CN115176314A - 用于实时pcr数据的定性评估的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种用于实时PCR数据的定性评估的方法，其中，将相配的样本的实时PCR扩增曲线分类为阴性曲线或阳性曲线。提供相配的样本的待分类的实时PCR扩增曲线，实时PCR扩增曲线带有相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的至少20个在时间上彼此相继的幅度值。此外，基于所述至少幅度值，确定品质量度、优选单个的品质量度，该品质量度指示待分类的实时PCR扩增曲线与直线的相似性。在进一步的步骤中，通过将品质量度与第一预设值进行比较来确定第一标准。进一步的步骤中，确定值序列，所述值序列指示待分类的实时PCR扩增曲线的斜率，并且确定第二标准，即，值序列是否超过第二预设值。最后，在满足所有上述标准的情况下，将实时PCR扩增曲线分类为阳性曲线。

Description

用于实时PCR数据的定性评估的方法
背景技术
实时PCR(聚合酶链式反应)，也称为实时聚合酶链式反应，是一种用于检测样本中的特定核酸(例如DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸))的方法。这种样本优选是生物样本。
在PCR过程中，相关的特征性的核酸片段被复制。在此，两个所谓的引物(也称为起始DNA分子)决定了要复制核酸的哪个区域。如果样本含有与引物相配合的核酸片段(也称为目标序列)，则引物可以与其结合，并且在一个循环过程中可以产生复制的目标序列。PCR过程经历多个循环，其中，在一个循环过程中在样本中存在不同的温度条件并且发生不同的反应。在存在与核酸相配合的引物的情况下，则通过处理多个循环进行目标序列的复制。
在对样本中的RNA进行特异性检测的情况下，首先使用逆转录酶将RNA转录为DNA。在DNA的特异性检测的情况下，则省略此步骤。在一个PCR循环内，在第一步骤中(所谓的变性)，则将样本加热到94至98℃左右，以便将DNA链彼此分离。然后在PCR循环的第二步骤中(即引物杂交)，将温度在特定的时间段上保持在预定的值上，该预定的值例如为55-65℃。在该第二步骤中，引物与适当的DNA部分结合。在PCR循环的第三步骤中(即延伸)，DNA聚合酶利用游离核苷酸填充缺失的链。大约68-72℃的温度条件在样本中在、例如30秒的预定的时间段上存在。如有可能，引物杂交和延伸也可以是带有相同反应条件的循环内的组合步骤。因此，PCR循环具有三个步骤或三个阶段，即变性、引物杂交和延伸。
在实时PCR的范围内，除了特异性引物外，使用DNA嵌入荧光染料(例如SYBR GreenI)或序列特异性荧光标记的DNA探针(FRET探针，例如TaqMan探针、分子信标或类似物)，以用于通过荧光增加实时跟踪DNA复制。在每个PCR循环结束时，光学测量荧光强度。只有当DNA被复制时，荧光强度才会增加。如果样本中缺少特定的核酸目标序列，则引物和荧光标记的DNA探针或荧光染料不能结合：不发生DNA复制，并且因此荧光信号或荧光强度不会增加。
发明内容
图1对此示例性地示出图表D，其中，绘制关于循环时间Z的荧光强度F。第一扩增曲线KA在代表在与特定引物和如有可能荧光标记的DNA探针相配合的目标序列、优选相配合的DNA区段存在于样本材料中的情况下的荧光信号F。曲线KA的荧光强度F因此以S形方式增加。另一个示例性扩增曲线K1在图6中示出，该扩增曲线具有相对应的在时间上彼此相继的循环指数的在时间上彼此相继的振幅值，在此循环指数为0至45。
图1还示出第二扩增曲线KB，其代表在样本中不存在作为与特定引物和如有可能荧光标记的DNA探针相配合的目标序列的相配合的核酸片段的情况。由于其他影响，如有可能在曲线KB中也可观察到荧光F的轻微增加。
主要任务是识别样本是否为阳性，即所研究的样本是否含有待探测的物质或特定核酸或特定核酸片段。因此必须将扩增曲线分类为阳性曲线或阴性曲线。阳性曲线具有近似S形的曲线走向。阳性曲线尤其具有起始阶段，此外具有线性阶段和平台阶段。阴性曲线具有近似线性的曲线走向。
在本申请的意义下，将扩增曲线分类为阳性曲线的判定等同于确定所研究的样本材料包含特定核酸或特定核酸片段的判定。特定核酸也可以称为待探测的核酸或待探测的核酸片段。在本申请的意义下，将扩增曲线分类为阴性曲线的判定等同于确定所研究的样本材料不包含特定核酸或特定核酸片段的判定。特定核酸也可以称为待探测的核酸或待探测的核酸片段。
