CN115074398A

CN115074398A - 一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法

Info

Publication number: CN115074398A
Application number: CN202210672550.2A
Authority: CN
Inventors: 孙莲莉; 刘洋; 张泽昊; 曾苏
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-06-14
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2022-09-20

Abstract

本发明公开了一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法，以查尔酮为底物，经查尔酮还原酶催化体系选择性还原其碳碳双键合成二氢查尔酮，所述催化体系由查尔酮还原酶和辅因子再生系统组成。本发明中所述应用查尔酮还原酶作为催化剂合成二氢查尔酮的方法，设计合理，具有反应步骤简单、反应条件温和、环境友好、催化效率高、酶纯化简单、稳定性好等优点，在二氢查尔酮及相关药物的工业合成领域具有良好的应用开发前景。

Description

一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法，是一种应用查尔酮为催化剂选择性还原查尔酮碳碳双键获得二氢查尔酮的方法。

背景技术

二氢查尔酮及其衍生物不仅作为低能量甜味剂在饮料、糖果与食品制造领域具有重要应用价值，而且具有抗炎、抗肿瘤、抑菌及降血糖等作用，是一类极具有开发前景的生物活性物质。二氢查尔酮及其衍生物主要来源于植物次生代谢，在植物中含量较低，目前化学合成仍是其主要来源，其中选择性还原查尔酮的碳碳双键是重要合成步骤，因此，二氢查尔酮是制备其衍生物最为重要的中间体化合物。但查尔酮结构中的碳碳双键与相邻的羰基共轭形成α,β-不饱和羰基结构单元，采用化学方法进行还原时，羰基与双键极易发生竞争，生成1,4-和1,2-还原混合物，实现区域选择性具有一定的挑战性；化学法主要以过渡金属为催化剂，价格昂贵，且反应条件苛刻、易污染环境。与化学法比较，酶催化具有高效环保、反应条件温和且化学选择性好的优势。目前催化碳碳双键的双键还原酶受到其底物谱、催化效率、酶产量及稳定性等因素的限制，可用于查尔酮双键还原的新型高效双键还原酶仍亟待开发。

查尔酮还原酶(chalcone reductase，CHR)，又称查尔酮聚酮还原酶(chalconepolyketide reductase)，为醛酮还原酶(Aldo-KetoReductase，AKR)超家族AKR4家族成员，参与植物黄酮及异黄酮类化合物生物合成途径，与查尔酮合成酶协同催化生成脱氢查尔酮(Bomati EK,Austin MB,Bowman ME,Dixon RA,Noel JP.Structural elucidation ofchalcone reductase and implications for deoxychalcone biosynthesis.J BiolChem 2005,280,30496-30503.)，但目前为止仍未确定CHR的天然底物及底物谱。

发明内容

本发明目的在于提供一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法，是一种应用查尔酮还原酶选择性还原查尔酮碳碳双键生成二氢查尔酮的方法。该方法具有化学选择性好、转化效率高、反应步骤简单等优势。

本发明提供的一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法，以查尔酮为底物，经酶催化体系催化获得相应的二氢查尔酮，所述酶催化体系由查尔酮还原酶和辅酶再生系统组成。

具体步骤为：以查尔酮为原料，以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为辅因子，通过酶催化体系中的查尔酮还原酶的选择性还原催化下，还原其碳碳双键生成相应的二氢查尔酮，反应式如下：

在反应过程中NADPH被氧化成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)，但由于NADPH价格昂贵，通过辅因子再生系统将NADP⁺再生为NADPH，可显著降低反应成本。

本发明中，所述辅因子再生系统为：以葡萄糖脱氢酶为辅因子再生酶、以葡萄糖为辅因子再生底物、包含NADPH和NADP⁺的葡萄糖脱氢酶辅因子再生系统。

本发明所述酶催化体系包括查尔酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和微量NADP⁺。所述酶催化体系中查尔酮还原酶和葡萄糖脱氢酶纯化后为游离纯酶。向该酶反应体系加入查尔酮，在控制pH和温度的条件下，葡萄糖脱氢酶将葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并生成NADPH，而生成的NADPH可作为辅因子，参与查尔酮还原酶催化查尔酮双键还原的反应，生成二氢查尔酮和NADP⁺，而NADP⁺进一步参与葡萄糖氧化反应，因此可循环不断获得NADPH，参与查尔酮还原反应，获得二氢查尔酮，反应式如下：

