WO2021170441A1 - Verfahren und vorrichtung zur durchführung eines qpcr-verfahrens - Google Patents

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WO2021170441A1
WO2021170441A1 PCT/EP2021/053656 EP2021053656W WO2021170441A1 WO 2021170441 A1 WO2021170441 A1 WO 2021170441A1 EP 2021053656 W EP2021053656 W EP 2021053656W WO 2021170441 A1 WO2021170441 A1 WO 2021170441A1
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qpcr
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dna strand
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PCT/EP2021/053656
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Volker Fischer
Christoph FAIGLE
Torsten SACHSE
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Robert Bosch Gmbh
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    • G16B40/20—Supervised data analysis

Definitions

  • the invention relates to the use of a polymerase chain reaction process (PCR process), in particular for detecting the presence of a pathogen.
  • PCR process polymerase chain reaction process
  • the present invention also relates to the evaluation of qPCR measurements.
  • PCR methods are carried out in automated systems.
  • the PCR systems make it possible to amplify and detect certain DNA strand sections to be detected, which can be assigned to a pathogen, for example.
  • a PCR method generally comprises a cyclical application of the steps of denaturation, annealing and elongation.
  • a DNA double strand is split into single strands and these are each completed again by the addition of nucleotides in order to duplicate the DNA strand sections in each cycle.
  • the qPCR method enables the pathogen load to be quantified using this process.
  • the nucleotides are at least partially provided with fluorescent molecules which, when attached to the single strand of the DNA strand segment to be detected, activate a fluorescent property. After the double strands have been built up, a fluorescence value can be determined after each cycle, which depends on the number of DNA strand segments produced.
  • a qPCR curve can then be determined from the determined fluorescence values (intensity values), which curve has a sigmoid shape when the DNA strand section to be detected is present in the substance to be examined.
  • the measured qPCR curves can be afflicted with artifacts, so that, as a rule, several parallel measurements are carried out in order to enable a more precise evaluation of the qPCR curves by averaging the measured values.
  • a method for operating a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method comprising the following steps:
  • the qPCR method has a cyclical repetition of the steps of denaturation, annealing and elongation.
  • denaturing is at a high temperature
  • the entire double-stranded DNA in the substance to be examined is split into two single strands.
  • the annealing step one of the primers added to the substance is bound to the single strands, which primers specify the starting point of the amplification of the DNA strand segments to be detected.
  • elongation step a second complementary DNA strand section is built up from free nucleotides on the single strands provided with the primer. After each of these cycles, the amount of DNA in the DNA strand segments to be detected has ideally doubled.
  • the qPCR curve obtained in this way has three distinct phases, namely a baseline in which the intensity of the fluorescence of the fluorescent light emitted by built-in markers cannot yet be distinguished from the background fluorescence, an exponential phase in which the fluorescence intensity varies over the Baseline increases, that is to say becomes visible, with the fluorescence signal increasing exponentially in proportion to the amount of DNA strand segments to be detected due to the doubling of the DNA strands in each cycle, and a plateau phase in which the reagents, i. H. the primer and the free nucleotides are no longer available in the required concentration and no further duplication takes place.
  • the so-called ct (cycle threshold) value is decisive for the detection of a predetermined DNA strand section to be detected, which can correspond to a pathogen, for example.
  • the ct value determines the beginning of the exponential phase and is determined by exceeding a specific limit value that is defined for the DNA strand segment to be detected and which is identical for all samples for the DNA strand segment to be detected, or it is calculated by the second Derivation of the qPCR curve determined in the exponential phase and corresponds to the intensity value of the steepest rise in the qPCR curve. If the target value is known, the initial concentration of the DNA strand section to be detected in the substance to be examined can be determined by back-calculation. In reality, the qPCR curves are very imprecise and subject to considerable fluctuations.
  • a baseline drift can occur, which is used to describe the increase in background fluorescence over the measurement cycles. This means that even if there is no amplification, the fluorescence signal increases.
  • Other influencing factors that have a negative effect on the accuracy of the qPCR curve can result, for example, from thermal noise, fluctuations or metering tolerances in the reagent concentration, air inclusions and artifacts in the fluorescence volume.
  • One idea of the above method is to use a data-based classification model, in particular in the form of an artificial neural network, in particular a deep neural network or a recurrent neural network, in particular an LSTM, or in the form of a support vector machine, to decide whether a measured qPCR curve indicates that the DNA strand segment to be detected occurs or not in the substance to be examined. Since measured qPCR curves are usually very noisy, the use of the trained, data-based classification model enables the qPCR curve shape to be assessed more reliably, even in borderline cases, to determine whether the DNA strand segment to be detected occurs in the substance to be examined or not.
  • the classification model can be trained to provide a classification result as a function of the qPCR curve, which or not indicates the presence of a DNA strand section to be detected.
  • residual error profiles between the measured qPCR curve and a parameterized presence function and a parameterized non-existence function can be determined, the classification model being trained to provide a classification result, depending on at least one of the residual error profiles, which indicates the presence of a DNA strand section to be detected or not.
