CN115067440A - 一种15n同位素标记的桑蚕饲料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及文物检测技术领域，本发明公开了一种15N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法，包括：1)初级饲料的制备；2)将产朊假丝酵母在含有15N同位素标记的基础培养基上培养；3)离心收集细胞，水洗，液氮冷冻，冷冻干燥；4)研磨粉碎后添加至三氯乙酸溶液中，得到提取物；5)离心处理，得到离心产物；6)用乙醇洗涤，真空干燥，得到干燥提取物；7)将干燥提取物添加至乙醇和氯仿的混合溶剂中，回流提取，冷却并过滤，再洗涤并脱水干燥得到15N同位素标记蛋白；8)将初级饲料与15N标记蛋白均匀，得到15N同位素标记的桑蚕饲料。本发明制备的桑蚕饲料标记效果好，且制备过程中无有毒副产物的产生。

Description

一种15N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法
技术领域
本发明涉及文物检测技术领域，尤其涉及一种15N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法。
背景技术
丝绸是中国古代文明的一种象征，相传嫘祖是最早进行养蚕缫丝的人。近些年来，许多的考古挖掘行动中也都发现了丝织品的存在。由于其特殊的文化和艺术价值，百余年来考古学家们一直致力于探索丝织品的起源。21世纪以来，稳定同位素技术与质谱技术相互融合且彼此促进，取得了极大地发展，是进行丝织品文物溯源的一种有效手段。结合稳定同位素标记的质谱分析技术已经深入到生物分析的多个领域，如蛋白质组学、代谢组学、医学等等领域。
由于稳定同位素特殊的物理和化学性质，在桑蚕生态过程中会发生一定的分馏。因此，明确桑蚕生长发育及吐丝过程中的同位素的分馏情况是使用稳定同位素技术进行丝织品溯源的前提条件。对桑蚕饲料进行稳定同位素标记并喂养桑蚕是一种高效可行的方法。但是，在对饲料进行稳定同位素标记的同时又容易产生食用安全性问题，在这方面，目前尚无成熟、有效的方法可以借鉴。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种15N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法。本发明方法可有效对桑蚕进行同位素标记，同时又不存在，且制备过程中无有毒副产物的产生，不会对家蚕产生任何的负面影响，对环境友好。
本发明的具体技术方案为：一种15N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法，包括以下步骤：
1)将桑叶粉，脱脂豆饼粉，甘薯粉，柠檬酸，维生素C，无机盐混合物，没食子酸，山梨酸，氯霉素，琼脂均匀混合，得到初级饲料A。
2)将产朊假丝酵母在含有15N同位素标记的基础培养基上培养。
3)将步骤2)所得培养产物离心收集细胞，水洗，液氮冷冻，最后冷冻干燥。
4)将步骤3)所得冷冻干燥产物研磨粉碎，按固液比50-70g/L将所得粉末添加至8-12％的三氯乙酸溶液中混合均匀，在98-102℃下回流提取得到提取物B。
本发明采用三氯乙酸溶液来提取中被15N同位素标记的蛋白，在三氯乙酸溶液中蛋白质的构像发生改变，从而暴露出较多的疏水性基团，最终三氯乙酸与蛋白质形成不溶性盐而聚集沉淀。
三氯乙酸浓度很关键，8-12％浓度的三氯乙酸是极酸性物质，加入上述浓度的三氯乙酸会可使溶液呈理想程度的酸性，从而提高蛋白质的提取率。若加入过量的三氯乙酸则会使溶液的酸性过强，导致蛋白质的分解，从而影响蛋白质的完整性。根据实验结果，三氯乙酸的浓度控制在10％左右最为适宜。
5)将步骤4)中所得提取物B离心处理，除去上层清液，得到离心产物C。
6)将步骤5)所得离心产物C用乙醇洗涤，然后进行真空干燥，得到干燥提取物D。