图2示出用于在相同处理条件下在共同的测试运行中同时研究或处理多个样本P、PX的基本做法。在研究特定样本P的过程中，将由特定引物材料、荧光染料或荧光标记的DNA探针和其他反应组分(例如缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、盐、聚合酶、添加剂、如有可能另外的反应组分)组成的PCR混合物PM掺和至样本P。对其他样本PX可以进行同样的操作。该流程可以作为针对多个不同样本P、PX的共同的或同时的测试运行共同或同时进行。相应的样本P、PX则位于相应的反应容器RS中，这些反应容器优选地通过微量滴定板的相应凹陷部提供。同时，也可以在对应的相应反应容器中提供相应的对照样本KP。阳性对照PK或阳性对照样本则可靠地包含要探测的材料或要探测的核酸片段(目标序列)。PCR混合物PM也被掺和到阳性对照样本PK中。对于阴性对照样本NK也进行同样的操作，阴性对照样本可靠地不具有要探测的核酸片段(目标序列)或不具有要探测的材料。然后也将阴性对照样本转移到相应的反应容器中。
然后可以将以此方式填充的反应容器RS或微量滴定板放置到实时PCR仪器G的温控支架中。在刚刚提到的实时PCR仪器G中，聚合酶链式反应的温度曲线则在上述不同的步骤中在多个循环上运行以在相同的处理条件下处理样本P、NK、PK。然后在每个循环之后对于每个样本P、NK、PK测量并记录相应荧光值。然后可以在显示器A中显示相应样本P、NK、PK的相应所得到的实时PCR扩增曲线。样本P、阴性对照样本NK和阳性对照样本PK的整体因此可以在共同的条件下在共同的测试运行中进行处理。
如前所述，任务是将样本P的实时PCR扩增曲线分类为阴性曲线或阳性曲线。替代而言，这可以表达为如下判定，即，样本P是否包含待探测的特定材料或待探测的特定核酸片段(也称为核酸目标序列)。
为此提出了根据本发明的方法。
根据本发明的任务通过所提出的用于实时PCR数据的定性评估的方法，其中，将相配的样本的实时PCR扩增曲线分类为阴性曲线或阳性曲线。所述方法具有不同的步骤。在一个步骤中，提供相配的样本的待分类的实时PCR扩增曲线，所述实时PCR扩增曲线带有相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的至少20个在时间上彼此相继的幅度值。所述至少20个在时间上彼此相继的幅度值是如下数据组，该数据组足够代表PCR曲线的总体走向。所述提供优选地以数字数据的形式进行。在下一个步骤中，基于相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的所述至少20个在时间上彼此相继的幅度值，确定品质量度、优选单个的品质量度，该品质量度指示待分类的实时PCR扩增曲线与直线(GER)的相似性。尤其是，PCR扩增曲线具有相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的至少25个，优选至少30个，特别优选至少35个，完全特别优选至少40个在时间上彼此相继的幅度值。优选地，基于相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的至少20个，优选至少30个，特别优选所述至少35个，完全特别优选至少40个在时间上彼此相继的幅度值，确定品质量度、优选单个的品质量度。
在进一步的步骤中，通过将品质量度与第一预设值进行比较来确定第一标准，其中，如果品质量度低于第一预设值，则满足第一标准。在进一步的步骤中，确定值序列，所述值序列指示待分类的实时PCR扩增曲线的斜率，并且确定第二标准，即，值序列是否超过第二预设值，其中，如果值序列中的至少一个值超过第二预设值，则满足第二标准。最后，在满足所有上述标准的情况下，将相配的样本的实时PCR扩增曲线分类为阳性曲线。
在第一优选实施例中，品质量度是线性回归的决定量度(也称为经验决定量度)；该决定量度也称为R2值。在第二优选实施例中，品质量度为回归的标准误差或线性回归的标准误差，也称为“回归标准误差”。
根据本发明的方法的优点在于，不仅基于以下：作为第一标准是否存在扩增曲线相对于直线的相似性，或是否将指示曲线线性延伸的品质量度与预设值进行比较。根据本发明，还确定指示扩增曲线的斜率的值序列，并且检验第二标准，即，该斜率是否超过预设值。由此，因此作为附加的标准观察：扩增曲线的斜率在所关注的循环范围之一中是否足够强。换言之：不仅检验扩增曲线是否充分偏离直线，而且检验扩增曲线的斜率是否足够大。由此结合了两个标准来检验扩增曲线是否在简单的直线处发生偏离。
尤其是，根据本发明的优点在于，基于至少20个幅度值，确定尤其是单个的品质量度，该品质量度指示待分类的实时PCR扩增曲线与直线的相似性，并且然后将其与预设值进行比较，以确定第一标准。因此，不必针对扩增曲线的相应的片段确定多个相应的品质量度，并且然后将所述多个品质量度纳入到扩增曲线的评估中。根据本发明足够的是，确定一个、尤其是一个单个的品质量度并将其与第一预设值进行比较，并且值序列的仅至少一个值超过第二预设值，该值序列指示待分类的实时PCR扩增曲线的斜率。根据本发明的该解决方案的计算强度低于如下方法，在所述方法中，必须对于扩增曲线的相应的多个分段确定相应的参数值，并且然后必须将所述多个分段的所述多个参数值再次包括到最终评估中或所述多个参数值必须通过计算来总结。此外，所述至少20个幅度值代表实时PCR扩增曲线的足够的总体走向。由此实现了：比现有技术更可靠地将扩增曲线分类为阳性曲线，根据现有技术，仅考虑扩增曲线与直线的比较。