  • the residual error profiles between the parameterized presence curve profile or the parameterized non-presence curve profile and the actual measured qPCR curve can then be evaluated with the aid of a trained data-based classification model.
  • the classification model is trained to decide whether the respective curve fit is based on a parameterized ideal course that comes closest to the measured course of the qPCR curve. This means that the classification model is used to determine whether the measured qPCR curve corresponds more closely to an existence qPCR curve or a non-existence qPCR curve.
  • the presence of a DNA strand section to be detected is determined if the classification result indicates the presence of the DNA strand section to be detected based on the residual error profile from the parameterized presence function.
  • the absence of the DNA strand section to be detected can be determined if the classification result based on the residual error profile from the parameterized absence function indicates the absence of the DNA strand section to be detected.
  • the evaluation can be carried out by inferring the presence of the DNA strand section to be detected if the classification result confirms a curve fit with the presence curve and does not confirm a curve fit with the non-presence curve. Similarly, it is concluded that the DNA strand section to be detected is not present if the classification result confirms a curve fit with the absence of the curve profile and does not confirm a curve fit with the presence curve profile.
  • the second variant described above can be used with a classification model based on the existing domain knowledge that requires a less extensive training data set for its training requires. Overall, the use of a data-based classification model leads to a lower number of incorrect classifications compared to conventional methods.
  • a device for operating a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method the device being designed to carry out the following steps:
  • Figure 1 is a schematic representation of a cycle of a PCR
  • FIG. 2 shows a schematic representation of a typical qPCR curve with an intensity value profile
  • FIG. 3 shows a measured course of a qPCR curve
  • FIGS. 4a and 4b ideal courses of the qPCR curve for the case of a substance that cannot be detected or a substance that can be detected.
  • FIG. 5 shows a flow chart to illustrate a method for operating a qPCR measurement
  • FIG. 6 shows a flow chart to illustrate a further one
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a known PCR method with the steps of denaturing the annealing and the elongation.
  • the double-stranded DNA in a substance is broken into two single strands at a high temperature of, for example, over 90 ° C.
  • a so-called primer is attached to the single strands at a specific DNA position which marks the beginning of a DNA strand section to be detected. This primer represents the starting point of an amplification of the DNA strand section.
  • an elongation step S3 starting at the from the primer-marked position of the free nucleotides added to the substance of the complementary DNA strand section built up on the single strands, so that at the end of the elongation step the previously split single strands have been supplemented to form complete double strands.
  • steps S1 to S3 is carried out cyclically and the intensity values are recorded in order to obtain an intensity value profile as a qPCR curve.
  • the intensity value curve has a curve that is shown in FIG. Figure 2 shows a course of a normalized intensity I over the cycle index z.
  • This course is divided into three sections, namely a baseline section B, in which the fluorescence of the built-in fluorescence molecules cannot yet be distinguished from background fluorescence, an exponential section E, in which the intensity values are visible and increase exponentially, and in a plateau Section P, in which the increase in the intensity values flattens out because the reagents used (solution with nucleotides) have been used up and there is no further binding to broken single strands.
  • FIG. 3 shows, by way of example, a profile of the intensity values obtained during a real measurement as a qPCR curve.
  • FIGS. 4a and 4b show ideal courses of a qPCR curve without the presence of a DNA strand segment to be detected or with the presence of a DNA strand segment to be detected.
  • FIG. 5 shows a flow chart to illustrate a method for operating a qPCR measurement process.
  • the method can be carried out on a data processing device which controls a qPCR process on a PCR system and which receives an intensity value from a PCR system in each cycle, which indicates the intensity of a fluorescence as a function of a DNA strand section amplified during the qPCR, provides.
  • the method described below can be implemented in software and / or hardware in the data processing device.
  • step S11 the qPCR measurement is carried out in order to receive intensity values in successive cycles of a qPCR measurement.
  • the number of cycles for the qPCR measurement is around 30 to 60 cycles, preferably 40 cycles.
  • a qPCR curve is obtained which depicts the intensity values (or values derived therefrom) using a cycle index.
  • the intensity values of the qPCR curve are fed to a trained classification model.
  • the classification model is designed as a data-based model, such as B. an SVM (Support Vector Machine) or a deep neural network.
  • the data-based classification model can also be formed with a neural network of temporal convolution layers.
  • the classification model can be trained with data sets from actually measured qPCR courses, each of which is assigned a label that indicates whether or not the data set (qPCR curve) corresponds to a measurement of a substance that contains the DNA strand section to be detected.
  • step S13 it is determined in accordance with the result of the classification by the classification model whether the qPCR curve corresponds to the presence or absence of the DNA strand section to be detected, that is to say indicates whether the DNA strand section to be detected is contained in the substance or not.
  • step S14 the PCR process is carried out in accordance with the classification result.
  • the qPCR method can be operated in that when the presence of the DNA strand section to be detected is detected, it is signaled that a ct value can be determined and the ct value is determined from the parameterized presence function.
  • FIG. 6 shows a flow chart to illustrate an alternative method for operating the PCR measurement and for evaluating a measured qPCR curve.
  • step S21 a qPCR measurement is carried out with the aid of a qPCR method and a qPCR curve is determined by successively measuring intensity values.
