CN115109820A - 一种植物酶解多肽和在修复皮肤屏障损伤及制备肌肤修复化妆品中的应用 - Google Patents

一种植物酶解多肽和在修复皮肤屏障损伤及制备肌肤修复化妆品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物酶解多肽和在修复皮肤屏障损伤及制备肌肤修复化妆品中的应用。本发明提供了一种菘蓝种子酶解多肽，分子量介于3000u和5000u之间。本领域技术人员知道，皮肤屏障功能至关重要，对外可阻挡外界各种刺激对皮肤的损伤。皮肤屏障功能受损后，屏障指数会显著降低，维系屏障功能的关键蛋白FLG、LOR表达水平下降，出现炎性症状。上述实验说明，本发明提供的酶解多肽可以有效对抗皮肤屏障损伤，有效缓解各项皮肤屏障受损指标。因此，该酶解多肽可以用于开发制备抗皮肤屏障损伤的化妆品。

Description

一种植物酶解多肽和在修复皮肤屏障损伤及制备肌肤修复化 妆品中的应用
技术领域
本发明属于高分子领域，涉及多肽/酶解多肽，具体涉及一种植物酶解多肽和在修复皮肤屏障损伤及制备肌肤修复化妆品中的应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，具有屏障、体温调节、免疫等多种功能。其中，皮肤屏障功能至关重要，对外可阻挡外界化学、物理、机械、生物等因素对皮肤的损伤，对内能防止水分及营养物质的丢失。正常的皮肤屏障是皮肤多种重要生理功能的基础，皮肤屏障受损是特应性皮炎、慢性光化性皮炎、银屑病、黄褐斑、痤疮、皮肤鳞状细胞癌等多种皮肤病发生发展中的重要环节。因此，修复皮肤屏障对治疗这些皮肤病有重要意义，在临床治疗中，除了常规治疗，还应重视对受损皮肤屏障的修复治疗。
多肽是α-氨基酸以肽键连接在一起的化合物，是蛋白质水解的中间产物。功能活性多肽是指在3～20个氨基酸大小、分子量小于6000Da，且具有一定生理功能的蛋白质片断或水解产物。其来源主要有：植物、动物、海洋生物和微生物。植物功能活性肽由于其结构性质和氨基酸组成及序列的差异，表现出不同生理活性功能，具有显著的安全性、耐受性、易被吸收和有效性的特点，可以通过细胞膜，作为靶向给药物载体，是新型治疗药物的优质原料。目前研究较多的植物源功能多肽有大豆、小麦、玉米和葵花籽等多肽，也已经制定了相关的技术标准，随着科技的进步，植物源多肽及其产品被广泛应用于医学诊断、抗菌药物、保健食品和化妆品中，与人们的日常生活十分密切。
多肽的制备方法和途径很多，在诸多的制备方法中，尤以酶法反应条件温和、过程易于控制，不会对环境造成危害，能保持多肽的天然绿色属性。
菘蓝(Isatis indigotica Fort.)为十字花科植物，以干燥的根和叶入药，分别为板蓝根和大青叶，二者均有清热解毒、凉血的功效，板蓝根兼能利咽，大青叶兼能消斑，都是常用的中药材，现多地都有引种栽培。菘蓝生产上用种子进行繁殖，研究表明，菘蓝种子中含有丰富的蛋白质，可以提供丰富的多肽，具有极高的开发前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物酶解多肽和在修复皮肤屏障损伤及制备肌肤修复化妆品中的应用，该酶解多肽来源于菘蓝种子。
本发明目的通过如下方案实现：
一种植物酶解多肽，通过如下步骤制备：
将成熟的菘蓝种子洗净、干燥、粉碎，按料液比1kg:10L加入无水乙醇，热回流提取脱脂，过滤，收集脱脂粉末，挥干溶剂，按料液比1kg:10L加入纯净水，用氢氧化钠调节pH＝10.0，水浴搅拌提取，冷却，过滤，收集滤液；采用离心法去除滤液中未被过滤掉的细微固体，保留上清液；用盐酸调节上清液的pH＝5.2，静置，离心，离心收集沉淀，冷冻干燥，得总蛋白；