本发明的有利的实施例是从属权利要求的技术方案并且在以下描述中在部分参考附图的情况下更详细地解释。
优选地，PCR扩增曲线不具有前3个、优选前4个、特别优选前5个PCR循环指数的幅度值，从而不考虑这些。这允许早期的幅度值不被包括在评估中，因为这样的早期幅度值有时具有不期望的干扰参量并且不遵循零线，这实际上应该是这种情况。
所述方法优选地包括：借助中值滤波器来过滤值序列，所述值序列指示待分类的实时PCR扩增曲线的斜率，以及确定如下另外的标准，即，经中值过滤的值序列是否超过第三预设值。此外，所述方法优选地包括：在满足所有上述标准的情况下，将相配的样本的实时PCR扩增曲线分类为阳性曲线。所述另外的标准拦截了另外的不期望的错误情况。通过基于第三预设值确定该另外的标准，有利地检验斜率是否满足另外的标准。这允许更可靠地确定结果或更可靠地将样本的扩增曲线分类为阳性曲线。
此外，所述方法优选包括：
-提供阳性对照样本的实时PCR扩增曲线和阴性对照样本的实时PCR扩增曲线，
-确定第一副标准，即，阳性对照样本的实时PCR扩增曲线的最后一个荧光值是否超过最小值，
-确定第二副标准，即，阴性对照样本的实时PCR扩增曲线的最后一个荧光值是否不超过最大值，
-如果不满足至少一个所述副标准，则将相配的样本的实时PCR扩增曲线分类为无效。
原则上，在进行实时PCR时，可能会发生处理错误，例如关于温度变化曲线的处理错误，所述处理错误例如通过以下而变得显而易见的，即，阳性对照样本的扩增曲线的最后一个荧光值不超过最小值。同样，阴性对照样本的扩增曲线的最后一个荧光值实际上不可以超过特定的最大值，如果阴性样本被待检测的目标序列污染，该最大值可能作为该条件被违反。阴性对照样本的扩增曲线的最后一个荧光值则将超过预设值或最大值。
因此，这些另外的标准可用于探测PCR过程中的错误处理，然后避免将相配的样本的扩增曲线分类为有效。换言之，该方法的优选实施例是有利的，因为在此可以检验阳性对照样本的样本以及待分类的扩增曲线的相配的样本是否在实时PCR过程中按照规定得到处理。如果阳性对照样本和阴性对照样本由于至少一个所述副标准没有被满足而未能按照规定得到处理，则可以确定：相配的样本的实时PCR扩增曲线要被分类为无效。
此外，品质量度优选地被确定为关于待分类的实时PCR扩增曲线的线性回归的品质量度。此外，优选地通过检验线性回归的品质量度是否低于第一预设值来确定第一标准。
此外，所述方法优选包括：
-确定待分类的实时PCR扩增曲线的最后一个荧光值，
-并且根据待分类的实时PCR扩增曲线的最后一个荧光值，将相配的样本的实时PCR扩增曲线分类为阳性曲线。
在此，只有当所述最后一个荧光值(LFL)超过另一个预设值(VW4)时，才将PCR扩增曲线分类为阳性曲线。通过根据所述最后一个荧光值将相配的样本的扩增曲线分类为阳性曲线，可以再次提高分类结果的质量。
还提出了一种用于实时PCR数据的定性评估的设备。所述用于实时PCR数据的定性评估的设备包括存储单元，所述存储单元用于提供相配的样本的待分类的实时PCR扩增曲线，所述实时PCR扩增曲线带有相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的至少20个在时间上彼此相继的幅度值。此外，所述设备包括计算单元，所述计算单元用于基于相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的所述至少20个在时间上彼此相继的幅度值来确定品质量度、优选单个的品质量度，该品质量度指示待分类的实时PCR扩增曲线与直线的相似性。所述计算单元还构造用于通过将品质量度与第一预设值进行比较来确定第一标准，其中，如果品质量度低于第一预设值，则满足第一标准。所述计算单元还构造用于确定值序列，所述值序列指示待分类的实时PCR扩增曲线的斜率，并且用于确定第二标准，即，值序列是否超过第二预设值，其中，如果值序列中的至少一个值超过第二预设值，则满足第二标准。所述计算单元将相配的样本的实时PCR扩增曲线分类为阴性曲线或分类为阳性曲线，其中，在满足所有上述标准的情况下，所述计算单元将相配的样本的实时PCR扩增曲线分类为阳性曲线。所述设备优选地以与所提出方法的其他优选设计方案相对应的其他形式来设计。