7)按固液比1∶(6-10)g/mL将步骤6)所得干燥提取物D添加至乙醇和氯仿体积比为1.5-2.5∶1的混合溶剂中，在85-95℃下回流提取1-2h，冷却并过滤，先后用甲醇、乙醚洗涤，再用丙酮萃取并用水冲洗，最后脱水干燥得到15N同位素标记蛋白E。
我们通过检测发现，三氯乙酸提取而得的产物在经过离心干燥处理后容易有掺杂有部分脂类。为此，本发明进一步采用氯仿来迅速溶解脂类，但是我们又发现氯仿其在日光、氧气、湿气中会产生剧毒的光气。为此，本发明选择乙醇与氯仿按特定比例复配，乙醇作为氯仿的稳定剂，可解决上述技术问题。
另一方面，步骤4)中使用三氯乙酸对蛋白质进行沉淀，但我们发现三氯乙酸会渗入蛋白质分子内部而难以去除，经过大量筛选后，我们发现乙醚和丙酮可有效且彻底地去除渗入蛋白质内部的三氯乙酸。因此先用甲醇、乙醚依次对蛋白质沉淀物清洗，再用丙酮进行二次清洗即可彻底出去残留在蛋白质中的三氯乙酸，最后再用去离子水反复冲洗。
8)将步骤1)中的初级饲料A与步骤7)中的15N标记蛋白E按质量比4-6∶1均匀捏合并在100-105℃下蒸5-15min，得到15N同位素标记的桑蚕饲料F。
作为优选，步骤1)中，各原料的质量百分数为：桑叶粉45-55％，脱脂豆饼粉20-30％，甘薯粉10-20％，柠檬酸0.1-2％，维生素C 1-3％，无机盐混合物0.1-2％，没食子酸0.1-0.5％，山梨酸0.1-0.5％，氯霉素0.02-0.06％，琼脂5-15％。
作为优选，步骤2)中，15N同位素标记的基础培养基的组分为：D-葡萄糖45-55g/L、亚硫酸铵-15N 3-7g/L、KH2PO4 3-7g/L。
作为优选，步骤2)中，培养时间为20-30小时，培养温度为26～28℃。
作为优选，步骤3)中，冷冻干燥时间为40-50h。
作为优选，步骤5)中，离心条件为：10000-15000r/min，20-40min。
作为优选，步骤6)中，真空干燥条件为：28-32℃，40-50h。
作为优选，步骤7)中，采用聚四氟乙烯膜过滤器进行过滤。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：本发明所制备的15N同位素标记的桑蚕饲料标记效果好，且制备过程中无有毒副产物的产生，不会对家蚕产生任何的负面影响，对环境友好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种15N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法，包括以下步骤：
1)桑叶粉50％，脱脂豆饼粉25％，甘薯粉15％，柠檬酸1％，维生素C2％，无机盐混合物1％，没食子酸0.2％，山梨酸0.3％，氯霉素0.04％，琼脂10％均匀混合得到初级饲料A1；
2)将产朊假丝酵母在含有15N标记的基础培养基(D-葡萄糖50g/L、亚硫酸铵-15N5g/L、KH2PO4 5g/L)上培养24小时，培养温度为27℃；
3)将培养产物离心收集细胞，再用去离子水洗涤两次，在液氮中冷冻，最后在冷冻干燥机中冻干48h；
4)将步骤3)中得到的冷冻干燥产物在玛瑙研钵中研磨粉碎，按固液比60g/mL将所得粉末添加至10％的三氯乙酸溶液中混合均匀，在100℃下回流提取得到提取物B1；
5)将步骤4)中的提取物B1在12000r/min下离心30min除去上层清液得到离心产物C；
6)将步骤5)中的离心产物C1用乙醇洗涤并在30℃条件下至于真空干燥器中干燥48h得到干燥提取物D1；
7)按固液比1：8g/mL将步骤6)所得干燥提取物D1添加至乙醇和氯仿体积比为2∶1的混合溶剂中，在90℃下回流提取1.5h，冷却并过滤，先后用甲醇、乙醚洗涤，再用丙酮萃取并用水冲洗，最后脱水干燥得到15N同位素标记蛋白E1；
8)将步骤1)中的初级饲料A1与步骤7)中的15N标记蛋白E按5∶1的质量比均匀捏合并在100℃蒸10min得到15N同位素标记的桑蚕饲料F1。
实施例2
一种15N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法，包括以下步骤：
1)桑叶粉50％，脱脂豆饼粉25％，甘薯粉15％，柠檬酸1％，维生素C2％，无机盐混合物1％，没食子酸0.2％，山梨酸0.3％，氯霉素0.04％，琼脂10％均匀混合得到初级饲料A2；