  • a predetermined parametric non-existence function is first parameterized in that the measured qPCR curve is fitted to the non-existence function.
  • the non-existence function can be a linear function, as shown in FIG. 4a, which essentially corresponds to the course characteristic of a baseline. Fitting to the non-existence function can take place, for example, with the help of a least squares minimization.
  • step S23 the measured qPCR curve is fitted to a presence function.
  • the presence function corresponds to a parameterized function which essentially corresponds to a course characteristic as shown in FIG. 4b.
  • the presence function can have a sigmoid function. By parameterizing the presence function, the measured qPCR curve can be fitted to the presence function.
  • step S24 residual error profiles of the measured qPCR curve for the parameterized presence function and for the parameterized non-presence function are determined.
  • step S25 the residual error profiles are fed to a data-based classification model.
  • the classification model is trained on the basis of training data, the residual error curves the corresponding Assigns presence or absence function. That is, the training data indicate whether a residual error profile from the parameterized presence function confirms the presence of the string section to be detected or not. The training data also indicate whether the residual error profile from the parameterized non-existence function confirms the non-existence of the string section to be detected or not.
  • step S25 it is determined with the aid of the residual error profile that a measured qPCR curve indicates the presence of the DNA strand section to be detected in the substance if the classification model confirms the residual error profile from the presence function.
  • the residual error profile is used to determine that a measured qPCR curve indicates the absence of the DNA strand section to be detected in the substance if the classification model confirms the residual error profile from the non-presence function.
  • the classification result contains the residual error profile of the corresponding parameterized presence function or the parameterized non-existence function on which the residual error profile is based, it is determined that the DNA strand section to be detected exists or does not exist.
  • the result of the classification result with regard to the residual error profile is a parameterized presence or absence function that is the opposite of the residual error profile, a decision can be made to reject the qPCR measurement, since a clear decision about the presence or absence of the DNA strand section to be detected is not made can be.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Computer-implementiertes Verfahren zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren, mit folgenden Schritten: - Zyklisches Ausführen (S1-S3) von qPCR-Zyklen; - Messen (S11) eines Intensitätswertes einer Fluoreszenz zu jedem qPCR- Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten; - Auswerten (S12) des Verlaufs der qPCR-Kurve mithilfe eines datenbasierten Klassifikationsmodells, das trainiert ist, um ein Klassifikationsergebnis abhängig von dem Verlauf der qPCR-Kurve bereitzustellen (S13); - Betreiben (S14) des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Klassifikationsergebnis der Auswertung des Verlaufs der qPCR-Kurve.

Description

Beschreibung
Titel
Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung eines gPCR-Verfahrens
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft die Anwendung eines Polymerase- Kettenreaktionsverfahrens (PCR-Verfahrens), insbesondere zur Detektion des Vorliegens eines Erregers. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Auswertung von qPCR-Messungen.
Technischer Hintergrund
Zur Detektion von DNA-Strangabschnitten in einer zu untersuchenden Substanz, wie beispielsweise einem Serum oder dergleichen, werden in automatisierten Systemen PCR-Verfahren durchgeführt. Die PCR-Systeme ermöglichen es, bestimmte zu detektierende DNA-Strangabschnitte, die z.B. einem Erreger zuzuordnen sind, zu amplifizieren und zu detektieren. Ein PCR-Verfahren umfasst generell eine zyklische Anwendung der Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation. Insbesondere wird beim PCR-Prozess ein DNA-Doppelstrang in Einzelstränge aufgespalten und diese jeweils durch Anlagerung von Nukleotiden wieder vervollständigt, um die DNA-Strangabschnitte in jedem Zyklus zu vervielfältigen.
Das qPCR-Verfahren ermöglicht die Erregerlast, nachgewiesen mit diesem Prozess zu quantifizieren. Dazu sind die Nukleotide zumindest teilweise mit Fluoreszenzmolekülen versehen, die bei Anbinden an den Einzelstrang des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts eine Fluoreszenzeigenschaft aktivieren. Nach dem Aufbau der Doppelstränge kann nach jedem Zyklus ein Fluoreszenzwert ermittelt werden, der von der Anzahl der erzeugten DNA- Strangabschnitte abhängt.
Im Laufe der Amplifikation kann dann aus den ermittelten Fluoreszenzwerten (Intensitätswerten) eine qPCR-Kurve ermittelt werden, die bei Vorliegen des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts in der zu untersuchenden Substanz einen sigmoidförmigen Verlauf hat. Die gemessenen qPCR-Kurven können in der Realität mit Artefakten behaftet sein, so dass in der Regel mehrere parallele Messungen durchgeführt werden, um durch eine Mittelwertbildung der Messwerte eine genauere Auswertung der qPCR-Kurven zu ermöglichen.
Offenbarung der Erfindung
Erfindungsgemäß sind ein Verfahren zum Durchführen eines qPCR-Verfahrens gemäß Anspruch 1 sowie eine Vorrichtung und ein qPCR-System gemäß den nebengeordneten Ansprüchen vorgesehen.