采用碱性蛋白酶对总蛋白酶解：将总蛋白按料液比1g:10mL加入纯净水匀浆，按照如下参数加入碱性蛋白酶酶解：pH值，8.0；酶解温度，48℃；酶解时间，6h；加酶量，5000U/g；酶解完成后，沸水浴灭酶，冷却，离心，保留上清液，冷冻干燥，得总蛋白酶解物；
将总蛋白酶解物用纯净水溶解，依次使用截留分子量为5000u和3000u的超滤膜进行超滤，收集分子量介于3000u和5000u之间的组分，冷冻干燥，即得。
进一步地，热回流脱脂时间为3.5h。
进一步地，水浴搅拌提取的条件为50℃水浴搅拌提取3.5h。
进一步地，离心参数均为5000r/min离心15min。
上述植物酶解多肽用于制备抗皮肤屏障损伤的化妆品的用途。
有益效果：
本发明提供了一种菘蓝种子酶解多肽，分子量介于3000u和5000u之间。本领域技术人员知道，皮肤屏障功能至关重要，对外可阻挡外界各种刺激对皮肤的损伤。皮肤屏障功能受损后，屏障指数会显著降低，维系屏障功能的关键蛋白FLG、LOR表达水平下降，出现炎性症状。上述实验说明，本发明提供的酶解多肽可以有效对抗皮肤屏障损伤，有效缓解各项皮肤屏障受损指标。因此，该酶解多肽可以用于开发制备抗皮肤屏障损伤的化妆品。
附图说明
图1为菘蓝种子酶解多肽的SEM图(400×)；
图2为皮肤屏障关键蛋白western blot测定结果。
具体实施方式
实施例1：
将成熟的菘蓝种子洗净、干燥、粉碎，按料液比1kg:10L加入无水乙醇，热回流提取3.5h脱脂，过滤，收集脱脂粉末，挥干溶剂。按料液比1kg:10L加入纯净水，用氢氧化钠调节pH＝10.0，50℃水浴搅拌提取3.5h，冷却，过滤，收集滤液。采用离心法去除滤液中未被过滤掉的细微固体，离心条件为5000r/min离心15min，保留上清液。用盐酸调节上清液的pH＝5.2，静置6h，5000r/min离心15min，离心收集沉淀，冷冻干燥，即得总蛋白。
采用碱性蛋白酶对总蛋白酶解。具体方法为：将总蛋白按料液比1g:10mL加入纯净水匀浆，按照如下参数加入碱性蛋白酶酶解：pH值，8.0；酶解温度，48℃；酶解时间，6h；加酶量，5000U/g。酶解完成后，沸水浴10min灭酶，冷却，5000r/min离心15min，保留上清液，冷冻干燥，即得总蛋白酶解物。
将总蛋白酶解物用纯净水溶解制成浓度为5mg/mL的溶液，依次使用截留分子量为5000u和3000u的超滤膜进行超滤，收集分子量介于3000u和5000u之间的组分，冷冻干燥，即得目标酶解多肽。该分子量范围的酶解多肽成药性好，活性高。SEM如图1。
实施例2：
人3D表皮模型是一种包括基底层、棘层、颗粒层和多层角质层的高度分化的三维重建模型，可以很大程度上模拟人类皮肤表层的生化和生理特征，已经在医学、材料学和化学品等领域得到了广泛的应用。在化妆品毒理学和功效性评估中也有一定的应用，经济合作与发展组织(OECD)就认可了应用3D皮肤模型进行化妆品皮肤刺激性和腐蚀性的试验方案，国内外也有大量研究应用3D皮肤模型进行皮肤屏障相关的研究(Effect ofStaphylococcus epidermidis fermented extract on human skin barrier.ChinaSurfactant Detergent&Cosmetics.2022；阿胶对皮肤屏障损伤的修复作用，科技广场，2021)。
1、试验材料
人3D表皮模型(EpiKutis)、EpiGrowth培养液购自广东博溪生物科技有限公司。