还提出一种用于实时PCR数据的定性评估的计算机实现的方法，其中，将相配的样本的实时PCR扩增曲线分类为阴性曲线或阳性曲线，所述方法包括以下步骤：接收相配的样本的待分类的实时PCR扩增曲线，所述实时PCR扩增曲线带有相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的至少20个在时间上彼此相继的幅度值；基于相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的所述至少20个在时间上彼此相继的幅度值，确定品质量度、优选单个的品质量度，该品质量度指示待分类的实时PCR扩增曲线与直线的相似性；通过将品质量度与第一预设值进行比较来确定第一标准，其中，如果品质量度低于第一预设值，则满足第一标准；确定值序列，所述值序列指示待分类的实时PCR扩增曲线的斜率，并且确定第二标准，即，值序列是否超过第二预设值，其中，如果值序列(MK1′)中的至少一个值超过第二预设值，则满足第二标准；并且最后在满足所有上述标准的情况下，将相配的样本的实时PCR扩增曲线分类为阳性曲线。计算机实现的方法优选地以与所提出方法的其他优选设计方案相对应的其它形式来设计。
还提出了一种计算机程序产品，包括指令，当程序由计算机执行时，所述指令促使计算机执行所述计算机实现的方法。
附图说明
下面借助特定的实施例依据附图更详细地解释本发明，而不限制本发明的总体构思。
附图中：
图1示出示例性的扩增曲线，
图2示出在测试运行中多个样本以及对照样本和试剂的使用的原理，
图3示出用于执行所提出方法的优选实施例的优选步骤，
图4示出用于执行所提出方法的优选实施例的进一步的优选步骤，
图5示出阳性对照样本和阴性对照样本的示例性扩增曲线，
图6示出样本的扩增曲线，
图7示出修改后的扩增曲线以及直线，
图8示出代表图6中的扩增曲线的斜率行为的曲线，
图9示出指示图6中的相应的扩增曲线的相应的斜率的值序列，
图10示出图6中的扩增曲线和预设值，
图11示出所提出的设备的优选实施例，
图12示出针对不同测试组的不同测试结果的不同表格。
具体实施方式
图6示出不同的扩增曲线K1、K2。绘制关于循环时间Z的荧光强度F。曲线K1应分类为阳性曲线，该曲线具有S形斜率。曲线K2应分类为阴性的，该曲线不具有上升或具有早期线性的上升。曲线K1、K2被归一化到值范围0...1。曲线K1和K2有相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的至少20个在时间上彼此相继的幅度值。
PCR扩增曲线优选具有相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的至少20个，尤其是至少25个，优选至少30个，特别优选至少35个，完全特别优选至少40个在时间上彼此相继的幅度值。品质量度优选基于相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的至少20个在时间上彼此相继的幅度值确定，尤其是至少25个，优选至少30个，特别优选至少35个，完全特别优选至少40个在时间上彼此相继的幅度值。
优选地，PCR扩增曲线优选不具有前3个、优选前4个、特别优选前5个PCR循环指数的幅度值，从而不考虑这些幅度值。这允许早期的幅度值不被包括在评估中，因为这样的早期幅度值有时具有不期望的干扰参量并且不遵循零线，这实际上应该是这种情况。
下面将作为示例更详细地解释曲线K1的处理或评估。针对曲线K2的相应处理值也在其他图中示出。
根据图3，可以提供扩增曲线K1作为数据组DT。图5示出来自同一测试运行的阳性对照样本的扩增曲线P1的示例性图示和来自同一测试运行的阴性对照样本的扩增曲线N1的示例性图示。此外，阳性对照样本的扩增曲线P1和阴性对照样本的扩增曲线N1优选地由相同的测试运行提供，优选地通过相同的数据组DT或此处未更详细示出的另一个数据组。阳性对照样本PK和阴性对照样本NK的所提供的扩增曲线也可以优选地来自与所述一个样本P或所述多个样本P的扩增曲线不同的测试运行，只要它们是在相同的处理条件下产生的，并且可以通过这里不详述的另一个数据组来提供。
优选地，也提供预设值MIW、MAW。
在第一步骤S1中，图5中的扩增曲线P1、N1则可以优选地借助预设值MIW和MAW来检验。在此，检验阳性对照样本的扩增曲线P1是否在最后一个循环指数处或以其最后一个荧光值超过由预设值MIW给出的最小终端荧光。由此例如检验图2中的仪器G内的处理条件是否已经相应地得到遵守。由此也可检验PCR试剂是否仍起作用以及PCR试剂是否正确移液在一起。还可以检验配药是否已正确移液。
此外，还检验阴性对照样本的扩增曲线N1是否在最后一个循环指数处或以其最后一个荧光值不超过由预设值MAW给出的最大终端荧光。由此，可以揭露例如PCR试剂或用于样本提取的试剂与待检测的目标序列发生试剂污染。如果阴性对照样本的配药(Ansatz)被污染，则曲线N1的最后一个荧光值将超过预设值MAW。