Weitere Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Gemäß einem ersten Aspekt ist ein Verfahren zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren vorgesehen, mit folgenden Schritten:
- Zyklisches Ausführen von qPCR-Zyklen
Messen eines Intensitätswertes einer Fluoreszenz nach oder während jedem qPCR-Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten;
- Auswerten des Verlaufs der qPCR-Kurve mithilfe eines datenbasierten Klassifikationsmodells, das trainiert ist, um ein Klassifikationsergebnis abhängig von dem Verlauf der qPCR-Kurve bereitzustellen;
Betreiben des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Klassifikationsergebnis der Auswertung des Verlaufs der qPCR-Kurve.
Das qPCR-Verfahren weist eine zyklische Wiederholung der Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Elongation auf. Bei der Denaturierung wird bei einer hohen Temperatur die gesamte doppelsträngige DNA in der zu untersuchenden Substanz in zwei Einzelstränge aufgespalten. In dem Schritt des Annealing wird an die Einzelstränge einer der Substanz zugegebenen Primer angebunden, die den Startpunkt der Amplifizierung der zu detektierenden DNA- Strangabschnitte vorgeben. Bei dem Schritt der Elongation wird ein zweiter komplementärer DNA-Strangabschnitt aus freien Nukleotiden auf den mit dem Primer versehenen Einzelsträngen aufgebaut. Nach jedem dieser Zyklen hat sich also idealerweise die DNA-Menge der zu detektierenden DNA-Strangabschnitte verdoppelt.
Durch die Anwendung des qPCR-Verfahrens werden in die zu detektierenden DNA-Strangabschnitte Fluoreszenzmoleküle als Marker eingebaut, so dass über eine Messung der Intensität der Fluoreszenz nach jedem Elongationsschritt ein zeitlicher Verlauf der Intensitätswerte ermittelt werden kann. Die so erhaltene qPCR-Kurve weist dabei drei distinkte Phasen auf, nämlich eine Baseline, in der die Intensität der Fluoreszenz des von eingebauten Markern emittierten Fluoreszenzlichts noch nicht von der Hintergrund-Fluoreszenz zu unterscheiden ist, einer exponentiellen Phase, in der die Fluoreszenzintensität über die Baseline ansteigt, also sichtbar wird, wobei durch die Verdoppelung der DNA-Stränge in jedem Zyklus das Fluoreszenzsignal proportional zur Menge der zu detektierenden DNA-Strangabschnitte exponentiell ansteigt, und einer Plateau-Phase, in der die Reagenzien, d. h. der Primer und die freien Nukleotide, nicht mehr in der benötigten Konzentration vorhanden sind und keine weitere Verdoppelung stattfindet.
Für den Nachweis eines vorgegebenen zu detektierenden DNA-Strangabschnitts, der beispielsweise einem Erreger entsprechen kann, ist hierbei der sogenannte ct (cycle threshold)-Wert maßgeblich. Der ct-Wert bestimmt den Beginn der exponentiellen Phase und wird durch Überschreiten eines spezifischen Grenzwerts, der für den jeweils zu detektierenden DNA-Strangabschnitt festgelegt ist und der für alle Proben für den zu detektierenden DNA-Strangabschnitt identisch ist, ermittelt oder rechnerisch durch die zweite Ableitung der qPCR-Kurve in der exponentiellen Phase ermittelt und dem Intensitätswert des steilsten Anstiegs der qPCR-Kurve entspricht. Ist der Zielwert bekannt, kann durch Rückrechnung die Anfangskonzentration des zu detektierenden DNA- Strangabschnitts in der zu untersuchenden Substanz bestimmt werden. In der Realität sind die qPCR-Kurven sehr ungenau und erheblichen Schwankungen unterworfen. Es kann ein Baseline-Drift auftreten, mit der das Ansteigen der Hintergrundfluoreszenz über die Messzyklen bezeichnet wird. Das heißt, dass, selbst wenn keine Amplifikation stattfindet, das Fluoreszenzsignal ansteigt. Weitere Einflussfaktoren, die sich negativ auf die Genauigkeit der qPCR- Kurve auswirken, können beispielsweise aus thermischem Rauschen, Schwankungen bzw. Zumesstoleranzen in der Reagenzkonzentration, Lufteinschlüsse und Artefakten im Fluoreszenzvolumen resultieren.
In herkömmlichen qPCR-Systemen findet einerseits eine softwarebasierte Korrektur der qPCR-Kurven statt, andererseits kann vorgesehen sein, eine Probe unter gleichen Bedingungen mehrfach zu messen und die resultierenden qPCR- Kurven durch Mittelwertbildung zu glätten. Dies erfordert jedoch einen erhöhten Aufwand.
