CN115073594A

CN115073594A - 一种抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体、制备方法及其应用

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Publication number: CN115073594A
Application number: CN202210639966.4A
Authority: CN
Inventors: 胡佳; 周清华; 许峰; 阴丽媛; 梁好
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2022-06-08
Filing date: 2022-06-08
Publication date: 2022-09-20

Abstract

本发明提供了一种抗新冠病毒SARS‑CoV‑2突变株表面S2蛋白的单链抗体、制备方法及其应用，涉及分子生物学技术领域。本发明的抗新冠病毒SARS‑CoV‑2突变株表面S2蛋白的单链抗体为HXLC‑031。单链抗体HXLC‑031与新冠病毒变异株S2蛋白具有较强的特异性结合能力，能够在蛋白和细胞水平上显著阻断新冠病毒S2蛋白与人ACE2的结合，并能阻止新冠病毒假病毒感染靶细胞，本发明的单链抗体HXLC‑031对SARS‑CoV‑2原始株WT、Beta突变株(B.1.351南非突变株)、Delta突变株(B.1.617.2印度突变株)以及Omicron突变株(B.1.1.529突变株)均有很好的中和活性，具有极大的开发潜力。

Description

一种抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种抗新冠病毒SARS-CoV-2 突变株表面S2蛋白的单链抗体、制备方法及其应用。

背景技术

经过30年的发展，抗体药成为全球医药市场的重要组成部分。抗体药市场仍由肿瘤、自身免疫两大领域主导。随着人们对疾病了解的不断加深、抗体技术的不断进化，抗体药在心血管、神经系统疾病、通风、感染等并非传统的抗体药适应症领域也慢慢渗透。这是抗体药发展的新方向。随着技术的进步和免疫学基础研究的快速发展，抗体药的设计日益多样化，应用范围逐步扩大。

对世界影响较大的突变株先后分别有Alpha突变株(B.1.1.7英国突变株)、Beta突变株(B.1.351南非突变株)、 Delta突变株(B.1.617.2印度突变株)，以及2021年底新出现的Omicron突变株(B.1.1.529突变株)。然而，随着各种突变株的出现，研究发现，若干种针对SARS-CoV-2的中和抗体对突变株的中和效力大幅降低；当前已用于临床的针对SARS-CoV-2的疫苗也对其保护效力大大降低，进而可能造成已接种人群的二次感染。奥密克戎毒株最初之所以受到关注，主要是因为它携有大量基因突变，仅在其表面刺突蛋白上的变异就有大约32处，其中15处都是位于RBD 结构域。研究认为，一些变异可能会增强病毒的传染性和免疫逃逸能力。因此，开发一种针对冠状病毒变异株的中和抗体和疫苗已迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体、制备方法及其应用。本发明的单链抗体与新冠病毒突变株S2蛋白具有较强的特异性结合能力，能够在蛋白和细胞水平上显著阻断新冠病毒S2蛋白与人ACE2的结合，并能阻止新冠病毒假病毒感染靶细胞。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供的提供了一种抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体为HXLC-031。

根据一种优选实施方式，所述单链抗体HXLC-031的基因序列包括重链序列和轻链序列，其中，所述重链序列包括序列为SEQ ID NO.1的重链CDR1序列、序列为SEQ ID NO.2的重链CDR2序列和序列为SEQ ID NO.3的重链CDR3序列，所述轻链序列包括序列为SEQ IDNO.4的轻链CDR1序列、序列为SEQ ID NO.5 的轻链CDR2序列和序列为SEQ ID NO.6的轻链CDR3序列。

其中，SEQ ID NO.1为：SGSSSNIGNNYVS。SEQ ID NO.2为：DNNKRPS。SEQ ID NO.3为GTWDSSLSAWV。SEQ ID NO.4为：SYYMH。SEQ ID NO.5为： IINPSGGSTSYAQKFQG。SEQ ID NO.6为DLERGLGY。

根据一种优选实施方式，所述单链抗体HXLC-031的重链序列具有与SEQ ID NO.7所示序列至少70％相同的基因序列，所述单链抗体HXLC-031的轻链序列具有与SEQ IDNO.8所示序列至少70％相同的基因序列。

其中，SEQ ID NO.7为SGSSSNIGNNYVS-DNNKRPS-GTWDSSLSAWV。SEQ ID NO.8 为SYYMH-IINPSGGSTSYAQKFQG-DLERGLGY。

根据一种优选实施方式，所述单链抗体HXLC-031具有对SARS-CoV-2原始株、Beta突变株、Delta突变株以及Omicron突变株均大于90％的中和活性。