因此确定第一副标准：阳性对照样本的扩增曲线的最后一个荧光值是否超过最小值；以及第二副标准，阴性对照样本的扩增曲线的最后一个荧光值是否不超过最大值。然后将阳性对照样本的曲线P1和阴性对照样本的曲线K1视为有效，然后将两个副标准视为满足。如果两个副标准都满足，则推断出相配的样本P的扩增曲线K1原则上也是有效的，并且则因此转移至步骤S2。如果至少一个所述副标准不满足，则推断出相配的样本的扩增曲线K1无效，然后中止该方法。
对于另外的优选对照样本(例如内部对照或内源对照)和相关曲线，可以优选地确定和检验另外的副标准。例如，为了表明从患者样本中成功提取核酸，可例如需要进行内部对照。然而，这些另外的副标准仅优选地在另外的方法中实施。
图6示出相配的样本的所关注的扩增曲线K1。此外，图6示出作为阴性曲线的示例的另外的扩增曲线K2。在步骤S2中，优选地对图6中的曲线K1进行中值滤波，从而得到图7中的修改后的扩增曲线K11。类似情况适用于图6或7中的曲线K2或K21。
中值滤波优选这样进行，使得扩增曲线K1的三个值总是供应给中值滤波器并且所得到的值则定义曲线K11的值。中值滤波器可以实现为滑动滤波器。
然后在步骤S3中确定品质量度RG，品质量度指示修改后的实时PCR扩增曲线K11与直线的相似性。优选地，在步骤S3中，品质量度RG被确定为关于待分类的实时PCR扩增曲线的线性回归的品质量度。优选地，这通过确定线性回归直线GER来完成，如图7中所示，并通过将品质量度RG确定为决定量度R2(也称为决定系数)，该决定量度尤其是用于判断待分类的实时PCR扩增曲线与线性回归直线GER的匹配品质的量度。相应的回归直线在图7中没有针对曲线K21绘制。
品质量度RG可以理解为修改后的实时PCR扩增曲线K11与直线的相似性的品质量度，并且也可以理解为待分类的实时PCR扩增曲线K1与直线的相似性的品质量度。
在第一优选实施例中，品质量度是线性回归的决定量度(也称为经验决定量度)；该决定量度也称为R2值。在第二优选实施例中，品质量度为回归的标准误差或线性回归的标准误差(也称为“回归标准误差”)。
然后在步骤S4中提供第一预设值VW1。然后通过将品质量度RG与第一预设值VW1进行比较来确定第一标准。优选地，将品质量度RG是否低于预设值VW1确定为第一标准。特别优选地，将关于待分类的扩增曲线K1的线性回归的决定量度R2是否低于预设值VW1确定为第一标准。如果不满足第一个标准，则扩增曲线K1被分类为阴性。第一预设值VW1优选地是介于0.92至0.99之间的值。
如果满足第一标准，则进一步移至步骤S5。因此，曲线K1被认为是潜在阳性的。
在步骤S5中，首先确定图6中的曲线K1的斜率曲线K1′(参见图8)。示例性地，在图8中也还指示针对图6中的曲线K2的斜率曲线K2′。
此外，图8中的斜率曲线K1′在步骤S5中经受中值滤波，从而得到滤波后的斜率值MF′。图9中的条形图示出所得到的值序列MK1′，该值序列指示图6中的待分类的扩增曲线K1的斜率K′。此外还示出值序列MK2′，该值序列指示图6中的曲线K2的斜率K2′。图9在此示出从1到10的指数值I以及在其之上分别相应呈现的循环值，其通过中值滤波进行汇总。此外绘制第二预设值VW2。
然后在步骤S6中提供第二预设值VW2。第二预设值优选地是介于0.002至0.01之间的值。
然后在步骤S6中将值序列MK1′的至少一个值是否超过第二预设值VW2确定作为第二标准。如果不是这种情况，则曲线K1被分类为阴性曲线。如果满足第二标准，则转移至步骤S7，从而将曲线K1分类为潜在的阳性曲线。
如果满足第一和第二标准，则将实时PCR扩增曲线分类为阳性曲线。
总之，可以规定，在根据本发明的方法中，提供扩增曲线K1，然后确定品质量度，该品质量度指示待分类的实时PCR扩增曲线与直线的相似性，然后通过将品质量度与第一预设值进行比较来确定第一标准，还确定值序列MK1′，该值序列指示待分类的扩增曲线K1的斜率，并且还确定第二标准，即，值序列MK1′是否超过第二预设值VW2。
优选地，将品质量度确定为关于待分类的实时PCR扩增曲线的线性回归的品质量度。此外，优选地通过检验线性回归的品质量度是否低于第一预设值来确定第一标准，所述第一标准为：关于待分类的扩增曲线K1的线性回归的品质量度是否低于第一预设值VW1。
此外，可以总结地规定，在根据本发明的方法中，如果满足第一和第二标准，则扩增曲线K1被分类为阳性曲线。
图9中的值序列MK2′指示关于图6中的曲线K2的对应值。
然后在可优选地执行的步骤S7中提供第三预设值VW3。该预设值优选地是经中值滤波的值序列MK1′的第一值的倍数。这个预设值优选地是值序列MK1′的第一值的1.5到3倍，即值MK1′(1)的1.5到3倍。然后将指示待分类的扩增曲线K1的斜率的值序列MK1′是否超过第三预设值VW3确定为标准。在此检验序列MK1′中的指数2至10的值MK1′(2...10)之一是否超过第三预设值VW3。如果是这种情况，则转变至状态Z1，并且扩增曲线K1被分类为阳性。如果不是这种情况，则相应地转移至步骤S3并且扩增曲线K1被分类为阴性。