2)将产朊假丝酵母在含有15N标记的基础培养基(D-葡萄糖50g/L、亚硫酸铵-15N4g/L、KH2PO4 4g/L)上培养24小时，培养温度为26℃；
3)将培养产物离心收集细胞，再用去离子水洗涤两次，在液氮中冷冻，最后在冷冻干燥机中冻干48h；
4)将步骤3)中得到的冷冻干燥产物在玛瑙研钵中研磨粉碎，按固液比50g/mL将所得粉末添加至10％的三氯乙酸溶液中混合均匀，在100℃下回流提取得到提取物B2；
5)将步骤4)中的提取物B2在12000r/min下离心30min除去上层清液得到离心产物C2；
6)将步骤5)中的离心产物C2用乙醇洗涤并在30℃条件下至于真空干燥器中干燥48h得到干燥提取物D2；
7)按固液比1∶6g/mL将步骤6)所得干燥提取物D2添加至乙醇和氯仿体积比为2∶1的混合溶剂中，在90℃下回流提取1.5h，冷却并过滤，先后用甲醇、乙醚洗涤，再用丙酮萃取并用水冲洗，最后脱水干燥得到15N同位素标记蛋白E2；
8)将步骤1)中的初级饲料A2与步骤7)中的15N标记蛋白E2按5∶1的质量比均匀捏合并在100℃蒸10min得到15N同位素标记的桑蚕饲料F2。
实施例3
一种15N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法，包括以下步骤：
1)桑叶粉50％，脱脂豆饼粉25％，甘薯粉15％，柠檬酸1％，维生素C2％，无机盐混合物1％，没食子酸0.2％，山梨酸0.3％，氯霉素0.04％，琼脂10％均匀混合得到初级饲料A3；
2)将产朊假丝酵母在含有15N标记的基础培养基(D-葡萄糖55g/L、亚硫酸铵-15N5g/L、KH2PO4 5g/L)上培养24小时，培养温度为28℃；
3)将培养产物离心收集细胞，再用去离子水洗涤两次，在液氮中冷冻，最后在冷冻干燥机中冻干48h；
4)将步骤3)中得到的冷冻干燥产物在玛瑙研钵中研磨粉碎，按固液比60g/mL将所得粉末添加至11％的三氯乙酸溶液中混合均匀，在100℃下回流提取得到提取物B3；
5)将步骤4)中的提取物B3在12000r/min下离心30min除去上层清液得到离心产物C3；
6)将步骤5)中的离心产物C3用乙醇洗涤并在30℃条件下至于真空干燥器中干燥48h得到干燥提取物D3；
7)按固液比1∶6g/mL将步骤6)所得干燥提取物D3添加至乙醇和氯仿体积比为1.5∶1的混合溶剂中，在90℃下回流提取1.5h，冷却并过滤，先后用甲醇、乙醚洗涤，再用丙酮萃取并用水冲洗，最后脱水干燥得到15N同位素标记蛋白E3；
8)将步骤1)中的初级饲料A3与步骤7)中的15N标记蛋白E3按5∶1的质量比均匀捏合并在100℃蒸10min得到15N同位素标记的桑蚕饲料F3。
实施例4
一种15N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法，包括以下步骤：
1)桑叶粉50％，脱脂豆饼粉25％，甘薯粉15％，柠檬酸1％，维生素C2％，无机盐混合物1％，没食子酸0.2％，山梨酸0.3％，氯霉素0.04％，琼脂10％均匀混合得到初级饲料A4；
2)将产朊假丝酵母在含有15N标记的基础培养基(D-葡萄糖55g/L、亚硫酸铵-15N6g/L、KH2PO4 6g/L)上培养24小时，培养温度为28℃；
3)将培养产物离心收集细胞，再用去离子水洗涤两次，在液氮中冷冻，最后在冷冻干燥机中冻干48h；
4)将步骤3)中得到的冷冻干燥产物在玛瑙研钵中研磨粉碎，按固液比60g/mL将所得粉末添加至12％的三氯乙酸溶液中混合均匀，在100℃下回流提取得到提取物B4；
5)将步骤4)中的提取物B4在12000r/min下离心30min除去上层清液得到离心产物C4；
6)将步骤5)中的离心产物C4用乙醇洗涤并在30℃条件下至于真空干燥器中干燥48h得到干燥提取物D4；
7)按固液比1∶10g/mL将步骤6)所得干燥提取物D4添加至乙醇和氯仿体积比为2.5∶1的混合溶剂中，在90℃下回流提取1.5h，冷却并过滤，先后用甲醇、乙醚洗涤，再用丙酮萃取并用水冲洗，最后脱水干燥得到15N同位素标记蛋白E4；