十二烷基硫酸钠(SLS)、TritonX-100、MTT购自美国Sigma公司。
IL-1α检测试剂盒、BCA试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。丝聚蛋(Filaggrin，FLG)、兜甲蛋白(Loricrin，LOR)和内参β-actin一抗，以及二抗，均购自Abcam公司。
2、试验方法
2.1皮肤屏障指数测定
采用快速渗透试验方法，测定经1％TritonX-100处理后组织活性减小至50％所需的药物暴露时间，即ET50，用于评价表皮皮肤模型的屏障功能(In vitro safety testingstrategy for skin irritation using the 3D reconstructed human epidermis.JBiochem.2009；三维表皮模型
Figure BDA0003754311570000031
参考品的研制，药物分析杂志，2019)。
酶解多肽即为实施例1方法制备的酶解多肽，具体操作方法如下：
将人3D表皮模型按照说明书复苏后，转移至含有0.9mL EpiGrowth培养液的6孔板中，用2mg/mL的SLS溶液溶解酶解多肽配制成含100μg/mL酶解多肽的酶解多肽-SLS溶液，取酶解多肽-SLS溶液25μL缓慢滴加于模型表面。以未处理的人3D表皮模型作为阴性对照，以2mg/mL的SLS溶液作为模型对照，每组9个平行。给药结束后在37℃、5％CO2条件培养24h。使用无菌PBS清洗各人3D表皮模型，然后使用1％TritonX-100溶液分别刺激0h、1h、3h，每个时间点3个模型。刺激结束后使用无菌PBS清洗各人3D表皮模型，使用MTT法，以阴性对照组刺激0h的存活率为100％，以异丙醇作为空白对照，以吸光值作为检测指标按照下面公式计算受试物处理后模型的组织存活率：
Figure BDA0003754311570000041
同一实验分组内，取组织活力为50％左右的2个时间点数据进行线性回归计算ET50。ET50大于模型对照组ET50的样品，代表具有屏障修复活性。
2.2皮肤屏障关键蛋白表达水平测定
将人3D表皮模型按照说明书复苏后，转移至含有0.9mL EpiGrowth培养液的6孔板中，用2mg/mL的SLS溶液溶解酶解多肽配制成含100μg/mL酶解多肽的酶解多肽-SLS溶液，取酶解多肽-SLS溶液25μL缓慢滴加于模型表面。以未处理的人3D表皮模型作为阴性对照，以2mg/mL的SLS溶液作为模型对照，每组9个平行。给药结束后在37℃、5％CO2条件培养24h。使用无菌PBS清洗各人3D表皮模型，裂解液裂解模型细胞，提取总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。各取40μg蛋白上样行SDS-PAGE电泳，转膜，5％脱脂奶粉室温封闭2h，洗膜后用FLG、LOR、β-actin一抗4℃孵育过夜，继续洗膜后用辣根过氧化物酶标记的IgG二抗室温孵育2h，洗膜3次，加ECL混合溶液，曝光、显影、拍照。
2.3皮肤屏障抗炎刺激能力测定
将人3D表皮模型按照说明书复苏后，转移至含有0.9mL EpiGrowth培养液的6孔板中，用2mg/mL的十二烷基硫酸钠(SLS)溶液溶解酶解多肽配制成含100μg/mL酶解多肽的酶解多肽-SLS溶液，取酶解多肽-SLS溶液25μL缓慢滴加于模型表面。以未处理的人3D表皮模型作为阴性对照，以2mg/mL的SLS溶液作为模型对照，每组9个平行。给药结束后在37℃、5％CO2条件培养24h。收集模型培养液，使用ELISA法检测各人3D表皮模型中IL-1α含量。IL-1α含量显著小于模型对照IL-1α含量的样品，代表能够抗SLS对皮肤屏障的刺激作用。
