CN115103915A - 用于执行qPCR方法的方法和设备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及计算机执行的用于运行定量聚合酶链式反应(qPCR)‑方法的方法,该方法具有以下的步骤:‑循环地实施(S1‑S3)qPCR循环;‑对于每个qPCR循环测量(S11)荧光的强度值,以便得到由强度值组成的qPCR曲线;‑借助于基于数据的分类模型来评估(S12)所述qPCR曲线的变化曲线,训练所述分类模型,以便依赖于所述qPCR曲线的变化曲线来提供(S13)分类结果;‑依赖于对所述qPCR曲线的变化曲线进行的评估的分类结果来运行(S14)所述qPCR方法。
Description
技术领域
本发明涉及对聚合酶链式反应方法(PCR方法)的使用方案,尤其以用于探测病原体的存在性。此外本发明涉及对qPCR测量的评估。
背景技术
为了探测有待研究的物质、如例如血清或诸如此类物中的DNA链区段,在自动化的系统中执行PCR方法。PCR系统能够实现的是,对确定的有待检测的、例如应该配属于病原体的DNA链区段进行扩增并且进行检测。PCR方法一般包括循环地使用变性、退火以及延伸的步骤。特别地,在PCR过程中DNA双链展开成单链并且其分别通过积聚核苷酸又进行补足,以便在每个循环中复制DNA链区段。
qPCR方法能够实现以被证明的方式用这种过程来量化病原体负荷。为此,核苷酸至少部分地设有荧光分子,所述荧光分子在与有待检测的DNA链区段的单链连接时激活荧光特性。根据双链的结构能够在每个循环之后求取荧光值,该荧光值依赖于所产生的DNA链区段的数目。
在扩增过程中,则能够由所求取的荧光值(强度值)来求取qPCR曲线,该qPCR曲线在有待研究的物质中存在有待检测的DNA链区段的情况下具有sigmoid状的曲线。所测量的qPCR曲线实际上会带有伪迹,从而通常执行多个并行的测量,以便能够通过对测量值构造平均值来实现对qPCR曲线的更为精确的评估。
发明内容
按照本发明,规定了用于执行qPCR方法的按照权利要求1的方法以及按照并列的权利要求的设备和qPCR系统。
在从属权利要求中提出了另外的设计方案。
按照第一方面,规定了用于运行定量聚合酶链式反应(qPCR)-方法的方法,该方法具有以下的步骤:
- 循环地实施qPCR循环;
- 在每个qPCR循环之后或者期间测量荧光的强度值,以便得到由强度值组成的qPCR曲线;
- 借助于基于数据的分类模型来评估qPCR曲线的变化曲线,训练该分类模型,以便依赖于qPCR曲线的变化曲线来提供分类结果;
- 依赖于对qPCR曲线的变化曲线进行的评估的分类结果来运行qPCR方法。
qPCR方法具有循环地重复变性、退火和延伸的步骤的过程。在变性中,在高温情况下有待研究的物质中的整个双链DNA展开成两个单链。在退火的步骤中,添加给物质的引物与单链连接,所述引物预先给定了对有待检测的DNA链区段进行扩增的起始点。在延伸的步骤中,第二互补的DNA链区段由自由的核苷酸在设有引物的单链上构成。在这些循环中的每个循环之后,有待检测的DNA链区段的DNA量因此理想地发生了翻倍。
通过使用qPCR方法,将作为标记的荧光分子装入到有待检测的DNA链区段中,从而通过在每个延伸步骤之后测量荧光的强度而能够求取强度值的在时间上的变化曲线。在此,如此得到的qPCR曲线具有三个有区别的阶段,即:基线,在该基线中由装入的标记所发射的荧光光线的荧光的强度还没有与背景荧光区分开;指数阶段,在该指数阶段中荧光强度上升超过基线,因此能被看到,其中,通过在每个循环中使DNA链翻倍而使得荧光信号与有待检测的DNA链区段的量成比例地指数地上升;以及平台阶段,在该平台阶段中试剂、也就是说引物和自由的核苷酸不再以所需的浓度存在并且没有继续发生翻倍。