Eine Idee des obigen Verfahrens besteht darin, mithilfe eines datenbasierten Klassifikationsmodells, insbesondere in Form eines künstlichen neuronalen Netzes, insbesondere eines tiefen neuronalen Netzes oder eines rekurrenten neuronalen Netzes, insbesondere eines LSTM, oder in Form einer Support Vector Machine, zu entscheiden, ob eine gemessene qPCR-Kurve angibt, dass der zu detektierende DNA-Strangabschnitt in der zu untersuchenden Substanz vorkommt oder nicht. Da gemessene qPCR-Kurven in der Regel stark rauschbehaftet sind, kann durch die Benutzung des trainierten datenbasierten Klassifikationsmodells der qPCR-Kurvenverlauf auch in Grenzfällen zuverlässiger dahingehend bewertet werden, ob der zu detektierende DNA-Strangabschnitt in der zu untersuchenden Substanz vorkommt oder nicht.
Das Klassifikationsmodell kann trainiert sein, um abhängig von der qPCR-Kurve ein Klassifikationsergebnis bereitzustellen, das ein Vorhandensein eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts angibt oder nicht. Insbesondere ist es möglich, das datenbasierte Klassifikationsmodell auf gelabelte qPCR-Kurven als Trainingsdaten zu trainieren, so dass eine gemessene qPCR-Kurve in entsprechender Weise klassifiziert werden kann. Dies erfordert jedoch ein umfangreiches Training des Klassifikationsmodells mit einer hohen Anzahl von Datensätzen aus manuell klassifizierten bzw. gelabelten qPCR-Kurven, da keine Vorannahmen berücksichtigt werden.
Weiterhin können Restfehlerverläufe zwischen der gemessenen qPCR-Kurve und einer parametrierten Vorhandenseinsfunktion und einer parametrierten Nichtvorhandenseinsfunktion bestimmt werden, wobei das Klassifikationsmodell trainiert ist, um abhängig von mindestens einer der Restfehlerverläufe ein Klassifikationsergebnis bereitzustellen, das ein Vorhandensein eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts angibt oder nicht. Somit ist es alternativ möglich, die gemessene qPCR-Kurve an parametrisierte Idealverläufe einer qPCR-Kurve bei Vorhandensein eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts (Vorhandenseins-Kurvenverlauf) in der zu untersuchenden Substanz und bei Nichtvorhandensein eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts (Nicht- Vorhandenseins-Kurvenverlauf) in der zu untersuchenden Substanz zu fitten. Dies erfolgt durch Parametrisierung des Vorhandenseins-Kurvenverlauf und des Nicht- Vorhandenseins-Kurvenverlauf an die gemessene qPCR-Kurve. Die Restfehlerverläufe zwischen dem parametrisierten Vorhandenseins-Kurvenverlauf bzw. dem parametrisierten Nicht-Vorhandenseins-Kurvenverlauf und der tatsächlichen gemessenen qPCR-Kurve können dann mithilfe eines trainierten datenbasierten Klassifikationsmodells ausgewertet werden. Das Klassifikationsmodell ist dabei trainiert, zu entscheiden, ob der jeweilige Kurvenfit auf einem parametrisierten Idealverlauf basiert, der dem gemessenen Verlauf der qPCR-Kurve am nächsten kommt. Das heißt, mithilfe des Klassifikationsmodells wird festgestellt, ob die gemessene qPCR-Kurve eher einer Vorhandensein- qPCR-Kurve oder Nichtvorhandensein-qPCR-Kurve entspricht.
Dabei wird ein Vorhandensein eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts festgestellt, wenn das Klassifikationsergebnis basierend auf dem Restfehlerverlauf aus der parametrierten Vorhandenseinsfunktion das Vorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts anzeigt. Entsprechend kann ein Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts festgestellt werden, wenn das Klassifikationsergebnis basierend auf dem Restfehlerverlauf aus der parametrierten Nichtvorhandenseinsfunktion das Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts anzeigt. Die Auswertung kann erfolgen, indem auf ein Vorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitt geschlossen wird, wenn das Klassifikationsergebnis einen Kurvenfit mit dem Vorhandenseins-Kurvenverlauf bestätigt und einen Kurvenfit mit dem Nicht-Vorhandenseins-Kurvenverlauf nicht bestätigt. Analog wird auf ein Nicht-Vorhandensein des zu detektierenden DNA- Strangabschnitt geschlossen, wenn das Klassifikationsergebnis einen Kurvenfit mit dem Nicht-Vorhandenseins-Kurvenverlauf bestätigt und einen Kurvenfit mit dem Vorhandenseins-Kurvenverlauf nicht bestätigt.
Während die erste oben beschriebene Variante mögliche fehlerhafte oder ungenaue Grundannahmen über die zugrundeliegenden typischen Kurvenverläufe vermeidet und auch unbekannte Zusammenhänge und Dynamiken abbilden kann, kann die zweite oben beschriebene Variante aufgrund des vorhandenen Domänenwissens mit einem Klassifikationsmodell verwendet werden, das für sein Training einen weniger umfangreichen Trainingsdatensatz erfordert. Insgesamt führt die Nutzung eines datenbasierten Klassifikationsmodells zu einer geringeren Anzahl von Fehlklassifikationen im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren.