具体的，查尔酮还原酶来源于植物紫花苜蓿(Medicago sativa)，编码该查尔酮还原酶的核苷酸序列来源于GenBank，编号为U13925.1，经密码子优化后，如序列表中CHR-DNA(SEQ.No.1)所示。

具体的，查尔酮还原酶的氨基酸序列如序列表中CHR-AA(SEQ.No.2)所示。

如本领域技术人员所知，本发明的查尔酮还原酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中CHR-AA(SEQ.No.2)所示的氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。

任何对CHR-DNA所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、确实或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。

任何对CHR-AA所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有查尔酮还原酶活性的，仍属于本发明的保护范围。

具体的，所述葡萄糖脱氢酶序列来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)IAM1030，编码该葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列来源于GenBank，编号：D10626.1，如序列表中GDH-DNA(SEQ.No.3)所示，由全基因合成获得。

具体的，葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如序列表中GDH-AA(SEQ.No.4)所示。

作为优选，催化体系中，所述查尔酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的添加量分别为0.1～5mg/ml和0.1～3mg/ml。

催化体系中，底物查尔酮的添加量为0.1～15mM；辅酶再生底物的添加量为0.15～20mM。

作为优选，酶催化体系中，反应温度为20～45℃，反应时间为0.5～24h；更优选，温度为30～40℃，时间为2～10h。

作为优选，控制反应的pH值为6～9，采用氢氧化钠来控制pH的下降，采用甲酸来控制pH的上升。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一种以查尔酮还原酶作为生物催化剂通过选择性还原查尔酮的碳碳双键合成二氢查尔酮的方法，目前尚未见报道；本发明中所述的查尔酮还原酶催化体系转化率可达90％以上，纯化后游离酶4℃可保存7天以上，大肠杆菌异源表达量可达到30mg/升培养基，可用镍亲和层析一步纯化获得纯度95％以上的游离酶，同时在pH值接近中性、常温下进行反应，无需过渡金属及有机溶剂参与反应，因此具有催化效率高、热稳定性好、异源表达量高、易于纯化等特点，同时也具备反应条件温和、环境友好等生物催化的优势，具有良好的工业化应用开发前景。

附图说明

图1为纯化后查尔酮还原酶SDS-PAGE图。

图2为查尔酮空白对照高效液相色谱图。

图3为查尔酮还原酶催化体系反应10h后反应液高效液相色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法。

本发明中质粒提取试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)等购自Novagen公司；预染蛋白Maker购于Fermantas公司。

本发明中所使用的NADPH、NADP⁺均购自上海翊圣生物有限公司；其他常用试剂，包括底物购自阿拉丁化学试剂有限公司、上海源叶生物科技有限公司。

实施例1查尔酮还原酶的表达

编码紫花苜蓿(Medicago sativa)查尔酮还原酶基因(GenBank:U13925.1)序列经密码子优化后(序列如SEQ ID NO.1)，由生工生物工程(上海)有限公司全合成后连入pET-28a(+)载体，构建为CHR-pET-28a(+)质粒，并测序验证序列后，热击转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得查尔酮还原酶表达工程菌，由含有50μg/ml卡那霉素的LB平板培养基上挑取单菌落，接种至含有50μg/ml卡那霉素的TB液体培养基，于37℃摇床200rpm振荡培养12h后，转接至3L液体TB培养基中扩大培养，于37℃摇床200rpm继续振荡培养12h，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.6时，将温度降低至16℃，加入终浓度为1.0mM的IPTG溶液用于诱导表达12h，将培养液4000rpm离心25min，弃去上清培养液，菌体-20℃保存备用。