对于证明例如能够对应于病原体的、预先给定的有待检测的DNA链区段,在此所谓的ct(cycle threshold,循环阈值)-值是决定性。ct-值确定了指数阶段的开始并且通过超过特定的极限值(该极限值对于分别有待检测的DNA链区段得以确定并且该极限值对于用于有待检测的DNA链区段的所有样品而言是相同的)来求取或者在计算上通过qPCR曲线在指数阶段中的二阶导数来求取并且对应于qPCR曲线的最陡的上升过程的强度值。如果已知目标值,则能够通过反算来确定有待研究的物质中的有待检测的DNA链区段的开始浓度。
实际上qPCR曲线非常不准确并且经受显著的波动。会出现基线漂移,随着该基线漂移表现出背景荧光在测量循环期间的上升。也就是说,即使在不发生扩增的情况下,荧光信号也上升。负面地影响qPCR曲线的精度的另外的影响因子例如能够由试剂浓度中的热噪声、波动或者说计量公差、荧光体积中的气穴以及伪迹(Artefakten)产生。
在传统的qPCR系统中一方面发生对qPCR曲线进行的基于软件的修正,另一方面能够规定,样品在相同的条件下多次测量并且产生的qPCR曲线通过形成平均值来进行平滑。然而这需要增高的耗费。
上述的方法的构思在于,借助于尤其呈人工神经元的网络、尤其深度神经元网络或者递归神经元网络、尤其LSTM的形式的基于数据的分类模型或者呈支持向量机的形式的基于数据的分类模型来决定,所测量的qPCR曲线是否表明了在有待研究的物质中存在有待检测的DNA链区段。因为所测量的qPCR曲线通常有非常多噪声,所以能够通过使用qPCR曲线变化曲线的经过训练的基于数据的分类模型也在边界情况下更为可靠地如此地进行评定,即:在有待研究的物质中是否存在有待检测的DNA链区段。
能够训练该分类模型,以便依赖于qPCR曲线来提供分类结果,该分类结果表明是否存在有待检测的DNA链区段。尤其可行的是,对于标记的qPCR曲线作为训练数据来训练基于数据的分类模型,从而能够以相应的方式对所测量的qPCR曲线进行分类。然而这一点需要用由手动地分类的或者说标记的qPCR曲线组成的大量的数据组对分类模型进行大规模的训练,因为没有考虑到任何前提(Vorannahmen)。
此外能够在所测量的qPCR曲线和给定参数的存在函数以及给定参数的缺失函数之间确定剩余误差变化曲线,其中,训练分类模型,以便依赖于剩余误差变化曲线中的至少一个剩余误差变化曲线来提供分类结果,该分类结果表明是否存在有待检测的DNA链区段。因此替代地可行的是,在有待研究的物质中存在有待检测的DNA链区段的情况下(存在-曲线变化曲线)、并且在有待研究的物质中缺失有待检测的DNA链区段的情况下(缺失-曲线变化曲线)将所测量的qPCR曲线拟合成qPCR曲线的参数化的理想变化曲线。这一点通过在所测量的qPCR曲线上对存在-曲线变化曲线和缺失-曲线变化曲线进行参数化来实现。参数化的存在-曲线变化曲线或者说参数化的缺失-曲线变化曲线以及实际上的所测量的qPCR曲线之间的剩余误差变化曲线则能够借助于经过训练的基于数据的分类模型来评估。在此,训练分类模型,以便决定,相应的曲线拟合是否基于参数化的理想变化曲线,该理想变化曲线最接近于qPCR曲线的所测量的变化曲线。也就是说,借助于分类模型来确定,所测量的qPCR曲线更对应于存在-qPCR-曲线还是缺失-qPCR-曲线。
在此,当分类结果基于来自给定参数的存在函数的剩余误差变化曲线而表现出存在有待检测的DNA链区段时,就确定存在有待检测的DNA链区段。相应地,当分类结果基于来自给定参数的缺失函数的剩余误差变化曲线而表现出缺失有待检测的DNA链区段时,就能够确定缺失有待检测的DNA链区段。