Es kann vorgesehen sein, dass das qPCR-Verfahren betrieben wird, indem bei Feststellen eines Vorhandenseins des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts, signalisiert wird, dass ein ct-Wert ermittelbar ist, und/oder der ct-Wert aus der parametrierten Vorhandenseinsfunktion ermittelt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist eine Vorrichtung zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren, wobei die Vorrichtung ausgebildet ist, um folgende Schritte auszuführen:
- Zyklisches Ausführen von qPCR-Zyklen
Messen eines Intensitätswertes einer Fluoreszenz zu jedem qPCR-Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten;
- Auswerten des Verlaufs der qPCR-Kurve mithilfe eines datenbasierten Klassifikationsmodells, das trainiert ist, um ein Klassifikationsergebnis abhängig von dem Verlauf der qPCR-Kurve bereitzustellen;
Betreiben des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Klassifikationsergebnis der Auswertung des Verlaufs der qPCR-Kurve. Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Ausführungsformen werden nachfolgend anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Figur 1 eine schematische Darstellung eines Zyklus eines PCR-
Verfahrens;
Figur 2 eine schematische Darstellung einer typischen qPCR-Kurve mit einem Intensitätswerteverlauf;
Figur 3 ein gemessener Verlauf einer qPCR-Kurve;
Figur 4a und 4b ideale Verläufe der qPCR-Kurve für den Fall einer nicht nachweisbaren Substanz bzw. einer nachweisbaren Substanz; und
Figur 5 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Verfahrens zum Betreiben einer qPCR-Messung; und
Figur 6 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines weiteren
Verfahrens zum Betreiben einer qPCR-Messung.
Beschreibung von Ausführungsformen
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung eines an sich bekannten PCR- Verfahrens mit den Schritten der Denaturierung des Annealing und der Elongation.
In dem Schritt des Annealing S1 wird bei einer hohen Temperatur von beispielsweise über 90°C die doppelsträngige DNA in einer Substanz in zwei Einzelstränge aufgebrochen. In einem nachfolgenden Annealing-Schritt S2 wird an die Einzelstränge an einer bestimmten DNA-Position, die einen Beginn eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts markiert, ein sogenannter Primer angebunden. Dieser Primer stellt den Startpunkt einer Amplifizierung des DNA- Strangabschnitts dar. In einem Elongationsschritt S3 wird beginnend an der von dem Primer markierten Position aus der Substanz zugesetzten freien Nukleotiden der komplementäre DNA- Strangabschnitts an den Einzelsträngen aufgebaut, so dass am Ende des Elongationsschrittes die zuvor aufgespaltenen Einzelstränge zu vollständigen Doppelsträngen ergänzt worden sind.
Durch Versehen der freien Nukleotide bzw. des Primers mit Fluoreszenzmolekülen, die nur in dem an den DNA-Strangabschnitt gebundenen Zustand Fluoreszenzeigenschaften aufweisen, ist es möglich, durch Ermitteln einer Intensität einer Fluoreszenz im Anschluss an den Elongationsschritt S3 einen Intensitätswertes der Fluoreszenz durch eine geeignete Messung zu erhalten. Der gemessenen Intensität des Fluoreszenzlichts wird ein Intensitätswert zugeordnet.
Das Verfahren der Schritte S1 bis S3 wird zyklisch ausgeführt und die Intensitätswerte aufgezeichnet, um einen Intensitätswerteverlauf als eine qPCR- Kurve zu erhalten.
Der Intensitätswerteverlauf hat im Idealfall einen Verlauf, der in Figur 2 dargestellt ist. Figur 2 zeigt einen Verlauf einer normalisierten Intensität I über dem Zyklusindex z. Dieser Verlauf unterteilt sich in drei Abschnitte, nämlich einen Baseline-Abschnitt B, in dem die Fluoreszenz der eingebauten Fluoreszenzmoleküle noch nicht von einer Hintergrundfluoreszenz zu unterscheiden ist, einen exponentiellen Abschnitt E, in dem die Intensitätswerte sichtbar sind und exponentiell ansteigen, und in einem Plateau-Abschnitt P, in dem sich der Anstieg der Intensitätswerte abflacht, da die verwendeten Reagenzien (Lösung mit Nukleotiden) aufgebraucht sind und keine weitere Anbindung an aufgebrochenen Einzelsträngen stattfindet.
In Figur 3 ist beispielhaft ein bei einer realen Messung erhaltener Verlauf der Intensitätswerte als qPCR-Kurve dargestellt. Man erkennt starke Schwankungen, die sich aus einer Hintergrundfluoreszenz, thermisches Rauschen, Schwankungen in den Reagenzkonzentrationen sowie Bläschen und Artefakte im Fluoreszenzvolumen ergeben können. Man erkennt, dass die Bestimmung des Baseline-Abschnitts, des exponentiellen Abschnitts und des Plateau-Abschnitts der qPCR-Kurve nicht ohne weiteres möglich ist. Figur 4a und 4b zeigen ideale Verläufe einer qPCR-Kurve ohne Vorliegen eines nachzuweisenden DNA-Strangabschnitts bzw. mit Vorliegen eines nachzuweisenden DNA-Strangabschnitts.