2.4统计学处理
数据采用SPSS 19.0统计软件分析，以均值±标准差表示。
3、试验结果
3.1皮肤屏障指数
各组皮肤屏障指数如表1所示。与阴性对照组相比，模型对照组ET50显著降低，说明皮肤屏障受损模型造模成功；与模型对照组相比，酶解多肽组ET50显著升高，说明酶解多肽有效抑制了皮肤屏障受损，具有抗皮肤屏障损伤的活性。
表1各组皮肤屏障指数
阴性对照组 模型对照组 酶解多肽组
ET<sub>50</sub> 107.28min 14.63min 59.15min
3.2皮肤屏障关键蛋白表达水平
皮肤屏障关键蛋白western blot测定结果如图2所示。与阴性对照组相比，模型对照组FLG、LOR蛋白表达水平显著降低，说明皮肤屏障受损模型造模成功；与模型对照组相比，酶解多肽组FLG、LOR蛋白表达水平显著升高，说明酶解多肽有效抑制了皮肤屏障受损，具有抗皮肤屏障损伤的活性。
3.3IL-1α含量
各组人3D表皮模型中IL-1α含量如表2所示。与阴性对照组相比，模型对照组IL-1α显著升高，说明皮肤屏障受损模型造模成功；与模型对照组相比，酶解多肽组IL-1α显著降低，说明酶解多肽有效抑制了皮肤屏障受损，具有抗皮肤屏障损伤引起的炎症的活性。
表2各组IL-1α含量
阴性对照组 模型对照组 酶解多肽组
IL-1α含量(ρg/mL) 37.05±1.28 305.66±25.31 198.52±17.29
皮肤屏障功能至关重要，对外可阻挡外界各种刺激对皮肤的损伤。皮肤屏障功能受损后，屏障指数会显著降低，维系屏障功能的关键蛋白FLG、LOR表达水平下降，出现炎性症状。上述实验说明，本发明提供的酶解多肽可以有效对抗皮肤屏障损伤，有效缓解各项皮肤屏障受损指标。因此，该酶解多肽可以用于开发制备抗皮肤屏障损伤的化妆品。

Claims (5)

1.一种植物酶解多肽，其特征在于，通过如下步骤制备：
将成熟的菘蓝种子洗净、干燥、粉碎，按料液比1kg:10L加入无水乙醇，热回流提取脱脂，过滤，收集脱脂粉末，挥干溶剂，按料液比1kg:10L加入纯净水，用氢氧化钠调节pH＝10.0，水浴搅拌提取，冷却，过滤，收集滤液；采用离心法去除滤液中未被过滤掉的细微固体，保留上清液；用盐酸调节上清液的pH＝5.2，静置，离心，离心收集沉淀，冷冻干燥，得总蛋白；
采用碱性蛋白酶对总蛋白酶解：将总蛋白按料液比1g:10mL加入纯净水匀浆，按照如下参数加入碱性蛋白酶酶解：pH值，8.0；酶解温度，48℃；酶解时间，6h；加酶量，5000U/g；酶解完成后，沸水浴灭酶，冷却，离心，保留上清液，冷冻干燥，得总蛋白酶解物；
将总蛋白酶解物用纯净水溶解，依次使用截留分子量为5000u和3000u的超滤膜进行超滤，收集分子量介于3000u和5000u之间的组分，冷冻干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的植物酶解多肽，其特征在于：热回流脱脂时间为3.5h。
3.根据权利要求1所述的植物酶解多肽，其特征在于：水浴搅拌提取的条件为50℃水浴搅拌提取3.5h。
4.根据权利要求1所述的植物酶解多肽，其特征在于：离心参数均为5000r/min离心15min。
5.权利要求1～4任一所述植物酶解多肽用于制备抗皮肤屏障损伤的化妆品的用途。
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