本发明还提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包括抗新冠病毒 SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体和偶联蛋白或偶联药物。

本发明还提供了一种抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体的制备方法，包括：

(1)根据新冠肺炎康复者的外周血分离出的B细胞构建全人源噬菌体单链抗体展示库；

(2)以新冠病毒SARS-CoV-2表面S2蛋白结构域为固定相，以全人源噬菌体单链抗体展示库为流动相，经过一段时间孵育后，洗去未结合靶蛋白的噬菌体，并用酸洗脱下与靶蛋白结合的噬菌体，洗脱下来的噬菌体经感染宿主细胞繁殖扩增后，再进行下一轮的筛选，重复吸附-洗脱-扩增的过程3次；以筛选阳性克隆并测序；

(3)将经过筛选得到的单克隆进行后续的ELISA鉴定，选择OD值大于1.8 的克隆进行测序，得到抗S2 scFv序列；

(4)将所得到的单链抗体序列克隆至真核表达载体pcDNA3.4里；

(5)抗体表达纯化。

本发明还提供了所述的抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体在制备治疗或预防SARS-CoV-2突变病毒感染性疾病的药品中的用途。

根据一种优选实施方式，所述药品为抗体。

本发明的抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体、制备方法及其应用至少具有如下技术效果：

本发明的抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体HXLC-031 对新冠病毒及其突变株S2蛋白具有较强的特异性结合能力，能够在蛋白和细胞水平上显著阻断新冠病毒S2蛋白与人ACE2的结合，并能阻止新冠病毒假病毒感染靶细胞，本发明的单链抗体HXLC-031对SARS-CoV-2原始株WT、Beta突变株(B.1.351南非突变株)、Delta突变株(B.1.617.2印度突变株)以及Omicron 突变株(B.1.1.529突变株)均具有发育90％的中和活性。且IC50分别为5.18、 10.60、24.19和9.61nM，具有极大的开发潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的噬菌体展示库构建过程及以新冠病毒S2蛋白为靶点的中和抗体的制备过程；

图2是本发明的第三轮筛选得到的192个单克隆；

图3是本发明的流式细胞术检测单链抗体与抗原结合情况荧光分析图；

图4是本发明的单链抗体HXLC-031对SARS-CoV-2原始株WT、Beta突变株(B.1.351南非突变株)、Delta突变株(B.1.617.2印度突变株)，以及Omicron 突变株(B.1.1.529突变株)的中和活性结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1

本实施例提供了抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体的制备方法，如下：

一、全人源噬菌体单链抗体展示库构建。

1)分离B细胞：从4名新冠肺炎康复者的外周血中分离B细胞。

2)提取总RNA：从所得的B细胞中提取总RNA。

3)扩增序列：将上述RNA反转录成cDNA，再用适当的引物，以cDNA为模板，分别PCR扩增重链基因和轻链基因。

3.1扩增VK&VL体系，如表1所示。

表1扩增VK&VL体系

溶液或者组分	体积(μL)
		cDNA	1
EX Buffer(10x)	4
		dNTPs(10mMeach)	5
P1(10μM)	2
		P2(10μM)	2
EXTap1U/μl	0.4
		dH<sub>2</sub>O	50

3.2扩增重链Fd段体系，如表2所示。

表2扩增重链Fd段体系

溶液或者组分	体积(μL)
		cDNA	2
EX Buffer(10x)	8
		dNTPs(10mMeach)	10
P1(10μM)	2
		P2(10μM)	2
EXTap1U/μl	0.8
		dH<sub>2</sub>O	75

3.3反应程序，如表3所示。

表3反应程序

PCR产物过2％琼脂糖凝胶电泳，回收750bp左右的片段。

4)重组载体及转化：将回收得到的重链片段、轻链片段和包含噬菌体表面蛋白基因的载体按适当比例混合，电转感受态细胞，最后收集全部克隆，保存备用。

4.1轻链克隆(将VK和VL克隆入pComb3H载体)

VK和VL经XbaⅠ和SacⅠ酶切后与同样经XbaⅠ和SacⅠ酶切的pComb3H载体连接后，回收连接产物，然后电转XL1-Blue感受态细胞。

电击菌液涂15cm大平皿，次日刮菌，提质粒即为轻链库。此时重组质粒为pComb3H-VK和pComb3H-VL。

4.2重链克隆(将VH基因克隆入pComb3H-VK和pComb3H-VL轻链库中)

将轻链库pComb3-L和Fd片段分别经XhoI和SpeI双酶切，与同样经XhoI 和SpeI双酶切的pComb3H-VK和pComb3H-VL连接，然后电转即得到噬菌体单链抗体展示库。

