效递送5-ASA至结肠区域是至关重要的。
纳米结晶是由纯药物粒子加入少量表面活性剂或聚合物为稳定剂，将药物颗粒分散在水中，通过自组装技术或破碎技术制备的一种亚微胶体分散系，粒径一般为10～1000nm。这种技术可以降低药物的粒径，增加难溶性药物的饱和溶解度和溶出速度，可将其制备成适合不同给药途径的药物制剂，增大载药量、减小给药剂量和频率，提高生物利用度。然而，单纯的药物纳米晶颗粒小，表面积大，易导致药物过早泄漏，会降低药物的治疗效果，导致不良的副作用。如何防止药物纳米晶在胃肠道上部迅速溶解，从而最大限度地增加药物与发炎结肠组织之间的接触并促进其在近端结肠中的释放是必须解决的问题。
口服结肠靶向给药系统(Oral colon-target drug delivery system，OCDDS)是通过药物传递技术使药物口服后在上消化道不释放，而被输送至回盲部后在结肠部位释放而发挥局部或全身疗效作用的一种新型定位给药系统。OCDDS能显著增强局部疗效，降低不良反应，弥补了许多传统口服制剂的不足，在许多胃肠道疾病如溃疡性结肠炎、克恩罗病、结肠癌等的治疗上有广阔的应用前景。
设计核-壳纳米粒子是众多正在研究的降低纳米粒子药物溶出速率的策略之一。核-壳纳米颗粒是一类纳米结构材料，由不同的聚合物材料制成外壳包围的内部核结构，其关键特征包括高载药效率和受控的药物释放。逐层(Layer-by-Layer，LbL)自组装技术主要利用带相反电荷的聚电解质之间的静电相互作用时聚电解质相互覆盖到纳米载体表面，从而增强其稳定性、细胞摄取、药物释放调控和靶向能力。通过反向电荷聚合电解质的多层交替沉积，载药载体和药物微晶以避免在到达结肠之前，胃肠道(GIT)上部中的药物的初始释放，从而减少了全身性副作用并增加了结肠中的药物利用率。
因此，本发明旨在通过自组装技术制备一种结肠靶向纳米粒，能够有效治疗溃疡性结肠炎，该药物制剂能够减少药物在胃和小肠的释放，而在结肠环境中实现持续缓慢的释放药物。
发明内容
针对上述问题，本发明制备得到一种结肠靶向纳米粒，该结肠靶向纳米粒由活性成分、可生物降解性聚合物材料和pH敏感型肠溶材料组成；所述活性成分为5-氨基水杨酸，所述可生物降解性聚合物材料为海藻酸钠和壳聚糖，所述pH敏感型肠溶材料为
Figure BDA0003397859560000021
S100，所述
Figure BDA0003397859560000022
S100为甲基丙烯酸和丙烯酸甲酯的阴离子共聚物。
进一步地，海藻酸钠粘度为25-675cps；壳聚糖分子量为10000-300000Da。
进一步地，所述结肠靶向纳米粒为核壳结构。
进一步地，所述结肠靶向纳米粒的平均粒径为350-355nm，多分散系数为0.233-0.259，Zeta电位为-37.6mV～-34.92mV。
进一步地，所述结肠靶向纳米粒载药量和包封率分别为85.05％-94.31％、89.68-95.05％。
进一步地，所述结肠靶向纳米粒为口服结肠靶向制剂。
本发明还提供了上述制备得到的结肠靶向纳米粒在制备治疗结肠炎的药物中的应用。
此外，本发明还涉及上述结肠靶向纳米粒的制备方法，所述结肠靶向纳米粒通过以下步骤制备：
S1：将海藻酸钠溶液滴加至5-氨基水杨酸溶液中，制备海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶；
S2：将壳聚糖溶液滴加至海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶中，超声孵育后离心收集，得到壳聚糖包覆5-氨基水杨酸纳米晶；
S3：将壳聚糖包覆5-氨基水杨酸纳米晶悬浮在海藻酸钠溶液中，超声孵育后离心收集，得到壳聚糖-海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶；
S4：将壳聚糖-海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶在
Figure BDA0003397859560000031
S100溶液中超声孵育，得到5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒。
进一步地，壳聚糖、海藻酸钠和
Figure BDA0003397859560000032
S100溶液中交替多次包覆在5-氨基水杨酸纳米晶上。
进一步地，步骤S1中，5-氨基水杨酸溶液制备步骤为：将一定质量的5-氨基水杨酸溶解于二甲基亚砜中，制备得到浓度为0.5mg/mL～10mg/mL 5-氨基水杨酸溶液；海藻酸钠溶液制备步骤为：将一定质量的海藻酸钠溶解于纯水中，制备得到浓度0.06mg/mL～1.8mg/mL的海藻酸钠溶液。
进一步地，步骤S1中，5-氨基水杨酸与海藻酸钠质量比为3:1-10:1；二甲基亚砜与纯水体积比为1:1-1:12。
进一步地，步骤S1-S3中超声孵育时间为0-60min，离心时间为0-20min；步骤S4中超声孵育时间为0-60min。
进一步地，步骤S1中制备得到海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶后透析纯化除去二甲基亚砜溶剂。
进一步地，步骤S1中制备得到海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶粒径为183-189nm，多分散系数为0.176，表面电荷为-26.98～-25.62mV；载药量和包封率分别为94.31％、89.68％。
进一步地，步骤S1-S4中，超声孵育后用NaCl洗涤多次。
通过以上步骤制备得到的5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒可以避免药物在胃肠道上部(胃和小肠)的释放，而在结肠环境中持续缓慢释放。纳米粒的外壳能够根据pH触发的表面电荷反转特性将表面电荷从胃肠道(GIT)上部中的负电荷改变为结肠中的正电荷，从而使它们能够与结肠粘膜中带负电荷的粘蛋白相互作用，从而可以增强纳米粒在发炎的结肠组织中的粘附和积聚，可以发挥良好的治疗效果。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了不同包覆层数的AG/CS/ES多层膜包衣后的5-氨基水杨酸纳米粒的体外释放图(mean±SD，n＝6)；
图2示出了5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒(ES1CS5AG5@5-ASANCs)的pH依赖性粒径和表面电荷逆转变化图(mean±SD，n＝6)；
图3示出了5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒(ES1CS5AG5@5-ASANCs)的透射电镜图；
图4示出了不同样品的差示扫描量热分析图；
图5示出了不同样品的傅里叶变换红外光谱分析图：