In Figur 5 ist ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Verfahrens zum Betreiben eines qPCR-Messprozesses dargestellt. Das Verfahren kann auf einer Datenverarbeitungseinrichtung ausgeführt werden, die einen qPCR-Prozess auf einem PCR-System steuert und die von einem PCR-System in jedem Zyklus einen Intensitätswert, der die Intensität einer Fluoreszenz abhängig von einem während der qPCR amplifizierten DNA-Strangabschnitt angibt, bereitstellt. In der Datenverarbeitungseinrichtung kann das nachfolgend beschriebene Verfahren in Software und/oder Hardware implementiert sein.
In Schritt S11 wird die qPCR-Messung durchgeführt, um Intensitätswerte in aufeinanderfolgenden Zyklen einer qPCR-Messung zu empfangen. Die Anzahl der Zyklen für die qPCR-Messung liegt bei etwa 30 bis 60 Zyklen, vorzugsweise bei 40 Zyklen. Man erhält eine qPCR-Kurve, die die Intensitätswerte (oder davon abgeleitete Werte) über einen Zyklusindex abbildet.
In Schritt S12 werden die Intensitätswerte der qPCR-Kurve einem trainierten Klassifikationsmodell zugeführt. Das Klassifikationsmodell ist als datenbasiertes Modell ausgebildet, wie z. B. eine SVM (Support Vector Machine) oder ein tiefes neuronales Netz. Alternativ kann das datenbasierte Klassifikationsmodell auch mit einem neuronalen Netz aus zeitlichen Konvolutionsschichten gebildet sein.
Das Klassifikationsmodell kann mit Datensätzen aus real gemessenen qPCR- Verläufen trainiert sein, denen jeweils ein Label zugeordnet ist, das angibt, ob der Datensatz (qPCR-Kurve) einer Messung einer Substanz, die den zu detektierenden DNA-Strangabschnitt enthält, entspricht oder nicht.
In Schritt S13 wird entsprechend dem Ergebnis der Klassifikation durch das Klassifikationsmodell bestimmt, ob die qPCR-Kurve ein Vorhandensein oder ein Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts entspricht, d. h. angibt, ob der zu detektierenden DNA-Strangabschnitt in der Substanz enthalten ist oder nicht. In Schritt S14 wird das PCR-Verfahren entsprechend dem Klassifikationsergebnis ausgeführt. Insbesondere kann das qPCR-Verfahren betrieben werden, indem bei Feststellen eines Vorhandenseins des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts, signalisiert wird, dass ein ct-Wert ermittelbar ist, und der ct-Wert aus der parametrierten Vorhandenseinsfunktion ermittelt.
In Figur 6 ist ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines alternativen Verfahrens zum Betreiben der PCR-Messung und zur Auswertung einer gemessenen qPCR-Kurve dargestellt.
In Schritt S21 wird mithilfe eines qPCR-Verfahrens eine qPCR-Messung durchgeführt und eine qPCR-Kurve durch aufeinanderfolgendes Messen von Intensitätswerten bestimmt.
In Schritt S22 wird zunächst eine vorgegebene parametrische Nichtvorhandenseinsfunktion parametrisiert, indem die gemessene qPCR-Kurve an die Nichtvorhandenseinsfunktion gefittet wird. Beispielsweise kann die Nichtvorhandenseinsfunktion eine lineare Funktion, wie sie in Figur 4a dargestellt ist, sein, die im Wesentlichen der Verlaufscharakteristik einer Baseline entspricht. Das Fitten an die Nichtvorhandenseinsfunktion kann beispielsweise mithilfe einer Least-Squares-Minimierung erfolgen.
In Schritt S23 wird die gemessene qPCR-Kurve an eine Vorhandenseinsfunktion gefittet. Die Vorhandenseinsfunktion entspricht einer parametrisierten Funktion, die im Wesentlichen einer Verlaufscharakteristik, wie sie in Fig. 4b dargestellt ist, entspricht. Die Vorhandenseinsfunktion kann eine Sigmoid-Funktion aufweisen. Durch Parametrisieren der Vorhandenseinsfunktion kann die gemessene qPCR- Kurve an die Vorhandenseinsfunktion gefittet werden.
In Schritt S24 werden Restfehlerverläufe der gemessenen qPCR-Kurve zu der parametrisierten Vorhandenseinsfunktion und zu der parametrisierten Nichtvorhandenseinsfunktion ermittelt.
In Schritt S25 werden die Restfehlerverläufe einem datenbasierten Klassifikationsmodell zugeführt. Das Klassifikationsmodell ist basierend auf Trainingsdaten trainiert, die Restfehlerverläufe den entsprechenden Vorhandenseins- oder Nichtvorhandenseinsfunktion zuordnet. Das heißt, die Trainingsdaten geben an, ob ein Restfehlerverlauf aus der parametrisierten Vorhandenseinsfunktion das Vorhandensein des zu detektierenden Strangabschnitt bestätigt oder nicht. Weiterhin geben die Trainingsdaten an, ob der Restfehlerverlauf aus der parametrisierten Nichtvorhandenseinsfunktion das Nicht-Vorhandensein des zu detektierenden Strangabschnitt bestätigt oder nicht.