5)单链抗体表达：通过与辅助噬菌体双重感染，促使大肠杆菌表达表面蛋白包含单链抗体的噬菌体。

二、筛选单链抗体。

以新冠病毒SARS-CoV-2表面S2蛋白结构域为固定相，以噬菌体单链抗体展示库为流动相，经过一段时间孵育后，洗去未结合靶蛋白的噬菌体，并用酸洗脱下与靶蛋白结合的噬菌体，洗脱下来的噬菌体经感染宿主细胞繁殖扩增后，再进行下一轮的筛选，重复上述“吸附-洗脱-扩增”的过程3次。具体的：

1)取适量单链抗体库至500ml 2xTY培养基中，调至OD600＝0.1，置37摄氏度摇床中，250rpm约2小时，待OD600＝0.5时取出。

2)加入过量辅助噬菌体M13KO7，之后置于37摄氏度水浴锅中孵化1小时。离心，弃上清，沉淀重悬至500ml 2xTY培养基中，置25摄氏度摇床中，250rpm 过夜。

3)4摄氏度离心10分钟，上清经0.45微米滤膜过滤。所得滤液按照100ml PEG溶液/400ml滤液的比例加入适量PEG溶液，冰上放置1小时，之后4摄氏度离心30分钟，弃上清，沉淀重悬至1ml PBS中。

4)将上述噬菌体溶液加入空白96孔板中，室温放置1小时进行预封闭。

5)将前一天包被RBD和S2蛋白的96孔板取出(每个蛋白6个孔，共12 个孔)。PBS洗三次后，加入5％的脱脂奶进行封闭约1小时。

6)将预封闭的噬菌体溶液加入上述包被靶蛋白的各个孔中，室温振荡孵育2小时。之后加入洗脱液将各孔中阳性噬菌体洗涤下来，并将其加入处于对数生长期的TG1菌液中。37摄氏度感染1小时。

7)将上述菌液室温离心10分钟，沉淀重悬至2xTY溶液中。最后均涂在若干个15cm2xTY Agar平板上。30摄氏度生长过夜。

8)第二天收集克隆至2xTY溶液中。

9)重复3轮上述筛选。

三、ELISA鉴定单链抗体单克隆。

1)取第三轮筛选得到的192个单克隆进行后续的ELISA鉴定，选择OD值大于1.8的30个克隆进行测序，得到9个不同的anti-S2 scFv的序列。

2)重组表达载体：将上述不同的单链抗体序列分别克隆进真核表达载体pcDNA3.4(His标签)里。

四、流式细胞术检测单链抗体与抗原结合情况。

1)将上述构建好的含不同单链抗体序列的质粒(His标签)转染进293T 细胞。

2)转染后24小时，向各孔中分别加入生物素化标记的S2蛋白，室温孵育1小时，收集细胞，PBS洗3次。

3)向各孔加入APC-Streptavidin室温孵育30分钟，PBS洗3次。

4)流式细胞术分析各个单链抗体与靶蛋白的结合情况。

如图3所示，流式细胞术检测单链抗体与抗原结合情况：其中，Ctrl为未进行转染的对照组，S2和Neg Ctrl S1组均转染了抗S2蛋白的单链抗体，再分别加入生物素化标记的S1蛋白作为阴性对照，结果显示，筛选得到的9个不同的抗S2蛋白单链抗体均可以在体外特异性结合S2蛋白，与阴性对照S1蛋白没有结合。

流式细胞术验证了抗原抗体结合能力，但结合能力强也不能保证能有好的中和效果，实际应用的时候还受蛋白构象等影响，因此发明人又进行了假病毒中和实验，检测抗体对SARS-CoV-2奥密克戎突变株假病毒的中和活性，这是全世界公认的评价抗体对病毒中和效果的实验方法。

五、抗体表达纯化。

1)分别表达并纯化可以特异性结合RBD或S2蛋白的单链抗体，每个单链抗体分别构建-His融合蛋白(用于后续体外假病毒中和实验和蛋白晶体解析) 和-人Fc融合蛋白(用于后续动物感染模型)。

2)将构建好的质粒转染进293F细胞，然后培养3天。

3)收集细胞培养上清液，用亲和层析纯化抗体融合蛋白。

4)用AmiconUltra-10过滤器(Millipore，美国)超滤浓缩纯化抗体融合蛋白。

5)最后，用SDS-PAGE对纯化的抗体融合蛋白进行分析。用10％的Tris- 甘氨酸SDS-PAGE对蛋白质进行分离，然后用考马斯亮蓝对凝胶中的蛋白质进行染色，以显示蛋白质谱线。