能够实现评估,其方式为:当分类结果证实与存在-曲线变化曲线进行曲线拟合并且没有证实与缺失-曲线变化曲线进行曲线拟合时,就推断出存在有待检测的DNA链区段。类似地,当分类结果证实与缺失-曲线变化曲线进行曲线拟合并且没有证实与存在-曲线变化曲线进行曲线拟合时,就推断出缺失有待检测的DNA链区段。
上面所说明的第一变型方案避免了关于作为基础的典型的曲线变化曲线的可能的有错误的或者不精确的基本假设并且也能够反映未知的关联和动态,而上面所说明的第二变型方案能够基于现有的领域知识以分类模型来使用,该分类模型对于其训练需要不那么大规模的训练数据组。总体上,对基于数据的分类模型的使用相比于传统的方法引起了更少数目的错误分类。
能够规定的是,运行qPCR方法,其方式为:在确定存在有待检测的DNA链区段的情况下,
- 用信号通知,能够求取ct-值,和/或
- 该ct-值由给定参数的存在函数来求取。
按照另一方面是一种用于运行定量聚合酶链式反应(qPCR)-方法的设备,其中,该设备构造用于实施下述步骤:
- 循环地实施qPCR循环;
- 对于每个qPCR循环测量荧光的强度值,以便得到由强度值组成的qPCR曲线;
- 借助于基于数据的分类模型来评估qPCR曲线的变化曲线,训练该分类模型,以便依赖于qPCR曲线的变化曲线来提供分类结果;
- 依赖于对qPCR曲线的变化曲线进行的评估的分类结果来运行qPCR方法。
附图说明
在下文中根据附图更详细地阐释实施方式。其中:
图1示出了PCR方法的循环的示意图;
图2示出了具有强度值变化曲线的典型的qPCR曲线的示意图;
图3示出了qPCR曲线的所测量的变化曲线;
图4a和图4b对于不能证明的物质或者说能证明的物质的情况示出了qPCR曲线的理想的变化曲线;并且
图5示出了用于示出用于运行qPCR测量的方法的流程图;并且
图6示出了用于示出用于运行qPCR测量的另外的方法的流程图。
具体实施方式
图1示出了本身已知的PCR方法的示意图,该PCR方法具有变性、退火和延伸的步骤。
在退火的步骤S1中,在例如90°C以上的高温的情况下,物质中的双链DNA裂解成两个单链。在接下来的退火步骤S2中,所谓的引物在确定的DNA位置处与单链相连接,该位置标记出有待检测的DNA链区段的开始。这种引物示出了对DNA链区段的进行扩增的起始点。在延伸步骤S3中,在被引物所标记的位置处开始,由添加给物质的自由的核苷酸在单链处构成互补的DNA-链区段,从而延伸步骤结束时已经将前述展开的单链补充成完整的双链。
通过给自由的核苷酸或者说引物设有仅在与DNA链区段连接的状态中具有荧光特性的荧光分子,能够通过求取荧光的强度而继延伸步骤S3之后通过合适的测量来得到荧光的强度值。荧光光线的所测量的强度分配有强度值。
步骤S1至S3的方法循环地实施并且记录强度值,以便得到强度值变化曲线以作为qPCR曲线。
强度值变化曲线在理想情况下具有图2中所示出的变化曲线(Verlauf)。图2示出了正常化的强度I关于循环指数z的变化曲线。该曲线划分成三个区段,即:基线区段B,在该基线区段中,装入的荧光分子的荧光还没有与背景荧光区分开;指数区段E,在指数区段中能看到强度值并且该强度值指数地上升;并且划分成平台区段P,在该平台区段中强度值的上升变平,因为所使用的试剂(具有核苷酸的溶液)耗尽并且没有发生与裂解的单链的另外的连接。
在图3中示例性地示出了在实际的测量中所得到的强度值变化曲线,以作为qPCR曲线。识别出剧烈的波动,该波动能够由背景荧光、热噪声、试剂浓度中的波动以及在荧光体积中的小气泡和伪迹所产生。识别出,对于qPCR曲线的基线区段、指数区段以及平台区段的确定并不容易。