图6示出了小鼠给药后2、4、6、12和24小时AG1@DiRNC，CS5AG6@DiRNC和ES1CS5AG5@DiRNC的胃肠道生物分布的IVIS图像(Mean±SD，n＝15)；
图7示出了各组实验小鼠造模期间及经纳米粒治疗过程中症状缓解和疾病进展的评估(Mean±SD,n＝8)；
图8示出了各实验组小鼠宏观炎症指标评估示意图；
图9示出了H&E染色评估结肠组织的组织学示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
壳聚糖(CS)是一种天然的聚阳离子多糖，是从甲壳类动物的外骨骼提取的几丁质脱乙酰化而获得的聚合物，它无毒、生物相容性好、粘黏、可生物降解，可被结肠细菌消化，还具有抗肿瘤，抗炎，抗氧化作用而备受追捧。这些性质使CS成为制备结肠特异性给药系统的良好候选材料。此外，CS能够通过其NH3 +基团与多种阴离子底物结合相互作用可以自组装成纳米粒子并形成药物载体，在生物材料领域得到了广泛的应用。壳聚糖在多层膜的外层与黏液层相互作用可以提供黏附作用，使纳米粒粘附在肠上皮膜上。
海藻酸钠(AG)是一种亲水性阴离子多糖，同样具有生物相容性、生物降解性、pH敏感性以及良好的粘附性。这些优势使AG成为一种有吸引力的生物材料，用于药物输送和靶向一系列给药途径，特别是靶向药物输送对于结肠靶向和UC治疗是非常理想的。
Figure BDA0003397859560000061
S100(ES)是一种基于甲基丙烯酸和丙烯酸甲酯的阴离子共聚物，是一种pH敏感的聚合物，在pH值低于7时不溶；因此，它被广泛用作口服结肠靶向药物递送系统的包衣材料。为了保护药物和纳米载体在胃内的pH条件下不被降解，并对结肠上皮进行定向和局部的传递，ES被用作药物载体上的肠溶聚合物实现结肠靶向性。
本发明实施例中，提供一种治疗溃疡性结肠炎的结肠靶向纳米粒，其由活性组分、可生物降解性聚合物材料和pH敏感型肠溶材料组成，活性组分选用广泛用于溃疡性结肠炎的抗炎药物5-氨基水杨酸；可生物降解性聚合物材料所述的可生物降解的聚合物选自如下两种：粘度为25cps的海藻酸钠(AG)；分子量为10000Da的壳聚糖(CS)。
本发明实施例中，5-氨基水杨酸原料药购买于牡丹江恒远药业股份有限公司；所使用粘度为25cps的海藻酸钠(AG)购自青岛南山生物科技有限公司；分子量为10000Da的壳聚糖(CS)购自合肥博美生物科技有限公司；
Figure BDA0003397859560000062
S100(ES)购自德国Evonik公司；市售美沙拉嗪缓释颗粒(Etiasa Mesalasize)购自上海爱的发制药有限公司；所使用的测试仪器透射电子显微镜购自日本日立公司(HITACHI-HT7800)；差示扫描量热分析仪购自梅特勒-托利多公司(DSC214)；傅里叶变换红外光谱分析购自XX公司(FTIR-650)；IVIS光谱成像系统购自美国珀金埃尔默有限公司(IVIS Spectrum)。
本发明实施例中，利用反溶剂沉淀法制备5-氨基水杨酸纳米晶核，为防止纳米晶的聚集，并将少量聚合物AG加入反溶剂中起到稳定包衣的作用；再利用CS/AG/ES多层聚电解质超声波辅助处理，逐层自组装获得5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒，并考察其体外释放结果。反溶剂沉淀法制备5-氨基水杨酸纳米晶核，基本包括4个步骤：药物的溶解、含海藻酸钠的反溶剂配制、海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶核的制备和有机溶剂的去除。后续利用逐层自组装技术使壳聚糖、海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶核，自组装基本包括4个步骤：药物的溶解、聚电解质溶液的加入、超声孵育、离心和洗涤以及pH敏感型肠溶材料
Figure BDA0003397859560000071
S100包衣等操作得到5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒。
具体地，5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒的制备方法通过下述实施例中的步骤可以获得：
(1)5-氨基水杨酸药物溶液的制备：精密称取60mg的5-ASA原料药溶于10mL二甲基亚砜(DMSO)中，室温下磁力搅拌至完全溶解，得到含5-ASA质量浓度为6mg/mL的DMSO溶液，记为5-ASADMSO溶液；
(2)含海藻酸钠的反溶剂溶液制备：称取12mgAG溶于100mL的纯水中，室温下磁力搅拌至完全溶解，配置得到浓度为0.12mg/mL的AG溶液；
一般来说，有机相与水相的体积比会影响纳米混悬液的粒径大小，水相体积比例升高，药物过饱和度增大，纳米混悬液的粒径减小；水体积比例较低时，高浓度的有机相会引诱纳米颗粒的再生长，最终会导致纳米混悬液的粒径增大。当有机相与水相的体积达到一定范围时，受成核率和动力学的影响，纳米混悬液的粒径降至最小，继续升高水体积比例粒径则会再度增大。
本发明中，溶剂(水)与反溶剂(二甲基亚砜)体积比为1:8时，纳米晶粒径和PDI(多分散系数)最小，分布更窄更均匀，当体积比超过1:8时，PDI值又有增加趋势，所以综合比较选择溶剂与反溶剂体积比(DMSO:水)为1:8最佳。
上述步骤(1)和步骤(2)中，控制DMSO与纯水的体积比的合适范围为1:1～1:12。
(3)海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶核的制备：将步骤(1)制备得到的5-ASADMSO溶液注入10mL注射器中，在磁力搅拌器搅拌速度为600rpm下利用注射泵将其以0.5mL/min的速度滴加到步骤(2)制备得到的0.12mg/mL的AG溶液中，得海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶(记为AG1@5-ASANCs)；
(4)有机溶剂的去除：利用透析袋(MW：1000Da)透析纯化除去有机溶剂DMSO；
将上述步骤(1)至步骤(4)获得AG1@5-ASANCs平行制备3份，分别测定其平均粒径、PDI和Zeta电位，结果制备的AG1@5-ASACs的平均粒径为(186.20±2.73)nm，PDI为0.176，表面电荷为(-26.30±0.68)mV，载药量和包封率分别为94.31％、89.68％；且在实验中观察制备的AG1@5-ASANCs悬浮液由于丁达尔现象，呈半透明，带淡蓝色乳光，且实验操作重现性好且稳定。
上述纳米粒载药量(loadingefficiency；LD％)采用直接法进行测试。精密称取制备后5mg纳米粒冻干粉，加入适量的pH为7.2的PBS缓冲液和甲醇溶液，超声处理30min，再于37℃下恒温振荡过夜使完全溶胀药物溶解，将获得的混合物在5000rmin-1转速离心20min测定上清液的药物含量，并按照公式(1)计算载药率。