8)将步骤1)中的初级饲料A4与步骤7)中的15N标记蛋白E4按5∶1的质量比均匀捏合并在100℃蒸10min得到15N同位素标记的桑蚕饲料F4。
实施例5
一种15N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法，包括以下步骤：
1)桑叶粉50％，脱脂豆饼粉25％，甘薯粉15％，柠檬酸1％，维生素C2％，无机盐混合物1％，没食子酸0.2％，山梨酸0.3％，氯霉素0.04％，琼脂10％均匀混合得到初级饲料A5；
2)将产朊假丝酵母在含有15N标记的基础培养基(D-葡萄糖55g/L、亚硫酸铵-15N7g/L、KH2PO4 7g/L)上培养24小时，培养温度为27℃；
3)将培养产物离心收集细胞，再用去离子水洗涤两次，在液氮中冷冻，最后在冷冻干燥机中冻干48h；
4)将步骤3)中得到的冷冻干燥产物在玛瑙研钵中研磨粉碎，按固液比70g/mL将所得粉末添加至12％的三氯乙酸溶液中混合均匀，在102℃下回流提取得到提取物B5；
5)将步骤4)中的提取物B5在12000r/min下离心30min除去上层清液得到离心产物C5；
6)将步骤5)中的离心产物C5用乙醇洗涤并在30℃条件下至于真空干燥器中干燥48h得到干燥提取物D5；
7)按固液比1∶10g/mL将步骤6)所得干燥提取物D5添加至乙醇和氯仿体积比为2.5∶1的混合溶剂中，在90℃下回流提取1.5h，冷却并过滤，先后用甲醇、乙醚洗涤，再用丙酮萃取并用水冲洗，最后脱水干燥得到15N同位素标记蛋白E5；
8)将步骤1)中的初级饲料A5与步骤7)中的15N标记蛋白E5按5∶1的质量比均匀捏合并在100℃蒸10min得到15N同位素标记的桑蚕饲料F5。
对比例1(与实施例1相比，区别仅仅在于在步骤7中没有对干燥提取物进行提取、洗涤操作
一种15N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法，包括以下步骤：
1)桑叶粉50％，脱脂豆饼粉25％，甘薯粉15％，柠檬酸1％，维生素C2％，无机盐混合物1％，没食子酸0.2％，山梨酸0.3％，氯霉素0.04％，琼脂10％均匀混合得到初级饲料A6；
2)将产朊假丝酵母在含有15N标记的基础培养基(D-葡萄糖50g/L、亚硫酸铵-15N5g/L、KH2PO4 5g/L)上培养24小时，培养温度为27℃；
3)将培养产物离心收集细胞，再用去离子水洗涤两次，在液氮中冷冻，最后在冷冻干燥机中冻干48h；
4)将步骤3)中得到的冷冻干燥产物在玛瑙研钵中研磨粉碎，按固液比60g/mL将所得粉末添加至10％的三氯乙酸溶液中混合均匀，在100℃下回流提取得到提取物B6；
5)将步骤4)中的提取物B1在12000r/min下离心30min除去上层清液得到离心产物C6；
6)将步骤5)中的离心产物C6用乙醇洗涤并在30℃条件下至于真空干燥器中干燥48h得到干燥提取物D6；
7)将步骤1)中的初级饲料A6与步骤6)中干燥提取物D6按5∶1的质量比均匀捏合并在100℃蒸10min得到15N同位素标记的桑蚕饲料F6。
对比例2(与实施例1相比，区别仅仅在于在步骤7中采用纯氯仿)
一种15N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法，包括以下步骤：
1)桑叶粉50％，脱脂豆饼粉25％，甘薯粉15％，柠檬酸1％，维生素C2％，无机盐混合物1％，没食子酸0.2％，山梨酸0.3％，氯霉素0.04％，琼脂10％均匀混合得到初级饲料71；
2)将产朊假丝酵母在含有15N标记的基础培养基(D-葡萄糖50g/L、亚硫酸铵-15N5g/L、KH2PO4 5g/L)上培养24小时，培养温度为27℃；
3)将培养产物离心收集细胞，再用去离子水洗涤两次，在液氮中冷冻，最后在冷冻干燥机中冻干48h；
4)将步骤3)中得到的冷冻干燥产物在玛瑙研钵中研磨粉碎，按固液比60g/mL将所得粉末添加至10％的三氯乙酸溶液中混合均匀，在100℃下回流提取得到提取物B7；