实施例2葡萄糖脱氢酶的表达

在前期研究工作中，申请人实验室已完成巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)葡萄糖脱氢酶质粒构建(孙莲莉，陈媛媛，邵娜娜，周韵，一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法，中国专利，ZL201811521466.0；Cai S,Shao N,Chen Y,Li A,Pan J,Zhu H,ZouH,Zeng S,Sun L,Zhao J.Enantioselective reduction ofα,β-unsaturated ketonesand aryl ketones by perakine reductase.Org.Lett.2019,21,4411-4414.)核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。热击转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞，获得葡萄糖脱氢酶表达工程菌。将葡萄糖脱氢酶表达工程菌接种至含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中37℃振荡培养12h。转接至1L含有相同浓度卡那霉素的LB培养基中，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG 20℃诱导16h后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清培养基，取菌体-20℃保存待用。

实施例3查尔酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的纯化

查尔酮还原酶表达工程菌或葡萄糖脱氢酶表达工程菌菌体3g重悬于20ml裂解液(20mM咪唑，50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，Tris-HCl pH 8.0)。振荡摇匀后加入溶菌酶(1mg/ml)，冰浴40min后，置超声波破碎3次，3min/次，每次间隔15min，22000×g离心50min，所得上清液即为粗酶液。以Ni-NTA为纯化材料，装柱体积为3ml，15ml裂解液平衡Ni-NTA柱，以1ml/min的速率上样粗酶液，用裂解液(20mM咪唑，50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH 8.0)洗脱去除未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(250mM咪唑，50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH 8.0)洗脱收集目标蛋白，用5L Kpi缓冲液(50mM KH₂PO₄，50mM K₂HPO₄，pH 7.0)透析目标蛋白，去除盐及咪唑，SDS-PAGE分析结果显示，查尔酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的纯化后收率可分别达到30mg/升培养基和57mg/升培养基，纯度均在95％以上(图1)，且两种酶均较稳定，与新制备酶比较，4℃保存7天后的相对酶活仍可保持90％以上。

实施例4查尔酮还原酶合成二氢查尔酮

将实施例3中所得查尔酮还原酶及葡萄糖脱氢酶纯酶按照浓度2mg/ml的添加量加入到反应体系中，以50mM pH 7.0Kpi为缓冲液，再分别加入终浓度为0.8mM的查尔酮、1.2mM葡萄糖、0.02mM NADP⁺于30℃恒温振荡(666rpm)反应10h后，加等体积甲醇终止反应，反应液经12000rpm，30min离心后，取上清液进样高效液相(HPLC)对底物和产物量进行分析。HPLC分析方法为：安捷伦高效液相色谱1260；色谱柱Agilent 5HC-C18 250*4.6mm；柱温30℃；流速1ml/min；检测波长254nm(底物查尔酮转化检测)、214nm(产物二氢查尔酮收率检测)；流动相：水55％，乙腈45％。以查尔酮和二氢查尔酮标准品浓度曲线计算查尔酮还原酶催化还原查尔酮碳碳双键的转化率及收率。经计算，转化率可达到90％。上述相应的高效液相色谱图见图2和图3。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 1