LD％＝(投药量-游离药物量)/制剂质量 (1)
其中，制剂质量为药物和辅料的总质量。
包封率(encapsulation efficiency；EE％)采用间接法进行纳米粒测定。取制备后的10mL纳米混悬剂放入超滤离心管(1000Da)的过滤装置内，以5000r·min-1转速离心20min后取外管离心液进行含量测试，计算游离药物的含量，并按照公示(2)计算包封率。
EE％＝(投药量-游离药物量)/投药量 (2)
(5)采用逐层自组装技术进行多层聚电解质包覆：
①一次涂覆
将上述步骤制备得到中的AG1@5-ASANCs加入含质量浓度0.05％NaCl 6mg/mL的CS溶液中，超声孵育30min，在磁力搅拌器搅拌速度为16000rpm下离心20min后收集，用质量浓度0.05％NaCl洗涤3次以去除多余的CS，得到壳聚糖一次包覆的5-氨基水杨酸纳米晶核，记为CS1AG1@5-ASANCs；
制备得到的CS1AG1@5-ASANCs悬浮在6mg/mL ES溶液(ES溶解于pH为7.4的PBS缓冲液)中孵育20min，用质量浓度为0.05％NaCl洗涤3次，得到包衣材料ES的一次涂覆后的5-氨基水杨酸纳米晶核，记为ES1CS1AG1@5-ASANCs；
②二次涂覆
将CS1AG1@5-ASANCs加入含质量浓度为0.05％NaCl 6mg/mL的AG溶液中，超声孵育30min，在磁力搅拌器搅拌速度为16000rpm下离心20min收集，用0.05％NaCl洗涤3次以去除多余的AG，得到海藻酸钠二次包覆的5-氨基水杨酸纳米晶核，记为CS1AG2@5-ASANCs；
将CS1AG2@5-ASANCs加入含质量浓度为0.05％NaCl 6mg/mL的CS溶液中，超声孵育30min，在磁力搅拌器搅拌速度为16000rpm离心20min收集，用质量浓度为0.05％NaCl洗涤3次以去除多余的CS，得到壳聚糖二次包覆的5-氨基水杨酸纳米晶核，记为CS2AG2@5-ASANCs；
将CS2AG2@5-ASANCs悬浮在6mg/mL ES溶液(ES溶解于pH为7.4的PBS缓冲液中)中孵育20min，用质量浓度为0.05％NaCl洗涤3次，得到包衣材料ES的二次涂覆后的5-氨基水杨酸纳米晶核，记为ES1CS2AG2@5-ASANCs；
③三次涂覆
将CS2AG2@5-ASANCs加入含质量浓度为0.05％NaCl 6mg/mL的AG溶液中，超声孵育30min，在磁力搅拌器搅拌速度为16000rpm离心20min收集CS2AG3@5-ASANCs，用质量浓度为0.05％NaCl洗涤3次以去除多余的AG，得到海藻酸钠三次包覆的5-氨基水杨酸纳米晶核，记为CS2AG3@5-ASANCs；
将CS2AG3@5-ASANCs加入含质量浓度为0.05％NaCl 6mg/mL的AG溶液中，超声孵育30min，在磁力搅拌器搅拌速度为16000rpm离心20min收集，用质量浓度为0.05％NaCl洗涤3次以去除多余的AG，得到壳聚糖三次包覆的5-氨基水杨酸纳米晶核，记为CS3AG3@5-ASANCs；
将CS3AG3@5-ASANCs悬浮在6mg/mL ES溶液(ES溶解于pH为7.4的PBS缓冲液中)中孵育20min，用质量浓度为0.05％NaCl洗涤3次，得到包衣材料ES的三次涂覆后的5-氨基水杨酸纳米晶核，记为ES1CS3AG3@5-ASANCs；
④四次涂覆
将CS3AG3@5-ASANCs加入含质量浓度为0.05％NaCl 6mg/mL的AG溶液中，超声孵育30min，在磁力搅拌器搅拌速度为16000rpm离心20min后收集，用0.05％NaCl洗涤3次以去除多余的AG，得到海藻酸钠四次包覆的5-氨基水杨酸纳米晶核，记为CS3AG4@5-ASANCs；
将CS3AG4@5-ASANCs加入含质量浓度为0.05％NaCl 6mg/mL的CS溶液中，超声孵育30min，在磁力搅拌器搅拌速度为16000rpm离心20min后收集，用质量浓度为0.05％NaCl洗涤3次以去除多余的CS，得到壳聚糖四次包覆的5-氨基水杨酸纳米晶核，记为CS4AG4@5-ASANCs；
将CS4AG4@5-ASANCs悬浮在6mg/mL ES溶液(ES溶解于pH为7.4的PBS缓冲液中)中孵育20min，用质量浓度为0.05％NaCl洗涤3次，得到包衣材料ES的四次涂覆后的5-氨基水杨酸纳米晶核，记为ES1CS4AG4@5-ASANCs；
⑤五次涂覆
将CS4AG4@5-ASANCs加入含质量浓度为0.05％NaCl 6mg/mL的AG溶液中，超声孵育30min，在磁力搅拌器搅拌速度为6000rpm离心20min后收集，用质量浓度为0.05％NaCl洗涤3次以去除多余的AG，得到海藻酸钠五次包覆的5-氨基水杨酸纳米晶核，记为CS4AG5@5-ASANCs；
将CS4AG5@5-ASANCs加入含质量浓度为0.05％NaCl 6mg/mL的CS溶液中，超声孵育30min，在磁力搅拌器搅拌速度为16000rpm离心20min后收集，用质量浓度为0.05％NaCl洗涤3次以去除多余的CS，得到壳聚糖五次包覆的5-氨基水杨酸纳米晶核，记为CS5AG5@5-ASANCs；
将CS5AG5@5-ASANCs悬浮在6mg/mL ES溶液(ES溶解于pH为7.4的PBS缓冲液中)中孵育20min，用质量浓度为0.05％NaCl洗涤3次，得到包衣材料ES的五次涂覆后的5-氨基水杨酸纳米晶核，记为ES1CS5AG5@5-ASANCs。
以上制备过程每交替一次循环涂覆海藻酸钠和壳聚糖后均进行一层包衣材料的涂覆，而最终进行第五个循环时，即交替5次完成海藻酸钠和壳聚糖的涂覆后再进行一次包衣材料ES的涂覆，得到5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒(即ES1CS5AG5@5-ASANCs)，利用真空冷冻干燥机对纳米悬浮液进行冷冻干燥24～48h，并储存在4℃下供后续使用。
将5-氨基水杨酸纳米粒放入恒温水浴摇床中，测定不同时间点药物的累计释放量(％)，测试结果如图1所示。从测试结果来看，本发明实施例制备得到ES1CS5AG5@5-ASANCs可以使药物在前5h(pH为1.2和6.8)内释放量不到20％。当pH值提高到7.4，持续释放了约60％的5-ASA。
将5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒悬浮于不同pH值缓冲液中，研究纳米粒的粒径变化和pH依赖电荷反转特性，测试结果如图2所示。结果发现上述制备的ES1CS5AG5@5-ASANCs在pH为1.2和6.8时颗粒尺寸没有明显变化，在pH 7.4时尺寸明显增大，此时ES层溶解，聚电解质开始溶胀。此外，ES1CS5AG5@5-ASANCs在酸性条件下(pH为1.2和6.8)由于ES层的存在而始终保持着表面负电荷，而在碱性(pH 7.4)下孵育后，由于ES的溶解和核心的暴露，表面电荷变为正电荷。