优选地，相配的样本的扩增曲线K1的分类可以通过执行图4中的另外的步骤以更准确的方式进行，所述另外的步骤可以接着图3中的步骤S7。扩增曲线K1的分类则在步骤S7之后不结束，而是在图4中的另外的步骤执行之后才结束。
在步骤S8中，确定待分类的扩增曲线K1的最后一个循环指数的最后一个荧光值。在图4中，所述最后一个荧光值是值LFL。然后优选地根据待分类的扩增曲线K1的最后一个荧光值LFL对相配的样本的扩增曲线K1进行分类。
然后在步骤S9中，将待分类的曲线K1的最后一个荧光值LFL与预设值VW4进行比较，该预设值优选地是介于0.05至0.2之间的值。如果曲线K1的最后一个荧光值LFL大于预设值VW4，则曲线K1被分类为阳性，否则被分类为阴性。
为此，图10示出曲线K1、K2以及曲线K1的最后一个荧光值LFL。此外，图10示出值VW4作为比较值，该值优选地处于0.05至0.2的范围内。由于对于曲线K1满足该标准，则曲线K1在步骤S9中被分类为阳性曲线。
图11示出所提出的用于实时PCR数据的定性评估的设备V。
设备V具有计算单元R和存储单元SP。存储单元SP可以存储数据DT，所述数据优选地代表相配的样本的PCR扩增曲线的数据，所述PCR扩增曲线带有相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的至少20个在时间上彼此相继的幅度值。设备V优选地具有数据接口DSS，用于接收代表扩增曲线的值。在设备V本身是PCR仪器并且可以测量相应的扩增曲线或其值的情况下，数据接口DSS优选地是内部接口。
设备V优选地具有输出接口ASN，该输出接口优选地连接到或能连接到呈图2中的屏幕或显示器A形式的输出单元AE。
计算单元R和存储单元SP优选通过内部数据总线IDB相互连接。优选地也存在经由内部数据总线通向数据接口DSS的连接以及还优选通向输出接口ASN的连接。
存储单元SP构造用于存储和提供相配的样本的待分类的扩增曲线K1。同样，存储单元SP优选地构造用于提供其他样本、例如阳性对照样本和阴性对照样本的其他扩增曲线。
计算单元R构造用于基于相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的所述至少20个在时间上彼此相继的幅度值来确定品质量度、优选单个的品质量度，该品质量度指示待分类的实时PCR扩增曲线与直线的相似性，并且所述计算单元还用于通过将品质量度与第一预设值进行比较来确定第一标准，其中，如果品质量度低于第一预设值，则满足第一标准。优选地，计算单元R将品质量度确定为关于待分类的实时PCR扩增曲线的线性回归的品质量度。优选地，计算单元R确定线性回归直线以及还将品质量度确定为决定量度R2(也称为决定量系数)，该决定量度尤其是用于判断待分类的实时PCR扩增曲线与线性回归直线的匹配品质的度量。在优选实施例中，计算单元将品质量度确定为回归的标准误差或线性回归的标准误差，也称为“回归标准误差”。
计算单元因此通过将品质量度与第一预设值进行比较来确定第一标准。计算单元优选地将品质量度是否低于预设值确定为第一标准。特别优选地，计算单元将关于待分类的扩增曲线的线性回归的决定量度R2是否低于预设值确定为第一标准。在第二优选实施例中，计算单元将品质量度确定为回归的标准误差或线性回归的标准误差，也称为“回归标准误差”。
此外，计算单元R构造用于确定指示待分类的扩增曲线K1的斜率的值序列，并且用于确定第二标准，即，值序列是否超过第二预设值，其中，如果值序列中的至少一个值超过第二预设值，则满足第二标准。
处理单元将相配的样本的扩增曲线K1分类为阴性曲线或阳性曲线。在满足关于第一和第二预设值的这两个标准的情况下，所述计算单元将相配的样本的实时PCR扩增曲线K1分类为阳性曲线。
此外，提出一种用于实时PCR数据的定性评估的计算机实现的方法，其中，将相配的样本的实时PCR扩增曲线分类为阴性曲线或阳性曲线，所述实时PCR扩增曲线带有相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的至少20个在时间上彼此相继的幅度值，所述方法包括以下步骤：接收相配的样本中的待分类的实时PCR扩增曲线；基于相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的所述至少20个在时间上彼此相继的幅度值，确定品质量度、优选单个的品质量度，该品质量度指示待分类的实时PCR扩增曲线与直线的相似性；通过将品质量度与第一预设值进行比较来确定第一标准，其中，如果品质量度低于第一预设值，则满足第一标准；确定值序列，所述值序列指示待分类的实时PCR扩增曲线的斜率，并且确定第二标准，即，值序列是否超过第二预设值，其中，如果值序列中的至少一个值超过第二预设值，则满足第二标准；在满足所有上述标准的情况下，将相配的样本的实时PCR扩增曲线分类为阳性曲线。