5)将步骤4)中的提取物B7在12000r/min下离心30min除去上层清液得到离心产物C7；
6)将步骤5)中的离心产物C7用乙醇洗涤并在30℃条件下至于真空干燥器中干燥48h得到干燥提取物D7；
7)按固液比1∶8g/mL将步骤6)所得干燥提取物D7添加至氯仿溶液中，在90℃下回流提取1.5h，冷却并过滤，得到15N同位素标记蛋白E7；
8)将步骤1)中的初级饲料A7与步骤7)中的15N标记蛋白E7按5∶1的质量比均匀捏合并在100℃蒸10min得到15N同位素标记的桑蚕饲料F7。
对比例3(与实施例2相比，区别仅仅在于在步骤7中未采用甲醇-乙醚-丙酮的洗涤操作)
一种15N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法，包括以下步骤：
1)桑叶粉50％，脱脂豆饼粉25％，甘薯粉15％，柠檬酸1％，维生素C2％，无机盐混合物1％，没食子酸0.2％，山梨酸0.3％，氯霉素0.04％，琼脂10％均匀混合得到初级饲料A8；
2)将产朊假丝酵母在含有15N标记的基础培养基(D-葡萄糖50g/L、亚硫酸铵-15N5g/L、KH2PO4 5g/L)上培养24小时，培养温度为27℃；
3)将培养产物离心收集细胞，再用去离子水洗涤两次，在液氮中冷冻，最后在冷冻干燥机中冻干48h；
4)将步骤3)中得到的冷冻干燥产物在玛瑙研钵中研磨粉碎，按固液比60g/mL将所得粉末添加至10％的三氯乙酸溶液中混合均匀，在100℃下回流提取得到提取物B8；
5)将步骤4)中的提取物B1在12000r/min下离心30min除去上层清液得到离心产物C8；
6)将步骤5)中的离心产物C1用乙醇洗涤并在30℃条件下至于真空干燥器中干燥48h得到干燥提取物D8；
7)按固液比1∶8g/mL将步骤6)所得干燥提取物D8添加至乙醇和氯仿体积比为2∶1的混合溶剂中，在90℃下回流提取1.5h，冷却并过滤，用水冲洗，最后脱水干燥得到15N同位素标记蛋白E8；
8)将步骤1)中的初级饲料A8与步骤7)中的15N标记蛋白E8按5∶1的质量比均匀捏合并在100℃蒸10min得到15N同位素标记的桑蚕饲料F8。
效果测试
取蚕蚁900条，分为九组，每组100条，前八组分别采用实施例1-5以及对比例1-3的饲料，最后一组为对照组，采用新鲜的桑叶喂养，九组组都在相同的环境温湿度下进行喂养，温度在24～27℃之间，相对湿度为65％～75％，饲养结果如下表所示：
组别 解舒率/％ 结茧率/％ 全茧重/g 茧层重/g 茧层率/％ 标记率/％
实施例1 98.83 97 1.86 0.41 22.04 100
实施例2 99.16 100 1.88 0.45 23.94 100
实施例3 98.59 98 1.79 0.42 23.5 100
实施例4 97.91 98 1.78 0.41 23.03 100
实施例5 98.57 97 1.80 0.39 21.67 100
对比例1 80.98 27 1.64 0.31 18.90 100
对比例2 81.35 19 1.55 0.26 16.77 100
对比例3 83.37 21 1.68 0.33 19.64 100
对照组 99.86 100 1.80 0.38 21.11 ——
由上表数据可知，通过技术改进，本发明对桑蚕饲料的配方进行改进，并且每个用饲料饲养的小组中蚕丝都被标记上，说明利用产朊假丝酵母进行饲料标记是一种高效的方法。与实施例相比，对比例1在没有对干燥提取物进行萃取洗涤等关键操作时，家蚕的存活率要远远低于实施例1-5，并且蚕茧的质量也远低于实施例1-5中的蚕茧质量。这是因为步骤4)中加入的三氯乙未被即使去除，而三氯乙酸呈酸性，并且会使蛋白质分子出现大量的聚集现象，从而降低了桑蚕饲料的品质，使得结茧率和蚕茧质量显著下降。而对比例2中加入的氯仿虽然可以有效的去除饲料中的脂类物质，但由于氯仿在日光、氧气、时期中会产生剧毒的光气，因此对比例2生产的饲料仍然有缺陷。除此之外，步骤4)中添加适量的三氯乙酸可以提高蛋白质的提取率，但是同时TCA也会部分渗入蛋白质内部而难以祛除，因此我们在对比例3中用水进行洗涤，但是并不能有效的去除。