测定上述通过自组装技术制备的5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒的平均粒径、PDI和Zeta电位，结果发现其平均粒径为(352.40±2.26)nm，PDI为0.246±0.013，Zeta电位(-36.26±1.34)mV，载药量和包封率分别为85.73％、95.05％。
可以看出，自组装之后制备的5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒与步骤(1)-(4)中自组装之前制备的5-氨基水杨酸纳米晶相比，纳米晶的粒径、PDI、电位均发生变化，原因是由于自组装后随着涂层的增加变厚，粒子变大，粒径和PDI有增加趋势，同时经过涂层多层包覆，外壳包裹越来越厚实，从而减少了核心药物的泄露使得包封率也逐渐增加。而纳米粒的载药量随着涂层增加而略有降低，这可能是由于ES/CS/AG层沉积后核壳纳米粒的重量大大增加所致。
上述制备的5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒(ES1CS5AG5@5-ASANCs)，利用透射电子显微镜观察发现纳米粒呈类球形状且具有核-壳结构，结果如图3所示。
将上述制备的AG1@5-ASANCs、ES1CS5AG5@5-ASANCs分别进行了DSC(差示扫描量热)分析。称取5-ASA原料药、AG、CS、ES、物理混合物(5-ASA原料药、AG、CS、ES辅料的简单混合)、AG1@5-ASANCs和ES1CS5AG5@5-ASANCs各10mg粉末样品分别填充于铝坩埚中，以空白铝坩锅作为参比物，气氛氮气的流速为20.0mL/min，在20～320℃范围内升温扫描，扫描速度为10.0℃/min，得到差示扫描量热曲线，结果如图4所示。图4中，(a)表示样品5-ASA；(b)表示样品AG；(c)表示样品CS；(d)表示样品ES；(e)表示物理混合物；(f)表示样品AG1@5-ASANCs；(g)表示样品ES1CS5AG5@5-ASANCs。由图4中，DSC热分析图(a)中得出纯药物5-ASA在285.113℃附近出现一个尖锐的吸热峰，对应于5-ASA的熔点和反映了药物的结晶性质。图(b)出现AG玻璃化转变温度和在244℃时出现较宽的放热峰；图(c)出现CS玻璃化转变温度和在193℃时出现较宽的放热峰；图(d)出现ES玻璃化转变温度和在温度为219℃时出现较宽的吸热峰；图(e)物理混合物均出现AG和CS产生的放热峰，代表其中聚合物残留水分的蒸发和聚合物的分解以及出现药物5-ASA的吸热峰，但位置稍有左移提前；图(f)AG1@5-ASANCs相同温度位置出现药物5-ASA的吸热峰，代表在AG1@5-ASANCs中5-ASA是以结晶的形式存在的，同样图(g)中ES1CS5AG5@5-ASANCs仍然存在药物5-ASA的吸热峰，说明药物5-ASACs经过AG和CS以及ES层层涂覆后仍然以结晶的形式存在，其结晶状态不受LBL涂覆工艺的影响。相比于纯药物5-ASA和AG1@5-ASANCs，ES1CS5AG5@5-ASANCs吸热熔融峰强度有所降低，这可能是由于5-ASA溶解到载体中和/或加热引起的固态相互作用以及聚合物的稀释作用所致。
将上述制备的ES1CS5AG5@5-ASANCs进行了傅里叶变换红外光谱分析用来检测各组分之间有无相互作用。称取5-ASA原料药、AG、CS、ES、物理混合物、空白样品和ES1CS5AG5@5-ASACs粉末样品粉末作为待测样品，按1∶100的比例取待测样品与干燥的KBr研细混匀后压片；用红外光谱仪在500～4000cm-1波数范围内分析扫描，扣除背景吸收值，得出测定样品的红外谱图，结果如图5所示。图5中，(a)表示样品5-ASA；(b)表示样品AG；(c)表示样品CS；(d)表示样品ES；(e)表示样品5-ASA与辅料AG、CS、ES的物理混合物；(f)表示样品空白样品(不含药物)；(g)表示样品ES1CS5AG5@5-ASANCs。图5(a)5-ASA红外光谱中，3450cm-1附近处为N-H和O-H伸缩振动吸收峰，在1650cm-1处发生-COOH伸缩振动，1616cm-1处为-NH2伸缩振动，1351cm-1和1351cm-1处分别为C-N和-OH伸缩振动；图(b)海藻酸钠红外光谱中，3394cm-1附近处为N-H和O-H伸缩振动吸收峰，在2942cm-1处发生C-H伸缩振动，1608cm-1和1440cm-1处为C＝O的对称和不对称振动吸收峰，1313cm-1处分别为C-O伸缩振动；图(c)壳聚糖在3470cm-1为N-H和O-H的伸缩振动，分别在1620cm-1和1530cm-1处有酰胺Ⅰ带C＝O和酰胺Ⅱ带C＝O的特征吸收峰，1320cm-1处有N-H的伸缩振动峰，1420cm-1处有-COCH3的伸缩振动峰，在1160cm-1、1020cm-1和891cm-1处对应于壳聚糖的吡喃糖环特征吸收峰；图(d)S100在3479cm-1出现O-H伸缩振动，在1727cm-1和1492cm-1有C＝O的伸缩振动峰；图(e)5-ASA与辅料的物理混合物分别在3380cm-1、2996cm-1、1727cm-1、1648cm-1、1353cm-1、1029cm-1和881cm-1出现辅料与药物的特征吸收峰，且位置并未明显变化；图(f)空白样品(不含药物)出现壳聚糖酰胺Ⅱ带的减弱，海藻酸钠和壳聚糖以及ES发生反应形成复合物。图(g)并未出现药物5-ASA的特征吸收峰，说明5-ASA、海藻酸钠、壳聚糖和ES之间存在相互作用(离子、氢和/或范德华力)，导致药物包载在三个聚合物载体材料组成的纳米粒中。药物嵌入到聚合物基质中会增加5-ASA分子内键的拉伸障碍，因此无法识别出5-ASA的特征峰。
通过以上步骤制备得到的5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒是一种口服结肠靶向制剂，可以避免药物在胃肠道上部(胃和小肠)的释放，而在结肠环境中持续缓慢释放。上述步骤制备得到的5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒对于溃疡性结肠炎的治疗效果将在以下内容中通过小鼠的体内实验加以证明。