六、假病毒中和实验。

利用微孔细胞中和实验法，检测上述纯化的各抗体对SARS-CoV-2及其各突变株假病毒的体外中和活性。SARS-CoV-2假病毒具有与真病毒相似的细胞感染特点，能够模拟真病毒感染细胞的早期过程，并且携带荧光素酶报告基因, 可以快速方便地进行检测分析。操作假病毒的安全性高，在P2级实验室内就可完成中和实验，通过检测荧光素酶报告基因来检测抗体的中和活性(使用 Promega公司的Bright-Glo荧光素酶检测试剂盒)。具体的：

1)取96孔板，在细胞对照孔(只含有Huh7细胞)中加入100μl/孔的 DMEM完全培养基(含有1％的抗生素，25mMHEPES，10％FBS)；在病毒对照孔中加入100μl/孔的DMEM完全培养基；并且，在实验孔中加入DMEM完全培养基稀释成各浓度梯度的待测抗体(100μl/孔)。实验使用的稀释抗体浓度分别为 10^-2nM，10^-1nM，10⁰nM，10¹nM，10²nM，10³nM，10⁴nM，10⁵nM。

2)用DMEM完全培养基将SARS-CoV-2或其突变株假病毒稀释至约1.0× 10⁴/ml，然后向病毒对照孔和实验孔中添加50μl/孔的SARS-CoV-2或其突变株假病毒。

3)将96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO₂)孵育1小时。

4)孵育结束后，向细胞对照孔、病毒对照孔和实验孔中添加50μl，0.02M /孔的Huh7细胞，将96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO₂)培养48小时。

5)从细胞培养箱中取出96孔板，从每个孔中吸弃上清，然后加入50μl 裂解液，室温反应5min。

6)用移液器将各个孔中的液体转移至对应的96孔不透光化学发光检测板中，加入50μl检测液室温避光反应5min，用Promega GloMax发光检测仪读取发光值。

7)计算中和抑制率：抑制率＝1-(读数_样品-读数_阴性对照)/(读数_{假病毒对照}-读数_阴性对照)

8)根据中和抑制率的结果，计算待测抗体的IC50。

结果表明，如图4和下表1所示：HXLC-031对SARS-CoV-2原始株WT、Beta 突变株(B.1.351南非突变株)、Delta突变株(B.1.617.2印度突变株)，以及Omicron突变株(B.1.1.529突变株)均有很好的中和活性。

表1单链抗体HXLC-031的中和实验IC50(nM)

HXLC-031对SARS-CoV-2原始株、Beta突变株(B.1.351南非突变株)、 Delta突变株(B.1.617.2印度突变株)，以及Omicron突变株(B.1.1.529突变株)均有很好的中和活性。我们的抗体HXLC-031对突变株体外中和活性IC50 达到nM水平，具有极大的开发潜力。

实施例2

本发明还提供了抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体 HXLC-031在制备治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染性疾病的药品中的用途。该药品为抗体。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体为HXLC-031。

2.根据权利要求1所述的抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体HXLC-031的基因序列包括重链序列和轻链序列，其中，所述重链序列包括序列为SEQ ID NO.1的重链CDR1序列、序列为SEQ ID NO.2的重链CDR2序列和序列为SEQ ID NO.3的重链CDR3序列，所述轻链序列包括序列为SEQ ID NO.4的轻链CDR1序列、序列为SEQ ID NO.5的轻链CDR2序列和序列为SEQ ID NO.6的轻链CDR3序列。

3.根据权利要求2所述的抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体HXLC-031的重链序列具有与SEQ ID NO.7所示序列至少70％相同的基因序列，所述单链抗体HXLC-031的轻链序列具有与SEQ ID NO.8所示序列至少70％相同的基因序列。

4.根据权利要求1所述的抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体HXLC-031具有对SARS-CoV-2原始株、Beta突变株、Delta突变株以及Omicron突变株均大于90％的中和活性。

5.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物包括抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体和偶联蛋白或偶联药物。

6.一种抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体的制备方法，其特征在于，包括：

(3)将经过筛选得到的单克隆进行后续的ELISA鉴定，选择OD值大于1.8的克隆进行测序，得到抗S2 scFv序列；

(4)将所得到的单链抗体序列克隆至真核表达载体pcDNA3.4里；

(5)抗体表达纯化。

7.权利要求1至4所述的抗新冠病毒SARS-CoV-2突变株表面S2蛋白的单链抗体在制备治疗或预防SARS-CoV-2突变病毒感染性疾病的药品中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药品包括抗体。