实施例1-5，采用氯仿对干燥提取物中的脂质进行有效去除，并且加入适量的乙醇解决了氯仿有毒的关键问题，此外甲醇-乙醚-丙酮复合清洗方法可以彻底的清除插入蛋白质分子内部的TCA，从而提高了桑蚕饲料的质量。三氯乙酸是使蛋白质沉淀的关键试剂，经过实验发现，当三氯乙酸浓度低于8％时，蛋白质沉淀不完全，效率太低，当三氯乙酸浓度高于12％时，溶液过酸会导致蛋白质的分解，从而影响蛋白质的完整性。实施例1-5对比用桑叶喂养的对照组，平均茧层率均高于用桑叶喂养，说明本发明的饲料营养更丰富，桑蚕的生长发育更良好，茧的品质更好。用饲料喂养的桑蚕，其解舒率、结茧率和全茧重均与用桑叶喂养的结果相当，说明本发明已经达到了桑蚕批量生产的技术要求，并且本发明的制备成本低，制备方法也较简单，生产过程中也没有任何有毒副产物生成，绿色环保，具有实用性和创造性。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种15N同位素标记的桑蚕饲料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1) 将桑叶粉，脱脂豆饼粉，甘薯粉，柠檬酸，维生素C，无机盐混合物，没食子酸，山梨酸，氯霉素，琼脂均匀混合，得到初级饲料A；
2) 将产朊假丝酵母在含有15N同位素标记的基础培养基上培养；
3) 将步骤2）所得培养产物离心收集细胞，水洗，液氮冷冻，最后冷冻干燥；
4) 将步骤3)所得冷冻干燥产物研磨粉碎，按固液比50-70g/L将所得粉末添加至8-12%的三氯乙酸溶液中混合均匀，在98-102℃下回流提取得到提取物B；
5) 将步骤4)中所得提取物B离心处理，除去上层清液，得到离心产物C；
6) 将步骤5)所得离心产物C用乙醇洗涤，然后进行真空干燥，得到干燥提取物D；
7) 按固液比1：（6-10）g/mL将步骤6)所得干燥提取物D添加至乙醇和氯仿体积比为1.5-2.5:1的混合溶剂中，在85-95℃下回流提取1-2h，冷却并过滤，先后用甲醇、乙醚洗涤，再用丙酮萃取并用水冲洗，最后脱水干燥得到15N同位素标记蛋白E；
8) 将步骤1)中的初级饲料A与步骤7)中的15N标记蛋白E按质量比4-6:1均匀捏合并在100-105℃下蒸5-15min，得到15N同位素标记的桑蚕饲料F。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1）中，各原料的质量百分数为：桑叶粉45-55%，脱脂豆饼粉20-30%，甘薯粉10-20%，柠檬酸0.1-2%，维生素C 1-3%，无机盐混合物0.1-2%，没食子酸0.1-0.5%，山梨酸0.1-0.5%，氯霉素0.02-0.06%，琼脂5-15%。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中，15N同位素标记的基础培养基的组分为：D-葡萄糖45-55g/L、亚硫酸铵-15N 3-7g/L、KH2PO4 3-7g/L。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中，培养时间为20-30小时，培养温度为26~28℃。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3）中，冷冻干燥时间为40-50h。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤5）中，离心条件为：10000-15000r/min，20-40min。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤6）中，真空干燥条件为：28-32℃，40-50h。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤7）中，采用聚四氟乙烯膜过滤器进行过滤。
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