将疏水性近红外染料(DiR)代替核心药物作为荧光探针负载到纳米粒包覆配方中，以相同的DiR浓度(1.5mgDiR/g，小鼠按平均体重30g计)和相同的制备工艺分别制备负载DiR染料的AG1@DiRNCs、CS5AG6@DiRNCs和ES1CS5AG5@DiRNCs。其中AG1@DiRNCs具体制备方法为：精密称取5mgDiR原料药溶于1mLDMSO中，得到含DiR质量浓度为5mg/mL的DMSO溶液；再称取1mgAG溶于10mL纯水中，室温下磁力搅拌至完全溶解；将DiRDMSO溶液注入10mL注射器中，在磁力搅拌器600rpm下利用注射泵将其以0.5mL/min的速度滴加到AG溶液中，得到DiR标记的AG1@DiRNCs悬浮液，并利用透析袋(MW：1000Da)透析纯化除去有机溶剂后冻干，得到AG1@DiRNCs。CS5AG6@DiRNCs的制备：将上述得到AG1@DiRNCs悬浮液加入含0.05％NaCl的CS溶液(5mg CS溶于10mL纯水，pH 5)中，超声孵育30min，制备得到由CS包覆的AG1@DiRNCs(CS1AG1@DiRNCs)。然后，以16000rpm离心20min收集CS1AG1@5-DiRNCs，用0.05％NaCl洗涤3次以去除多余的CS，然后再悬浮在与CS有相同质量浓度的含0.05％NaCl的AG溶液(pH为5)中，继续超声孵育，让AG包覆CS1AG1@DiRNCs，然后离心收集纳米晶并洗涤除去多余的AG，然后，重复上述涂覆工艺(交替CS和AG层，相同的洗涤步骤)，直到得到CS5AG6@DiRNCs。ES1CS5AG5@DiRCs的制备过程为：CS5AG5@DiRCs按上述CS5AG6@DiRNCs相同制备工艺，最后，将CS5AG5@DiRCs在ES溶液(5mgES溶解于10mL pH为7.4的PBS缓冲液中)中孵育20min，用0.05％NaCl洗涤三次，得到ES1CS5AG5@DiRCs悬浮液，利用真空冷冻干燥机对纳米悬浮液进行冷冻干燥；将经荧光标记的不同包覆层数的纳米粒子均分别悬浮于0.3mL蒸馏水中对小鼠进行灌胃给药。分别在口服给药后2h、4h、6h、12h和24h时对小鼠实施颈椎脱位处死，将其胃肠道于黑暗环境中收集摘除后平铺于黑色面板上，使用IVIS光谱成像系统离体观察5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒在小鼠GIT中的荧光信号分布。按DiR荧光标记物信号，分别在激发波长为748nm、发射波长为780nm时采集记录图像，结果如图6所示。在每个面板上，都可以看到一个袋子状的上部区域，它代表胃，小肠在中间呈蛇形。肠最后部分的膨大包括盲肠、结肠和直肠，称为大肠。负载DiR的AG1@DiRNCs和CS5AG6@DiRNCs在前6h即胃和小肠均显示强烈的荧光信号，在结肠段未见明显荧光信号。这表明，在到达结肠之前，最大限度的染料在胃和小肠被释放和吸收。在12h后，负载DiR的AG1@DiRNCs和CS5AG6@DiRNCs的荧光强度减弱消失，这表明染料逐渐被吸收或从GIT中清除。相比之下，负载DiR的ES1CS5AG5@DiRNCs仅在2h时在胃内有微弱的荧光可能是由于DiR少量存于纳米粒表面或从核心少量泄露导致，并无明显在胃和小肠大量释放现象。相反，在6h和12h时，负载DiR的ES1CS5AG5@DiRNCs均在盲肠和结肠显示出强烈的荧光信号，说明涂层在酸性条件下提供了体系的稳定性，使染料在到达结肠附近出现最大溶解和释放，体现了药物递送至结肠的特异性。此外，在结肠中24h时仍显示出微弱的荧光信号，纳米粒表面正电荷增加了与结肠带负电荷的黏蛋白相互作用以及载体材料壳聚糖和海藻酸钠本身所具有的良好的黏附性可能导致在结肠较长时间的滞留性。它暗示了制备的5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒(ES1CS5AG5@5-ASANCs)具有可克服过早在胃和小肠的核心药物的突然释放和ES层在pH>7时可特异性的溶解脱落而使药物缓慢持续释放于盲肠和结肠部位的特性。
取健康雄性SPF级Balb/c小鼠48只，平均体重约20-30g，在室温下适应性饲养一周，将小鼠随机分为6组，包括正常对照组、模型组、市售美沙拉嗪缓释颗粒(阳性药组)、AG1@5-ASANCs组、CS5AG6@5-ASANCs组和ES1CS5AG5@5-ASANCs组，每组各8只，每组饲养于同一鼠笼中；小鼠造模前禁食不禁水一天后，除正常对照组外，其余5组小鼠给予含3％(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液自由饮水进行溃疡性结肠炎造模，连续造模7天；造模成功后，除正常对照组和DSS模型组外，其余4组造模成功后分别于第8天开始每天灌胃给药治疗一次，连续治疗7天，溃疡性结肠炎小鼠每日的给药剂量为9.8mg/天。
在造模和治疗实验期间中对小鼠进行体重监测和疾病活动指数(DAI)评分评估。按表1所示小鼠DAI评分细则，将体重减轻、粪便稠度和隐血情况的评分相加后除以3，计算每只小鼠的DAI综合得分以评估疾病活动情况，以此评价疾病严重程度和研究给药组是否可以恢复结肠炎小鼠体重和缓解疾病状况，结果如图7所示。如图7(A)所示，在实验的前每组小鼠的体重都稳步增加。随后，小鼠经3％DSS处理7天诱导UC症状。健康组的小鼠在整个研究期间表现出恒定的DAI值，对照组小鼠的体重仍在稳步增加，表明结肠炎严重程度增加。与对照组相比，DSS造模后的小鼠体重显著下降，同时，DAI评分显著升高(图B)。与DSS模型组相比，在分别给药AG1@5-ASANCs和CS5AG6@5-ASANCs治疗七天后并没有明显改善体重减轻和DAI评分上升状况。而市售美沙拉嗪缓释颗粒(阳性药组)和ES1CS5AG5@5-ASANCs治疗组均缓解了体重下降，DAI评分均显著降低(P<0.01和P＜0.05)，市售美沙拉嗪缓释颗粒(阳性药组)DAI由3.4降至2.12，ES1CS5AG5@5-ASANCs DAI由3.4降至0.93(图C)，提示症状在一定程度上得到缓解。此外，还可以看出ES1CS5AG5@5-ASANCs优于阳性药市售美沙拉嗪缓释颗粒(阳性药组)，更能有效缓解DSS诱导的UC症状。
表1小鼠DAI评分表
Figure BDA0003397859560000161
表1中，正常大便为颗粒状成型大便；松散大便为不粘附于肛门的糊状、半成型大便；腹泻表示粘附在肛门周围的稀水样便。
便隐血的评价方法和指标如表2所示：滴加邻联甲苯胺溶液2～3滴于白瓷板上，再滴加过氧化氢溶液1～2滴，如不变色，立即挑取粪便少许与上述试剂混合，观察颜色变化，参照表2对便隐血情况进行评价。
表2便血程度评价表
Figure BDA0003397859560000162
Figure BDA0003397859560000171
在最后一次给药后结束后将小鼠禁食24小时后，将各组小鼠脱颈处死后迅速剖腹取结肠(从回盲肠交界处到肛门直肠交界处)，并用直尺测量结肠的长度，与正常组结肠长度进行比较。同时解剖小鼠，迅速打开腹腔和胸腔，拭干，小心取出脾脏称重，结果如图8所示。小鼠结肠组织较为细小，一般情况下较难观察到其溃疡散落点，常以其结肠组织局部充血红肿、肠壁增厚、结肠缩短为初步炎症观测指标。由于结肠炎会导致结肠萎缩，测量结肠长度有助于评估结肠炎的强度，所以在治疗结束时切除各组结肠。如图8所示，健康对照组(图8A)结肠长度约为11cm，模型组经DSS处理(图8B)未治疗可见结肠最短，约为6cm，且盲肠瓣严重缩小，降结肠出现肿大现象。与对照组相比，DSS组结肠长度明显减少(P<0.01)。经过治疗组七天治疗后AG1@5-ASANCs和CS5AG6@5-ASANCs组并没有明显改善结肠缩短，而ES1CS5AG5@5-ASANCs治疗后结肠最长，接近于正常组，其次是市售美沙拉嗪缓释颗粒(阳性药组)，说明ES1CS5AG5@5-ASANCs对结肠炎小鼠的治疗效果更佳。脾脏在内部免疫系统中起重要作用，脾脏重量增加是炎症的征兆。如图8(C)和(D)所示，健康对照组脾重为0.11g。DSS脾脏重显著增加(至0.19g)。对DSS诱导的结肠炎小鼠脾脏重量的评估清楚地表明，与正常健康组相比，DSS诱导的结肠炎小鼠脾重增加最大(P<0.01)，提示严重的全身炎症。治疗组的结肠炎严重程度降低，表现为脾脏重量下降其中以ES1CS5AG5@5-ASANCs治疗的脾脏重量下降最为显著(P<0.01)与健康对照组比较接近。