此外，提出一种计算机程序产品，其包括指令，当程序由计算机执行时，所述指令促使计算机执行所述计算机实现的方法。
虽然已经结合设备描述了一些方面，但不言而喻，这些方面也是对相应方法的描述，从而设备的块或结构元件也应理解为相应的方法步骤或方法步骤的特征。类似地，已经结合方法步骤或作为方法步骤描述的方面也是对相应设备的相应块或细节或特征的描述。
根据具体的实施要求，本发明的实施例能够以硬件和/或软件实现。可以在使用数字存储介质的情况下执行所述实现，数字存储介质例如是软盘、DVD、蓝光光盘、CD、ROM、PROM、EPROM、EEPROM或闪存、硬盘驱动器或其他磁性或光学存储设备，在数字存储介质上存储电子可读控制信号，所述控制信号与可编程硬件组件相互作用或能相互作用，使得执行相应的方法。
作为计算单元，可编程硬件组件可以由处理器、中央处理器(CPU)、计算机、计算机系统、专用集成电路(ASIC)、集成电路(IC)、单芯片系统(SOC)、可编程逻辑元件或带有微处理器的现场可编程门阵列(FPGA)形成。
因此，数字存储介质可以是机器可读的或计算机可读的。因此，一些实施例包括具有电子可读控制信号的数据载体，所述控制信号能够与可编程计算机系统或可编程硬件组件如此相互作用，使得执行本文描述的方法之一。因此，一个实施例是数据载体(或数字存储介质或计算机可读介质)，用于执行本文描述的方法之一的程序被记录在该数据载体上。
一般而言，本发明的实施例或实施例的部分可被实现为具有程序代码的程序、固件、计算机程序或计算机程序产品或实现为数据，其中，程序代码或数据可在程序在处理器或可编程硬件组件上运行时起作用而执行所述方法之一。程序代码或数据也可以存储在例如机器可读载体或数据载体上。程序代码或数据可以尤其是作为源代码、机器代码或字节代码以及其他中间代码存在。
此外，另一个实施例是指示用于执行本文描述的方法的程序的数据流、信号序列或一系列信号。例如，数据流、信号序列或一系列信号可以被配置为用于通过数据通信连接、例如通过互联网或另一个网络来传输。实施例因此也是代表数据的信号序列，其适合于通过网络或数据通信连接进行传输，其中，数据构成程序。
结果
图12针对产品EURORealTime寨卡病毒在表T11中示出通过按照相应的测试指南进行的处理所得到的实验结果。借助所描述的方法评估相应的荧光曲线，并且将其与相应的测试指南中的先前手动的评估方法进行比较。2921个阳性样本曲线(“检测到”)通过所述方法可靠地正确识别。1937个阴性曲线(“未检测到”)也被可靠地正确识别。在2条曲线中，曲线类型不同于手动评估方法被评估为阳性曲线。表T12示出0.9996的一致性程度。一致性在此是所提出的方法的判定与要探测的目标序列的实际存在或不存在的一致性。
针对产品EURORealTime MTB(仪器：
Figure BDA0003806006600000171
480II(Roche)和7500/7500快速实时PCR仪器(Applied Biosystems))的相应结果显示在表T21和T22中。由此得到1的一致性程度。
针对产品EURORealTime HSV1/-2的相应结果可在表T31和T32中找到。由此得到0.9999的一致性程度。这里使用的仪器是：
Figure BDA0003806006600000172
480II(Roche)和7500/7500快速实时PCR仪器(Applied Biosystems)。

Claims (8)

1.一种用于实时PCR数据(DT)的定性评估的方法，其中，将相配的样本(P)的实时PCR扩增曲线(K1)分类为阴性曲线或阳性曲线，
-提供相配的样本(P)的待分类的实时PCR扩增曲线(K1)，所述实时PCR扩增曲线带有相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的至少20个在时间上彼此相继的幅度值，
-基于相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的所述至少20个在时间上彼此相继的幅度值，确定品质量度(RG)、优选单个的品质量度，该品质量度指示待分类的实时PCR扩增曲线(K1)与直线(GER)的相似性，
-通过将所述品质量度(RG)与第一预设值(VW1)进行比较来确定第一标准，其中，如果品质量度低于第一预设值，则满足第一标准，
-确定值序列(MK1′)，所述值序列指示待分类的实时PCR扩增曲线(K1)的斜率，并且确定第二标准，即，值序列(MK1′)是否超过第二预设值(VW2)，其中，如果值序列(MK1′)中的至少一个值超过第二预设值，则满足第二标准，