图4a和图4b示出了在不存在有待证明的DNA链区段的情况下或者说在存在有待证明的DNA链区段的情况下qPCR曲线的理想的变化曲线。
在图5中示出了用于示出用于运行qPCR测量过程的方法的流程图。该方法能够在数据处理装置上实施,该数据处理装置控制PCR系统上的qPCR过程并且该数据处理装置由PCR系统在每个循环中提供强度值,该强度值表明了依赖于在qPCR期间所扩增的DNA链区段的荧光强度。在数据处理装置中能够以软件和/或硬件的方式执行在下文中所说明的方法。
在步骤S11中执行qPCR测量,以便在qPCR测量的先后跟随的循环中接收强度值。用于qPCR测量的循环的数目为近似30至60个循环,优选地为40循环。获得了qPCR曲线,该qPCR曲线关于循环指数画出了强度值(或者由此所导出的值)。
在步骤S12中qPCR曲线的强度值供应给经过训练的分类模型。该分类模型构造为基于数据的模型,如例如SVM(Support Vector Machine,支持向量机)或者深度神经元网络。替代地,基于数据的分类模型也能够用神经元网络由时间上的卷积层来构成。
分类模型能够用由实际测量的qPCR变化曲线组成的数据组来训练,所述数据组分别分配有标签,该标签表明,该数据组(qPCR曲线)是否对应于针对包括有待检测的DNA链区段的物质进行的测量。
在步骤S13中根据通过分类模型的得到的分类结果来确定,qPCR曲线对应于存在还是缺失有待检测的DNA链区段,也就是说,表明有待检测的DNA链区段是否包括在物质中。
在步骤S14中该PCR方法根据分类结果来实施。特别地,该qPCR方法能够运行,其方式为:在确定存在有待检测的DNA链区段的情况下,用信号通知:能够求取ct-值,并且该ct-值由被给定参数的存在函数来求取。
在图6中示出了用于示出替代的方法的流程图,该方法用于运行PCR测量并且用于评估所测量的qPCR曲线。
在步骤S21中借助于qPCR方法来执行qPCR测量并且qPCR曲线通过对强度值的先后跟随的测量来确定。
在步骤S22中首先对预先给定的、参数的缺失函数进行参数化,其方式为:将所测量的qPCR曲线拟合成缺失函数(Nichtvorhandenseinsfunktion)。例如缺失函数能够是线性函数,如其在图4a中所示出的那样,该线性函数基本上对应于基线的变化曲线特征。拟合成缺失函数的操作能够例如借助于最小二乘法来实现。
在步骤S23中,所测量的qPCR曲线拟合成存在函数(Vorhandenseinsfunktion)。存在函数对应于参数化的函数,该函数基本上对应于变化曲线特征,如其在图4b中所示出的那样。存在函数能够具有sigmoid函数。通过对存在函数参数化能够将所测量的qPCR曲线拟合成存在函数。
在步骤S24中相对于参数化的存在函数并且相对于参数化的缺失函数来求取所测量的qPCR曲线的剩余误差变化曲线。
在步骤S25中剩余误差变化曲线供应给基于数据的分类模型。该分类模型基于训练数据来训练,该训练数据将剩余误差变化曲线分配给相应的存在-或者缺失函数。也就是说,训练数据表明了,来自参数化的存在函数的剩余误差变化曲线是否证实了存在有待检测的链区段。此外训练数据表明了,来自参数化的缺失函数的剩余误差变化曲线是否证实了缺失有待检测的链区段。
相应地,当分类模型证实了来自存在函数的剩余误差变化曲线时,在步骤S25中借助于剩余误差变化曲线确定了所测量的qPCR曲线表明在物质中存在有待检测的DNA链区段。类似地,当分类模型证实了来自缺失函数的剩余误差变化曲线时,借助于剩余误差变化曲线确定了所测量的qPCR曲线表明在物质中缺失有待检测的DNA链区段。也就是说,一般地由剩余误差变化曲线基于给定参数的存在函数或者给定参数的缺失函数而得到,分类结果如此确定相应的给定参数的存在函数或者给定参数的缺失函数(其是剩余误差变化曲线的基础)的剩余误差变化曲线,使得存在或者说不存在有待检测的DNA链区段。