Entsprechend wird in Schritt S25 mithilfe des Restfehlerverlaufs festgestellt, dass eine gemessene qPCR-Kurve ein Vorhandensein des zu detektierenden DNA- Strangabschnitts in der Substanz angibt, wenn das Klassifikationsmodell den Restfehlerverlauf aus der Vorhandenseinsfunktion bestätigt. Analog wird mithilfe des Restfehlerverlaufs festgestellt, dass eine gemessene qPCR-Kurve ein Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts in der Substanz angibt, wenn das Klassifikationsmodell den Restfehlerverlauf aus der Nicht- Vorhandenseinsfunktion bestätigt. Das heißt, ergibt sich allgemein aus dem Restfehlerverlauf basierend auf der parametrierten Vorhandenseinsfunktion oder der parametrierten Nichtvorhandenseinsfunktion, dass das Klassifikationsergebnis den Restfehlerverlauf der entsprechenden parametrierten Vorhandenseinsfunktion oder der parametrierten Nichtvorhandenseinsfunktion, die dem Restfehlerverlauf zugrunde liegt, so wird festgestellt, dass der zu detektierende DNA-Strangabschnitt vorhanden bzw. nicht vorhanden ist.
Ergibt sich aus dem Klassifikationsergebnis bezüglich des Restfehlerverlaufs ein dem Restfehlerverlauf zugrunde liegenden parametrisierten Vorhandenseins- oder Nichtvorhandenseinsfunktion entgegengesetztes Ergebnis, so kann entschieden werden, die qPCR-Messung zu verwerfen, da eine eindeutige Entscheidung über ein Vorhandensein oder Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA- Strangabschnitts nicht getroffen werden kann.

Claims

Ansprüche
1. Computer-implementiertes Verfahren zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren, mit folgenden Schritten:
Zyklisches Ausführen (S1-S3) von qPCR-Zyklen;
Messen (S11) eines Intensitätswertes einer Fluoreszenz zu jedem qPCR-Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten;
Auswerten (S12) des Verlaufs der qPCR-Kurve mithilfe eines datenbasierten Klassifikationsmodells, das trainiert ist, um ein Klassifikationsergebnis abhängig von dem Verlauf der qPCR-Kurve bereitzustellen (S13);
Betreiben (S14) des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Klassifikationsergebnis der Auswertung des Verlaufs der qPCR- Kurve.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das datenbasierte Klassifikationsmodell ein neuronales Netz, insbesondere ein tiefes neuronales Netz oder ein rekurrentes neuronales Netz, insbesondere ein LSTM, oder ein Support Vector Machine Modell umfasst.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das Klassifikationsmodell trainiert ist, um abhängig von der qPCR-Kurve das Klassifikationsergebnis bereitzustellen, das ein Vorhandensein eines zu detektierenden DNA- Strangabschnitts angibt oder nicht.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei Restfehlerverläufe zwischen der gemessenen qPCR-Kurve und einer parametrierten Vorhandenseinsfunktion und einer parametrierten
Nichtvorhandenseinsfunktion bestimmt werden (S24), wobei das Klassifikationsmodell trainiert ist, um abhängig von mindestens einer der Restfehlerverläufe ein Klassifikationsergebnis bereitzustellen (S25), das ein Vorhandensein eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts angibt oder nicht.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei ein Vorhandensein eines zu detektierenden DNA-Strangabschnitts festgestellt wird, wenn das Klassifikationsergebnis basierend auf dem Restfehlerverlauf aus der parametrierten Vorhandenseinsfunktion das Vorhandensein des zu detektierenden DNA- Strangabschnitts anzeigt.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei ein Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts festgestellt wird (S25), wenn das Klassifikationsergebnis basierend auf dem Restfehlerverlauf aus der parametrierten Nichtvorhandenseinsfunktion das Nichtvorhandensein des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts anzeigt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das qPCR-Verfahren betrieben wird (S14), indem bei Feststellen eines Vorhandenseins des zu detektierenden DNA-Strangabschnitts, signalisiert wird, dass ein ct-Wert ermittelbar ist, der ct-Wert aus der parametrierten Vorhandenseinsfunktion ermittelt wird.
8. Vorrichtung zum Betreiben eines quantitativen Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-Verfahren, wobei die Vorrichtung ausgebildet ist, um folgende Schritte auszuführen:
Zyklisches Ausführen von qPCR-Zyklen
Messen eines Intensitätswertes einer Fluoreszenz zu jedem qPCR- Zyklus, um eine qPCR-Kurve aus Intensitätswerten zu erhalten; Auswerten des Verlaufs der qPCR-Kurve mithilfe eines datenbasierten Klassifikationsmodells, das trainiert ist, um ein Klassifikationsergebnis abhängig von dem Verlauf der qPCR-Kurve bereitzustellen;
Betreiben des qPCR-Verfahrens abhängig von dem Klassifikationsergebnis der Auswertung des Verlaufs der qPCR- Kurve.
9. Computerprogramm, welches dazu eingerichtet ist, alle Schritte eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 auszuführen.
10 Elektronisches Speichermedium, auf welchem ein Computerprogramm nach Anspruch 9 gespeichert ist.
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