-在满足所有上述标准的情况下，将相配的样本(P)的实时PCR扩增曲线(K1)分类为阳性曲线。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括
-借助中值滤波器来过滤值序列(MK1′)，所述值序列指示待分类的实时PCR扩增曲线的斜率，
-确定如下标准，即，经中值过滤的值序列(MK1′)是否超过第三预设值(VW3)，
-在满足所有上述标准的情况下，将相配的样本的实时PCR扩增曲线分类为阳性曲线。
3.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括
-提供阳性对照样本(PK)的实时PCR扩增曲线(P1)和阴性对照样本(NK)的实时PCR扩增曲线(N1)，
-确定第一副标准，即，阳性对照样本(PK)的实时PCR扩增曲线(P1)的最后一个荧光值是否超过最小值(MIW)，
-确定第二副标准，即，阴性对照样本(NK)的实时PCR扩增曲线(N1)的最后一个荧光值是否不超过最大值(MAW)，
-如果不满足至少一个所述副标准，则将相配的样本(P)的实时PCR扩增曲线(K1)分类为无效。
4.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括
-将品质量度(RG)确定为关于待分类的实时PCR扩增曲线(K1)的线性回归的品质量度，
-通过检验线性回归的品质量度(RG)是否低于第一预设值(VW1)来确定第一标准。
5.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括
-确定待分类的实时PCR扩增曲线(K1)的最后一个荧光值(LFL)，
-并且根据待分类的实时PCR扩增曲线的最后一个荧光值(LFL)将相配的样本(P)的实时PCR扩增曲线(K1)分类为阳性曲线，其中，只有当所述最后一个荧光值(LFL)超过另一个预设值(VW4)时，才将PCR扩增曲线分类为阳性曲线。
6.一种用于实时PCR数据的定性评估的设备(V)，所述设备包括：
-存储单元(SP)，所述存储单元用于提供相配的样本(P)的待分类的实时PCR扩增曲线(K1)，所述实时PCR扩增曲线带有相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的至少20个在时间上彼此相继的幅度值，
-以及计算单元(R)，所述计算单元用于基于相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的所述至少20个在时间上彼此相继的幅度值来确定品质量度(RG)、优选单个的品质量度，该品质量度指示待分类的实时PCR扩增曲线(K1)与直线(GER)的相似性，
-所述计算单元还用于通过将品质量度(RG)与第一预设值(VW1)进行比较来确定第一标准，其中，如果品质量度低于第一预设值，则满足第一标准，
-并且所述计算单元还用于确定值序列(MK1′)，所述值序列指示待分类的实时PCR扩增曲线(K1)的斜率，并且用于确定第二标准，即，值序列(MK1′)是否超过第二预设值(VW2)，其中，如果值序列(MK1′)中的至少一个值超过第二预设值，则满足第二标准，
其中，所述计算单元(R)将相配的样本(P)的实时PCR扩增曲线(K1)分类为阴性曲线或分类为阳性曲线，
并且，在满足所有上述标准的情况下，所述计算单元(R)将相配的样本(P)的实时PCR扩增曲线(K1)分类为阳性曲线。
7.一种用于实时PCR数据(DT)的定性评估的计算机实现的方法，其中，将相配的样本(P)的实时PCR扩增曲线(K1)分类为阴性曲线或阳性曲线，所述实时PCR扩增曲线带有相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的至少20个在时间上彼此相继的幅度值，所述方法包括以下步骤：
-接收相配的样本(P)的待分类的实时PCR扩增曲线(K1)，
-基于相对应的在时间上彼此相继的PCR循环指数的所述至少20个在时间上彼此相继的幅度值，确定品质量度(RG)、优选单个的品质量度，该品质量度指示待分类的实时PCR扩增曲线(K1)与直线(GER)的相似性，
-通过将品质量度(RG)与第一预设值(VW1)进行比较来确定第一标准，其中，如果品质量度低于第一预设值，则满足第一标准，
-确定值序列(MK1′)，所述值序列指示待分类的实时PCR扩增曲线(K1)的斜率，并且确定第二标准，即，值序列(MK1′)是否超过第二预设值(VW2)，其中，如果值序列(MK1′)中的至少一个值超过第二预设值，则满足第二标准，
-在满足所有上述标准的情况下，将相配的样本(P)的实时PCR扩增曲线(K1)分类为阳性曲线。
8.一种计算机程序产品，包括指令，当程序由计算机执行时，所述指令促使计算机执行根据权利要求7所述的方法。
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