如果由关于剩余误差变化曲线的分类结果得到与剩余误差变化曲线所基于的参数化的存在-或者缺失函数相反的结果,那么能够决定的是,舍弃该qPCR测量,因为无法做出关于存在或者缺失有待检测的DNA链区段的明确的决定。
Claims (10)
1.计算机执行的用于运行定量聚合酶链式反应(qPCR)-方法的方法,该方法具有以下的步骤:
- 循环地实施(S1-S3)qPCR循环;
- 对于每个qPCR循环测量(S11)荧光的强度值,以便得到由强度值组成的qPCR曲线;
- 借助于基于数据的分类模型来评估(S12)所述qPCR曲线的变化曲线,训练所述分类模型,以便依赖于所述qPCR曲线的变化曲线来提供(S13)分类结果;
- 依赖于对所述qPCR曲线的变化曲线进行的评估的分类结果来运行(S14)所述qPCR方法。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述基于数据的分类模型包括神经元网络、尤其是深度神经元网络或者递归神经元网络、尤其是LSTM,或者支持向量机模型。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中,训练所述分类模型,以便依赖于所述qPCR曲线提供分类结果,所述分类结果表明是否存在有待检测的DNA链区段。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中,在所测量的qPCR曲线和被给定参数的存在函数以及被给定参数的缺失函数之间确定(S24)剩余误差变化曲线,其中,训练所述分类模型,以便依赖于所述剩余误差变化曲线中的至少一个剩余误差变化曲线来提供(S25)分类结果,所述分类结果表明是否存在有待检测的DNA链区段。
5.根据权利要求4所述的方法,其中,当所述分类结果基于来自给定参数的存在函数的剩余误差变化曲线而表现出存在有待检测的DNA链区段时,确定存在有待检测的DNA链区段。
6.根据权利要求4或者5所述的方法,其中,当所述分类结果基于来自给定参数的缺失函数的剩余误差变化曲线而表现出缺失有待检测的DNA链区段时,确定(S25)缺失有待检测的DNA链区段。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中,运行(S14)所述qPCR方法,其方式为:在确定存在有待检测的DNA链区段的情况下,
- 用信号通知:能够求取ct-值,
- 所述ct-值由所述给定参数的存在函数来求取。
8.用于运行定量聚合酶链式反应(qPCR)-方法的设备,其中,所述设备构造用于实施下述步骤:
- 循环地实施qPCR循环;
- 对于每个qPCR循环测量荧光的强度值,以便得到由强度值组成的qPCR曲线;
- 借助于基于数据的分类模型来评估所述qPCR曲线的变化曲线,训练所述分类模型,以便依赖于所述qPCR曲线的变化曲线来提供分类结果;
- 依赖于对所述qPCR曲线的变化曲线进行的评估的分类结果来运行所述qPCR方法。
9.计算机程序,其设定用于实施根据权利要求1至7中任一项所述的方法的所有步骤。
10.电子存储介质,在该电子存储介质上存储有根据权利要求9所述的计算机程序。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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