atgggcagcg ttgaaatccc gaccaaagtt ctgaccaaca cctctagcca gctgaaaatg 60

ccggttgttg gtatgggttc tgctccggat ttcacctgta aaaaagatac caaagatgcg 120

atcatcgaag cgatcaaaca gggctaccgt cacttcgata ccgcggcggc ttatggtagc 180

gaacaggcgc tgggcgaagc gctgaaagaa gcgatcgaac tgggcctggt tacccgtgat 240

gatctcttcg ttacctctaa actgtgggtt accgaaaacc acccgcacct ggttatcccg 300

gcgctgcaga aatctctgaa aaccctgcag ctggattacc tggatctgta cctgatccac 360

tggccgctga gcagccagcc gggtaaattc agcttcccga tcgatgttgc ggatctgctg 420

ccgtttgatg ttaaaggcgt gtgggaatcc atggaagaaa gcctgaaact gggtctgacc 480

aaagcgatcg gtgtttctaa cttcagcgtt aaaaaactgg aaaacctgct gagcgttgcg 540

accgttctgc cggcagttaa ccaggttgaa atgaacctgg cgtggcagca gaaaaaactg 600

cgtgaattct gtaacgcgca cggtatcgtt ctgaccgcgt tcagcccggt tcgtaaaggt 660

gcgagccgtg gtccgaacga agttatggaa aacgatatgc tgaaagaaat tgcggatgcg 720

cacggtaaaa gcgttgcaca gatctctctg cgttggctgt acgaacaggg tgttaccttc 780

gttccgaaat cctacgataa agaacgtatg aaccagaacc tgcgtatctt cgattggagc 840

ctgaccaaag aagatcacga aaaaatcgcg cagatcaaac agaaccgtct gattccgggc 900

ccgaccaaac cgggtctgaa cgatctgtac gatgattaa 939

<210> 2

<211> 312

<212> PRT

<213> Medicago sativa

<400> 2

Met Gly Ser Val Glu Ile Pro Thr Lys Val Leu Thr Asn Thr Ser Ser

1 5 10 15

Gln Leu Lys Met Pro Val Val Gly Met Gly Ser Ala Pro Asp Phe Thr

20 25 30

Cys Lys Lys Asp Thr Lys Asp Ala Ile Ile Glu Ala Ile Lys Gln Gly

35 40 45

Tyr Arg His Phe Asp Thr Ala Ala Ala Tyr Gly Ser Glu Gln Ala Leu

50 55 60

Gly Glu Ala Leu Lys Glu Ala Ile Glu Leu Gly Leu Val Thr Arg Asp

65 70 75 80

Glu Leu Phe Val Thr Ser Lys Leu Trp Val Thr Glu Asn His Pro His

85 90 95

Leu Val Ile Pro Ala Leu Gln Lys Ser Leu Lys Thr Leu Gln Leu Asp

100 105 110

Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile His Trp Pro Leu Ser Ser Gln Pro Gly

115 120 125

Lys Phe Thr Phe Pro Ile Asp Val Ala Asp Leu Leu Pro Phe Asp Val

130 135 140

Lys Gly Val Trp Glu Ser Met Glu Glu Ser Leu Lys Leu Gly Leu Thr

145 150 155 160

Lys Ala Ile Gly Val Ser Asn Phe Ser Val Lys Lys Leu Glu Asn Leu

165 170 175

Leu Ser Val Ala Thr Val Leu Pro Ala Val Asn Gln Val Glu Met Asn

180 185 190

Leu Ala Trp Gln Gln Lys Lys Leu Arg Glu Phe Cys Asn Ala His Gly

195 200 205

Ile Val Leu Thr Ala Phe Ser Pro Leu Arg Lys Gly Ala Ser Arg Gly

210 215 220

Pro Asn Glu Val Met Glu Asn Asp Met Leu Lys Glu Ile Ala Asp Ala

225 230 235 240

His Gly Lys Ser Val Ala Gln Ile Ser Leu Arg Trp Leu Tyr Glu Gln

245 250 255

Gly Val Thr Phe Val Pro Lys Ser Tyr Asp Lys Glu Arg Met Asn Gln

260 265 270

Asn Leu Arg Ile Phe Asp Trp Ser Leu Thr Lys Glu Asp His Glu Lys

275 280 285

Ile Asp Gln Ile Lys Gln Asn Arg Leu Ile Pro Gly Pro Thr Lys Pro

290 295 300

Gly Leu Asn Asp Leu Tyr Asp Asp

305 310

<210> 3

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknow)