治疗7天后处死小鼠，切下大约1cm长的具有严重损伤的结肠组织样品，并用生理盐水冲洗结肠段，并立即置于4％多聚甲醛通用型组织固定液中于4℃保存48小时以固定组织，然后在分析级乙醇和二甲苯中脱水，然后将样品包埋在石蜡中。然后用冷冻切片机沿纵轴切开，制备厚度为4μm的薄片，并通过苏木精-伊红染色(H&E染色)，使用光学显微镜镜下观察染色切片的炎性细胞浸润到粘膜中情况，上皮变化和粘膜损伤情况，并进行拍照对比。根据上皮细胞形态、炎症细胞浸润情况等，以小鼠结肠病理组织学评分作为判断炎症程度的主要标准，参照表3所示的标准行盲法评分，结果如图9所示。如图9所示，对照组(图A)的结肠组织显示出正常的结肠组织学，结肠上皮无损伤，隐窝结构和杯状细胞完整没有炎症。然而，DSS组(图B)出现严重病变特点，包括结肠上皮细胞丢失，隐窝结构扭曲，黏膜缺损，形态不规则大量中性粒炎症细胞浸润，这些是炎症的主要症状，证实UC模型成功建立。经过AG1@5-ASANCs组和CS5AG6@5-ASANCs组治疗后并不能显著减轻炎症，仍出现严重的隐窝破坏、形态学改变、部分上皮坏死和大量炎症细胞浸润，这是因为AG1@5-ASANCs组和CS5AG6@5-ASANCs组并不能在结肠部位提供足够的有效药物浓度实现靶向释放而对DSS诱导的结肠炎的治疗作用不大(图D和图E)。而阳性药组(图C)与DSS组相比，小鼠结肠结构损伤改善，但仍有炎症细胞浸润，出现轻微的隐窝扭曲，炎症并未完全缓解。经ES1CS5AG5@5-ASANCs(图F)处理的小鼠结肠组织在形态学上与健康小鼠相似,明显缓解了炎症反应，如再上皮化和减少炎症细胞浸润。此外，对各组结肠组织炎性细胞浸润、上皮损伤、黏膜结构的结肠组织学损伤评分(图G)显示相同的趋势,证实了上述观察结果，ES1CS5AG5@5-ASANCs组在结肠组织的整体损伤较DSS组显著降低(p<0.01)，DSS组得分最高，ES1CS5AG5@5-ASANCs组得分最低。综上所述，ES1CS5AG5@5-ASANCs可显著保护结肠组织，并减弱DSS诱导的组织形态学改变使上皮细胞恢复和炎症缓解。这些发现表明，与其它制剂组相比，ES1CS5AG5@5-ASANCs可向炎症结肠输送足够的5-氨基水杨酸，从而显著缓解炎症。
表3结肠组织病理学评分标准
Figure BDA0003397859560000181
Figure BDA0003397859560000191
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (15)

1.一种结肠靶向纳米粒，其特征在于，该结肠靶向纳米粒由以下组分组成：活性成分、可生物降解性聚合物材料和pH敏感型肠溶材料；其中，
所述活性成分为5-氨基水杨酸，所述可生物降解性聚合物材料为海藻酸钠和壳聚糖，所述pH敏感型肠溶材料为
Figure FDA0003397859550000011
S100，所述
Figure FDA0003397859550000012
S100为甲基丙烯酸和丙烯酸甲酯的阴离子共聚物。
2.根据权利要求1所述的结肠靶向纳米粒，其特征在于，海藻酸钠粘度为25-675cps；壳聚糖分子量为10000-300000Da。
3.根据权利要求1所述的结肠靶向纳米粒，其特征在于，所述结肠靶向纳米粒为核壳结构。
4.根据权利要求1所述的结肠靶向纳米粒，其特征在于，所述结肠靶向纳米粒的平均粒径为350-355nm，多分散系数为0.233-0.259，Zeta电位为-37.6mV～-34.92mV。
5.根据权利要求1所述的结肠靶向纳米粒，其特征在于，所述结肠靶向纳米粒载药量和包封率分别为85.05％-94.31％、89.68-95.05％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的结肠靶向纳米粒，其特征在于，该结肠靶向纳米粒为口服结肠靶向制剂。
7.如权利要求1-5任一项所述的结肠靶向纳米粒在制备治疗结肠炎的药物中的应用。
8.一种如权利要求1-5任一项所述的结肠靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，所述结肠靶向纳米粒通过以下步骤制备：
S1：将海藻酸钠溶液滴加至5-氨基水杨酸溶液中，制备海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶；
S2：将壳聚糖溶液滴加至海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶中，超声孵育后离心收集，得到壳聚糖包覆5-氨基水杨酸纳米晶；
S3：将壳聚糖包覆5-氨基水杨酸纳米晶悬浮在海藻酸钠溶液中，超声孵育后离心收集，得到壳聚糖-海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶；
S4：将壳聚糖-海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶在
Figure FDA0003397859550000013
S100溶液中超声孵育，得到5-氨基水杨酸结肠靶向纳米粒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，壳聚糖、海藻酸钠和
Figure FDA0003397859550000021
S100溶液中交替多次包覆在5-氨基水杨酸纳米晶上。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S1中，5-氨基水杨酸溶液制备步骤为：将一定质量的5-氨基水杨酸溶解于二甲基亚砜中，制备得到浓度为0.5mg/mL～10mg/mL5-氨基水杨酸溶液；海藻酸钠溶液制备步骤为：将一定质量的海藻酸钠溶解于纯水中，制备得到浓度0.06mg/mL～1.8mg/mL的海藻酸钠溶液。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤S1中，5-氨基水杨酸与海藻酸钠质量比为3:1-10:1；二甲基亚砜与纯水体积比为1:1-1:12。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S1-S3中超声孵育时间为0-60min，离心时间为0-20min；步骤S4中超声孵育时间为0-60min。
13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S1中制备得到海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶后透析纯化除去二甲基亚砜溶剂。
14.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S1中制备得到海藻酸钠包覆5-氨基水杨酸纳米晶粒径为183-189nm，多分散系数为0.176，表面电荷为-26.98～-25.62mV；载药量和包封率分别为94.31％、89.68％。
15.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S1-S4中，超声孵育后用NaCl洗涤多次。
CN202111489518.2A 2021-12-07 2021-12-07 用于治疗溃疡性结肠炎的结肠靶向纳米粒及其制备方法 Active CN114376987B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111489518.2A CN114376987B (zh) 2021-12-07 2021-12-07 用于治疗溃疡性结肠炎的结肠靶向纳米粒及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111489518.2A CN114376987B (zh) 2021-12-07 2021-12-07 用于治疗溃疡性结肠炎的结肠靶向纳米粒及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114376987A true CN114376987A (zh) 2022-04-22
CN114376987B CN114376987B (zh) 2023-09-22

Family

ID=81195766

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111489518.2A Active CN114376987B (zh) 2021-12-07 2021-12-07 用于治疗溃疡性结肠炎的结肠靶向纳米粒及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114376987B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115120571A (zh) * 2022-06-13 2022-09-30 沈阳药科大学 一种姜黄素核壳纳米粒子的制备和应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103315959A (zh) * 2012-03-21 2013-09-25 上海市第一人民医院 一种治疗炎症性肠病的口服结肠靶向制剂及其制备方法
WO2014071207A1 (en) * 2012-11-01 2014-05-08 The Regents Of The University Of California Particles for the treatment of inflammatory bowel disease
CN107865972A (zh) * 2017-09-20 2018-04-03 中南民族大学 一种兼有示踪和靶向药物输送作用的多功能膜控型靶向纳米载体的制备方法和应用
CN108383856A (zh) * 2018-05-25 2018-08-10 中国医学科学院生物医学工程研究所 他克莫司纳米晶及其人工泪液复合物与制备方法
CN109758434A (zh) * 2019-03-25 2019-05-17 成都医学院 一种治疗炎症性肠病的益生菌复合物
CN111317827A (zh) * 2020-04-02 2020-06-23 江西科技师范大学 一种口服结肠靶向番茄红素纳米脂质体及其制备方法
CN112618515A (zh) * 2020-12-29 2021-04-09 江南大学 一种负载外泌体的口服结肠靶向给药的聚合物的制备方法
CN113398073A (zh) * 2021-05-17 2021-09-17 浙江工业大学 一种用于治疗溃疡性结肠炎的丹参素钠自组装脂质体及其制备方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103315959A (zh) * 2012-03-21 2013-09-25 上海市第一人民医院 一种治疗炎症性肠病的口服结肠靶向制剂及其制备方法
WO2014071207A1 (en) * 2012-11-01 2014-05-08 The Regents Of The University Of California Particles for the treatment of inflammatory bowel disease
CN107865972A (zh) * 2017-09-20 2018-04-03 中南民族大学 一种兼有示踪和靶向药物输送作用的多功能膜控型靶向纳米载体的制备方法和应用
CN108383856A (zh) * 2018-05-25 2018-08-10 中国医学科学院生物医学工程研究所 他克莫司纳米晶及其人工泪液复合物与制备方法
CN109758434A (zh) * 2019-03-25 2019-05-17 成都医学院 一种治疗炎症性肠病的益生菌复合物
CN111317827A (zh) * 2020-04-02 2020-06-23 江西科技师范大学 一种口服结肠靶向番茄红素纳米脂质体及其制备方法
CN112618515A (zh) * 2020-12-29 2021-04-09 江南大学 一种负载外泌体的口服结肠靶向给药的聚合物的制备方法
CN113398073A (zh) * 2021-05-17 2021-09-17 浙江工业大学 一种用于治疗溃疡性结肠炎的丹参素钠自组装脂质体及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MURTADA A. OSHI 等: "Curcumin Nanocrystal/pH-Responsive Polyelectrolyte Multilayer Core−Shell Nanoparticles for Inflammation-Targeted Alleviation of Ulcerative Colitis", 《BIOMACROMOLECULES》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115120571A (zh) * 2022-06-13 2022-09-30 沈阳药科大学 一种姜黄素核壳纳米粒子的制备和应用