<400> 3

atgtatacag atttaaaaga taaagtagtt gtaattacag gtggatcaac aggtttagga 60

cgtgcaatgg ctgttcgttt cggtcaagaa gaagcaaaag ttgttattaa ctattacaac 120

aatgaagaag aagctttaga tgcgaaaaaa gaagtagaag aagcaggcgg acaagcaatc 180

atcgttcaag gcgacgtaac aaaagaagaa gacgttgtaa accttgttca aacagctatt 240

aaagaattcg gaacattaga cgttatgatt aataacgctg gtgttgaaaa cccagttcct 300

tctcatgagc tatctttaga caactggaac aaagttattg atacaaactt aacaggtgca 360

ttcttaggaa gccgtgaagc aattaaatat ttcgttgaaa atgacattaa aggaaacgtt 420

attaacatgt ccagcgttca cgaaatgatt ccttggccat tatttgttca ctacgcagca 480

agtaaaggcg gtatgaaact aatgacggaa acattggctc ttgaatatgc gccaaaaggt 540

atccgagtaa ataacattgg accaggtgcg atgaacacac caattaacgc tgaaaaattc 600

gctgatcctg tacaacgtgc agacgtagaa agcatgattc caatgggtta catcggtaag 660

ccagaagaag tagcagcagt tgcagcattc ttagcatcat cacaagcaag ctatgtaaca 720

ggtattacat tatttgctga tggtggtatg acgaaatacc cttctttcca agcaggaaga 780

ggctaa 786

<210> 4

<211> 261

<212> PRT

<213> Bacillus megaterium

<400> 4

Met Tyr Thr Asp Leu Lys Asp Lys Val Val Val Ile Thr Gly Gly Ser

1 5 10 15

Thr Gly Leu Gly Arg Ala Met Ala Val Arg Phe Gly Gln Glu Glu Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Asn Asn Glu Glu Glu Ala Leu Asp Ala

35 40 45

Lys Lys Glu Val Glu Glu Ala Gly Gly Gln Ala Ile Ile Val Gln Gly

50 55 60

Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Val Asn Leu Val Gln Thr Ala Ile

65 70 75 80

Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Val Met Ile Asn Asn Ala Gly Val Glu

85 90 95

Asn Pro Val Pro Ser His Glu Leu Ser Leu Asp Asn Trp Asn Lys Val

100 105 110

Ile Asp Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser

130 135 140

Ser Val His Glu Met Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

165 170 175

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Met Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Val Gln Arg Ala Asp

195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Lys Pro Glu Glu Val

210 215 220

Ala Ala Val Ala Ala Phe Leu Ala Ser Ser Gln Ala Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Lys Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

Gln Ala Gly Arg Gly

260

Claims

1.一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法，其特征在于，以查尔酮为底物，经酶催化体系催化获得相应的二氢查尔酮，所述酶催化体系由查尔酮还原酶和辅因子再生系统组成。

2.根据权利要求1所述的一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：以查尔酮为原料，以NADPH为辅因子，在酶催化体系中的查尔酮还原酶的选择性还原催化下，还原其碳碳双键生成相应的二氢查尔酮，反应式：

在反应过程中NADPH被氧化成NADP⁺，通过辅因子再生系统将NADP⁺再生为NADPH。

3.根据权利要求1或2所述的一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法，其特征在于，查尔酮还原酶来源于植物紫花苜蓿(Medicago sativa)，编码查尔酮还原酶的核苷酸序列如SEQ.No.1所示，其氨基酸序列如SEQ.No.2所示。

4.根据权利要求1或2所述的一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法，其特征在于，所述辅因子再生系统为：以葡萄糖脱氢酶为辅因子再生酶、以葡萄糖为辅因子再生底物、并包含NADP⁺。在NADP⁺的存在下，葡萄糖脱氢酶将葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并生成NADPH，而生成的NADPH作为辅因子，参与查尔酮还原酶催化查尔酮双键还原的反应，生成二氢查尔酮和NADP⁺，而NADP⁺进一步参与葡萄糖氧化反应，进一步循环获得NADPH，反应式如下：

5.根据权利要求1或2所述的一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法，其特征在于，所述酶催化体系包括查尔酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和微量NADP⁺，所述酶催化体系中查尔酮还原酶和辅因子再生酶均纯化后为游离纯酶。

6.根据权利要求5所述的一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)IAM1030的葡萄糖脱氢酶。

7.根据权利要求1或2所述的一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法，其特征在于，酶催化体系中，所述查尔酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的添加量均为0.1～5mg/ml。

8.根据权利要求1或2所述的一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法，其特征在于，酶催化体系中，底物潜手性酮的添加量为0.1～15mM；辅因子再生底物的添加量为0.15～20mM，反应温度为20～45℃，反应时间为0.5～24h。

9.根据权利要求1或2所述的一种应用查尔酮还原酶合成二氢查尔酮的方法，其特征在于，控制反应的pH值为6～9。