CN115120571B (zh) * 2022-06-13 2023-09-12 沈阳药科大学 一种姜黄素核壳纳米粒子的制备和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114376987B (zh) 2023-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sardo et al. A review on 5-aminosalicylic acid colon-targeted oral drug delivery systems
Lamprecht et al. Size-dependent bioadhesion of micro-and nanoparticulate carriers to the inflamed colonic mucosa
Suwannateep et al. Mucoadhesive curcumin nanospheres: biological activity, adhesion to stomach mucosa and release of curcumin into the circulation
Zhang et al. Oral administration of chondroitin sulfate-functionalized nanoparticles for colonic macrophage-targeted drug delivery
RU2492872C2 (ru) Вододиспергируемые пероральные, парентеральные и местные композиции для плохо растворимых в воде лекарственных препаратов, включающие улучшающие их свойства полимерные наночастицы
Duan et al. Mucoadhesive microparticulates based on polysaccharide for target dual drug delivery of 5-aminosalicylic acid and curcumin to inflamed colon
Bernkop-Schnürch et al. Thiomers: preparation and in vitro evaluation of a mucoadhesive nanoparticulate drug delivery system
Zhang et al. pH-sensitive O-carboxymethyl chitosan/sodium alginate nanohydrogel for enhanced oral delivery of insulin
Mahajan et al. Biodegradable nanoparticles for targeted delivery in treatment of ulcerative colitis
WO2020258584A1 (zh) 作用于小肠的辐射防护纳米药物及其制备方法
WO2022142448A1 (zh) 一种负载外泌体的口服结肠靶向给药的聚合物的制备方法
Desai et al. Colon targeted bioadhesive pellets of curcumin and cyclosporine for improved management of inflammatory bowel disease
Shi et al. In vitro and in vivo study of pH-sensitive and colon-targeting P (LE-IA-MEG) hydrogel microspheres used for ulcerative colitis therapy
KR101727847B1 (ko) 글리코사미노글리칸을 포함하는 약제학적 제제
Deshmukh et al. Preformulation considerations development and evaluation of mesalamine loaded polysaccharide-based complex mucoadhesive beads for colon targeting
Llabot et al. Bioadhesive properties of poly (anhydride) nanoparticles coated with different molecular weights chitosan
CN114376987B (zh) 用于治疗溃疡性结肠炎的结肠靶向纳米粒及其制备方法
Wang et al. 5-aminosalicylic acid pH sensitive core-shell nanoparticles targeting ulcerative colitis
Xiao et al. Colon-specific delivery of isoliquiritigenin by oral edible zein/caseate nanocomplex for ulcerative colitis treatment
Sabra et al. Gastrointestinal delivery of APIs from chitosan nanoparticles
Fan et al. Novel pH-responsive and mucoadhesive chitosan-based nanoparticles for oral delivery of low molecular weight heparin with enhanced bioavailability and anticoagulant effect
Ahmed et al. Mucoadhesive nanoparticulate system for oral drug delivery: a review
CN113769112B (zh) 一种基于GOQDs的pH响应型仿生纳米制剂及其制备方法、应用
Zhu et al. A novel microsphere with a three-layer structure for duodenum-specific drug delivery
Deshmukh et al. Formulation and evaluation of oral mucoadhesive microspheres of ofloxacin for peptic ulcer use

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant