CN115066257A - 涉及抗原疫苗接种以及与pd-l1和cd137结合的结合剂的治疗 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及用于在对象中诱导免疫应答的方法和组合物，其包括向所述对象提供肽或蛋白质疫苗以及与PD‑L1和CD137(例如人PD‑L1和人CD137)结合的结合剂(例如双特异性抗体)，其例如通过以下手段来进行：向所述对象共同施用用于疫苗接种的肽或蛋白质或者编码用于疫苗接种的肽或蛋白质的多核苷酸特别是RNA，以及与PD‑L1和CD137结合的结合剂或者编码与PD‑L1和CD137结合的结合剂的多核苷酸(特别是RNA)。本公开内容还涉及可用于本文中公开的方法中的药物制剂。

Description

涉及抗原疫苗接种以及与PD-L1和CD137结合的结合剂的治疗
技术领域
本公开内容涉及用于在对象中诱导免疫应答的方法和组合物，其包括向所述对象提供肽或蛋白质疫苗以及与PD-L1和CD137(例如人PD-L1和人CD137)结合的结合剂(例如双特异性抗体)，例如通过向所述对象共同施用用于疫苗接种的肽或蛋白质或者编码用于疫苗接种的肽或蛋白质的多核苷酸特别是RNA，以及与PD-L1和CD137结合的结合剂或者编码与PD-L1和CD137结合的结合剂的多核苷酸特别是RNA。本公开内容还涉及可用于本文中公开的方法中的药物制剂。
背景技术
抗原特异性免疫治疗旨在增强或诱导患者中的特异性免疫应答以控制感染性或恶性疾病。越来越多的病原体相关抗原和肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)的鉴定导致用于免疫治疗的合适靶标的广泛集合。可通过主动或被动免疫接种策略特异性地靶向呈递来源于这些抗原的免疫原性肽(表位)的细胞。主动免疫接种倾向于诱导和扩增患者中的抗原特异性T细胞，其能够特异性识别并杀伤病变细胞。相比之下，被动免疫接种可依赖于在体外扩增的和任选地遗传改造的T细胞的过继转移(过继性T细胞治疗)。
免疫系统的进化在脊椎动物中产生基于两种防御类型(先天免疫和过继免疫)的高度有效网络。与依赖于识别与病原体相关的共同分子模式的不变受体(invariantreceptor)的进化上古老的先天免疫系统相反，过继免疫基于B细胞(B淋巴细胞)和T细胞(T淋巴细胞)上的高度特异性抗原受体和克隆选择(clonal selection)。免疫系统在癌症的发生、进展和治疗期间起着至关重要的作用。CD8+T细胞和NK细胞可以直接裂解肿瘤细胞，这些细胞的高肿瘤浸润通常被认为有利于各种肿瘤疾病的结局。CD4+T细胞通过分泌IFNγ或抗原呈递树突状细胞(DC)许可并转而致敏和活化CD8+T细胞而有助于抗肿瘤免疫应答(Kreiter S.et al.Nature 520,692-6(2015))。CD8+T细胞对肿瘤细胞的识别和消除取决于通过I类主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)的抗原呈递。CD8+以及CD4+肿瘤特异性T细胞应答可通过疫苗接种来诱导。在基于mRNA的疫苗平台的背景下，mRNA可通过脂质体制剂(RNA-LPX)递送到位于次级淋巴器官的抗原呈递细胞中而无需任何另外的佐剂(Kreiter,S.et al.Nature 520,692–696(2015)；Kranz,L.M.etal.Nature 534,396–401(2016))。
疫苗旨在通过主动免疫接种诱导内源性疾病特异性免疫应答。不同的抗原形式可用于疫苗接种，包括蛋白质、肽或免疫载体(例如RNA、DNA或病毒载体)，其可直接体内应用或通过进行树突细胞(dendritic cell，DC)的脉冲然后转移到患者中来体外应用。
用于针对由病变细胞(例如肿瘤细胞)表达的抗原刺激免疫系统的疫苗显示出有希望的结果，然而，其有效性仍然受到限制。
程序性死亡配体1(PD-L1、PDL1、CD274、B7H1)是33kDa、I型单次跨膜蛋白。基于选择性剪接，已经描述了PD-L1的三种同种型。PD-L1属于免疫球蛋白(Ig)超家族，并且包含一个Ig样C2型结构域和一个Ig样V型结构域。新鲜分离的T和B细胞表达可忽略不计的量的PD-L1，而一部分(约16％)CD14+单核细胞组成型表达PD-L1。然而，已知干扰素-γ(IFNγ)上调肿瘤细胞上的PD-L1。PD-L1通过以下方式阻碍抗肿瘤免疫：1)通过与其在活化的T细胞上的受体程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)(CD279)结合来耐受肿瘤反应性T细胞；2)由通过肿瘤细胞表达的PD-L1的PD-1信号传导使肿瘤细胞对CD8+T细胞和Fas配体介导的裂解具有抗性；3)由通过T细胞表达的CD80(B7.1)的反向信号传导来耐受T细胞；和4)促进诱导性T调节细胞的发生和维持。PD-L1在许多人癌症中表达，包括黑素瘤、卵巢癌、肺癌和结肠癌(Latchman et al.,2004Proc Natl Acad Sci USA101,10691-6)。
CD137(4-1BB，TNFRSF9)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)家族的成员。CD137是CD8+和CD4+T细胞、调节性T细胞(Treg)、自然杀伤(natural killer，NK)和NKT细胞、B细胞和中性粒细胞上的共刺激分子。在T细胞上，CD137不是组成型表达的，而是在T细胞受体(T-cell receptor，TCR)激活之后诱导的。通过其天然配体4-1BBL或激动剂抗体的刺激导致使用TNFR相关因子(TNFR-associated factor，TRAF)-2和TRAF-1作为衔接子的信号传导。CD137的早期信号传导涉及K-63多泛素化反应，其最终导致核因子(nuclear factor，NF)-κB和丝裂原活化蛋白(mitogen-activated protein，MAP)-激酶途径的激活。信号转导导致提高的T细胞共刺激、增殖、细胞因子产生、成熟和延长的CD8+T细胞存活。已表明针对CD137的激动性抗体在多种临床前模型中促进T细胞的抗肿瘤控制(Murillo et al.2008Clin.Cancer Res.14(21):6895-6906)。刺激CD137的抗体可诱导T细胞的存活和增殖，从而增强抗肿瘤免疫应答。在现有技术中已经公开了刺激CD137的抗体，包括人IgG4抗体乌瑞鲁单抗(urelumab)(WO2005035584)和人IgG2抗体乌托米单抗(utomilumab)(Fisher et al.2012CancerImmunol.Immunother.61:1721-1733)。
需要新的策略来提高疫苗，特别是癌症疫苗的有效性。
本文中表明，可结合PD-L1和CD137二者的多特异性抗体能够扩大疫苗诱导的抗原特异性T细胞应答并增强抗肿瘤免疫。可通过施用疫苗RNA即编码要针对其诱导免疫应答的抗原或表位的RNA来实现疫苗接种。
发明内容
本发明人令人惊讶地发现，疫苗接种(例如，通过施用编码用于疫苗接种的肽或蛋白质的RNA(编码抗原的RNA))的有效性可通过共同施用与至少PD-L1和CD137结合的多特异性(例如双特异性、三特异性等)结合剂来提高。在人中，CD137在活化的T细胞例如CD8+T细胞和CD4+T细胞上表达，而PD-L1主要在抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)例如树突细胞或肿瘤细胞上表达。在一个实施方案中，通过其PD-L1结合区，结合剂结合表达PD-L1的肿瘤细胞或抗原呈递细胞(APC)，而通过其CD137结合区，结合剂结合并活化T细胞，导致条件性活化T细胞。不受理论的束缚，当根据本发明的结合剂与PD-L1和CD137同时结合时，根据本发明的结合剂可介导CD137的聚集(clustering)。结合剂对CD137的聚集是充分活化该受体和CD137介导的T细胞共刺激所需的。在一个实施方案中，根据本发明的结合剂例如双特异性抗体可通过与细胞上的PD-L1和CD137同时结合来介导APC和T细胞之间的细胞间相互作用。因此，这可导致抗原特异性T细胞的增殖。在一个实施方案中，结合剂使T细胞靠近肿瘤细胞，从而促进T细胞杀伤肿瘤细胞。在一个实施方案中，使表达PD-L1的肿瘤细胞和效应T细胞(例如CD8+T细胞)彼此靠近可启动干扰素-γ的释放，这进而可上调肿瘤细胞上的PD-L1，因此促进更多的结合剂募集至肿瘤并进一步增强其杀伤。因此，这可通过T细胞上的CD137的结合导致在存在肿瘤细胞的情况下T细胞的进一步活化，而肿瘤细胞上的PD-L1的结合使T细胞和肿瘤细胞更接近。因此，在存在肿瘤细胞的情况下T细胞的活化可导致T细胞对肿瘤细胞的杀伤增强。此外，根据本发明的结合剂的PD-L1抗原结合区抑制肿瘤细胞上的PD-L1与T细胞上的PD-1结合的能力阻止了肿瘤细胞能够诱导T细胞抑制并因此逃避活化T细胞的抗肿瘤作用。PD-L1与活化T细胞上表达的PD1结合可导致T细胞抑制。在一个实施方案中，结合剂抑制人PD-L1与人PD-1的结合，从而阻止PD-L1通过PD-1阻碍抗肿瘤免疫。因此，结合剂阻止T细胞通过PD-1/PD-L1相互作用接收抑制性信号，同时通过与CD137分子结合接收激活信号，从而产生增强T细胞增殖、活化、效应和记忆功能的信号传导。结合剂例如双特异性抗体可阻断PD1-(PD-L1)抑制性信号，并在通过反式结合发生激活的情况下同时通过与活化T细胞上表达的CD137分子的反式结合共刺激T细胞。本文中所述的与至少PD-L1和CD137结合的结合剂可具有惰性Fc区或替代地，没有Fc结合区，并因此当与CD137结合时不会在T细胞上诱导补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)或其他Fc介导的效应功能。本文中所述的与至少PD-L1和CD137结合的结合剂可活化T细胞。本文中所述的与至少PD-L1和CD137结合的结合剂可适用于活化肿瘤特异性T细胞，例如肿瘤浸润性T细胞。
在一个方面，本发明涉及用于治疗对象的方法，其包括向所述对象施用：
a.肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸，所述肽或蛋白质包含用于在所述对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位；和
b.结合剂或者编码所述结合剂的多核苷酸，所述结合剂包含与PD-L1结合的第一抗原结合区和与CD137结合的第二抗原结合区。
在一个实施方案中，对象是人。在一个实施方案中，PD-L1是人PD-L1和/或CD137是人CD137。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区抑制PD-L1与PD-1的结合，例如人PD-L1与人PD-1的结合。
在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:13所示序列的HCDR3。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ IDNO:12所示序列的HCDR2。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:11所示序列的HCDR1。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含SEQ ID NO:11、SEQID NO:12和SEQ ID NO:13所示的序列。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有SEQ ID NO:16所示序列的LCDR3。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有序列DDN的LCDR2。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有SEQ ID NO:15所示序列的LCDR1。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含SEQ IDNO:15、DDN和SEQ ID NO:16所示的序列。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含HCDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含LCDR3序列，其中所述HCDR3序列包含SEQ ID NO:13所示的序列，并且所述LCDR3序列包含SEQ ID NO:16所示的序列。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含SEQ ID NO:15、DDN和SEQ ID NO:16所示的序列。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:10所示VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含SEQID NO:10所示的序列。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:14所示VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含SEQ ID NO:14所示的序列。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:10所示VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:14所示VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:10所示VH序列的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:14所示VL序列的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:10所示VH序列的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:14所示VL序列的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:10所示VH序列的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:14所示VL序列的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO:10所示的序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:14所示的序列。在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体与包含如上所示的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)、或其组合的抗体竞争PD-L1结合和/或具有其针对PD-L1的特异性。
在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:4所示序列的HCDR3。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ IDNO:3所示序列的HCDR2。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:2所示序列的HCDR1。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含SEQ ID NO:2、SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有SEQ ID NO:7所示序列的LCDR3。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有序列GAS的LCDR2。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有SEQ ID NO:6所示序列的LCDR1。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含SEQ IDNO:6、GAS和SEQ ID NO:7所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含HCDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含LCDR3序列，其中所述HCDR3序列包含SEQ ID NO:4所示的序列，并且所述LCDR3序列包含SEQ ID NO:7所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含SEQ ID NO:6、GAS和SEQ ID NO:7所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8所示VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9所示VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:1所示VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:5所示VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:1所示VH序列的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:5所示VL序列的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:1所示VH序列的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:5所示VL序列的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:1所示VH序列的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:5所示VL序列的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO:1所示的序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:5所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:8所示VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:9所示VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:8所示VH序列的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:9所示VL序列的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:8所示VH序列的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:9所示VL序列的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:8所示VH序列的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:9所示VL序列的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO:8所示的序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:9所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体与包含如上所示的重链可变区或轻链可变区、或其组合的抗体竞争CD137结合和/或具有其针对CD137的特异性。
在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:27所示序列的HCDR3。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ IDNO:26所示序列的HCDR2。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:25所示序列的HCDR1。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含SEQ ID NO:25、SEQID NO:26和SEQ ID NO:27所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有SEQ ID NO:30所示序列的LCDR3。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有序列SAS的LCDR2。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有SEQ ID NO:29所示序列的LCDR1。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含SEQ IDNO:29、SAS和SEQ ID NO:30所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含HCDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含LCDR3序列，其中所述HCDR3序列包含SEQ ID NO:27所示的序列，并且所述LCDR3序列包含SEQ ID NO:30所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含SEQ ID NO:29、SAS和SEQ ID NO:30所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:24所示VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含SEQID NO:24所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:28所示VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含SEQ ID NO:28所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:24所示VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:28所示VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:24所示VH序列的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:28所示VL序列的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:24所示VH序列的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:28所示VL序列的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:24所示VH序列的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:28所示VL序列的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO:24所示的序列并且所述VL包含SEQ ID NO:28所示的序列。在一个实施方案中，所述与CD137结合的第二抗原结合区包含抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体与包含如上所示的重链可变区或轻链可变区、或其组合的抗体竞争CD137结合和/或具有其针对CD137的特异性。
在一个实施方案中，结合剂包含与PD-L1结合的第一抗原结合区和与CD137结合的第二抗原结合区，其中
a)所述第一抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含SEQ IDNO:13所示的HCDR3序列，和
b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含SEQ IDNO:4所示的HCDR3序列。
在一个实施方案中，结合剂包含与PD-L1结合的第一抗原结合区和与CD137结合的第二抗原结合区，其中
a)所述第一抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含SEQ IDNO:16所示的LCDR3序列，和
b)所述第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含SEQ IDNO:7所示的LCDR3序列。
在一个实施方案中，结合剂包含与PD-L1结合的第一抗原结合区和与CD137结合的第二抗原结合区，其中
a)所述第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:13所示的HCDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:16所示的LCDR3序列，和
b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:4所示的HCDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:7所示的LCDR3序列。
在一个实施方案中，结合剂包含与PD-L1结合的第一抗原结合区和与CD137结合的第二抗原结合区，其中
a)所述第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)分别包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，所述轻链可变区(VL)分别包含SEQ ID NO:15、DDN和SEQ ID NO:16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，和
b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)分别包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，所述轻链可变区(VL)分别包含SEQ ID NO:6、GAS和SEQ ID NO:7所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列。
在一个实施方案中，结合剂包含与PD-L1结合的第一抗原结合区和与CD137结合的第二抗原结合区，其中
a)所述第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:10所示VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:14所示VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列，和
b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:8所示VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ IDNO:9所示VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
在一个实施方案中，结合剂包含与PD-L1结合的第一抗原结合区和与CD137结合的第二抗原结合区，其中
a)所述第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:10所示VH序列的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:14所示VL序列的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列，和
b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:8所示VH序列的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:9所示VL序列的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列。
在一个实施方案中，结合剂包含与PD-L1结合的第一抗原结合区和与CD137结合的第二抗原结合区，其中
a)所述第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:10所示VH序列的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:14所示VL序列的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，和
b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:8所示VH序列的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:9所示VL序列的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列。
在一个实施方案中，结合剂包含与PD-L1结合的第一抗原结合区和与CD137结合的第二抗原结合区，其中
a)所述第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:10所示VH序列的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:14所示VL序列的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，和
b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含与SEQ ID NO:8所示VH序列的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:9所示VL序列的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列。
在一个实施方案中，结合剂包含与PD-L1结合的第一抗原结合区和与CD137结合的第二抗原结合区，其中
a)所述第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO:10所示VH序列的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:14所示VL序列的氨基酸序列，和
b)所述第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO:8所示VH序列的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:9所示VL序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体与包含如上所示的与PD-L1结合的第一抗原结合区的重链可变区或轻链可变区、或其组合的抗体竞争PD-L1结合和/或具有其针对PD-L1的特异性，并且所述与CD137结合的第二抗原结合区包含抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体与包含如上所示的与CD137结合的第二抗原结合区的重链可变区或轻链可变区、或其组合的抗体竞争CD137结合和/或具有其针对CD137的特异性。
在一个实施方案中，结合剂包含来源于人抗体的与PD-L1结合的第一抗原结合区，和/或来源于人源化抗体的与CD137结合的第二抗原结合区。
在一个实施方案中，结合剂是全长抗体的形式。在一个实施方案中，结合剂是抗体片段的形式。在一个实施方案中，结合剂是多特异性抗体，例如双特异性抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述结合剂包含多肽，其中所述多肽是重链(HC)。在本发明的一个实施方案中，重链(HC)包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。在本发明的一个实施方案中，重链恒定区(CH)包含恒定区结构域1区(CH1)、铰链区、恒定区结构域2区(CH2)和恒定区结构域3区(CH3)。
在本发明的一个实施方案中，结合剂，特别是多特异性抗体例如双特异性抗体的形式的结合剂，包含(i)包含第一重链可变区(VH)并且还包含第一重链恒定区(CH)的多肽，和(ii)包含第二重链可变区(VH)并且还包含第二重链恒定区(CH)的多肽。替代地或另外地，在本发明的一个实施方案中，结合剂，特别是多特异性抗体如双特异性抗体的形式的结合剂，包含(i)包含第一轻链可变区(VL)并且还包含第一轻链恒定区(CL)的多肽，和(ii)包含第二轻链可变区(VL)并且还包含第二轻链恒定区(CL)的多肽。
在本发明的一个实施方案中，结合剂是抗体，例如多特异性抗体，优选双特异性抗体，其包含第一结合臂和第二结合臂，其中
a.所述第一结合臂包含i)包含第一重链可变区(VH)和第一重链恒定区(CH)的多肽，和ii)包含第一轻链可变区(VL)和第一轻链恒定区(CL)的多肽；和
b.所述第二结合臂包含iii)包含第二重链可变区(VH)和第二重链恒定区(CH)的多肽，和iv)包含第二轻链可变区(VL)和第二轻链恒定区(CL)的多肽。
在一个实施方案中，所述第一重链可变区(VH)包含于与PD-L1结合的第一抗原结合区并且所述第二重链可变区(VH)包含于与CD137结合的第二抗原结合区，和/或所述第一轻链可变区(VL)包含于与PD-L1结合的第一抗原结合区并且所述第二轻链可变区(VL)包含于与CD137结合的第二抗原结合区。
在一个实施方案中，所述第一重链恒定区(CH)包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列和/或所述第二重链恒定区(CH)包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述第一重链恒定区(CH)包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列和/或所述第二重链恒定区(CH)包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述第一轻链恒定区(CL)包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列和/或所述第二轻链恒定区(CL)包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述第一轻链恒定区(CL)包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列和/或所述第二轻链恒定区(CL)包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述第一重链恒定区(CH)包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述第二重链恒定区(CH)包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述第一轻链恒定区(CL)包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，并且所述第二轻链恒定区(CL)包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，结合剂，特别是多特异性抗体例如双特异性抗体的形式的结合剂，包含第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)，所述重链恒定区(CH)包含恒定区结构域1区(CH1区)、铰链区、CH2区和CH3区中的一个或更多个，优选至少铰链区、CH2区和CH3区。
在本发明的一个实施方案中，结合剂，特别是多特异性抗体例如双特异性抗体的形式的结合剂，具有选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的同种型。在本发明的一个实施方案中，同种型选自人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4。
在本发明的一个实施方案中，第一结合臂来源于全长抗体。在本发明的一个实施方案中，第一结合臂来源于单克隆抗体。在本发明的一个实施方案中，第一结合臂来源于全长IgG1，λ或IgG1，κ抗体。
在本发明的一个实施方案中，第二结合臂来源于全长抗体。在本发明的一个实施方案中，第二结合臂来源于单克隆抗体。在本发明的一个实施方案中，第二结合臂来源于全长IgG1，λ或IgG1，κ抗体。
在本发明的一个实施方案中，第一结合臂和第二结合臂来源于全长抗体，例如全长IgG1，λ或IgG1，κ抗体。在本发明的一个实施方案中，第一结合臂和第二结合臂来源于单克隆抗体。
在本发明的一个实施方案中，第一抗原结合区或结合臂来源于IgG1λ，并且第二抗原结合区或结合臂来源于IgG1κ。
本文中所述的抗体包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体，及其组合，其中所述重链具有不同的同种型和/或亚类。在多个实施方案中，抗体是IgG1抗体，更特别是IgG1，κ或IgG1，λ同种型(即IgG1，κ、λ)、IgG2a抗体(例如IgG2a，κ、λ)、IgG2b抗体(例如IgG2b，κ、λ)、IgG3抗体(例如IgG3，κ、λ)或IgG4抗体(例如IgG4，κ、λ)。
在本发明的一个实施方案中，结合剂是多特异性结合剂例如双特异性结合剂。在本发明的一个实施方案中，结合剂是抗体(特别是多特异性抗体，例如双特异性抗体)，例如嵌合或人源化或人抗体。在本发明的一个实施方案中，结合剂是全长抗体或抗体片段的形式。在本发明的一个实施方案中，第一抗原结合区来源于单克隆抗体。在本发明的一个实施方案中，第二抗原结合区来源于单克隆抗体。在本发明的一个实施方案中，第一抗原结合区来源于单克隆抗体，并且第二抗原结合区来源于单克隆抗体。
在本发明的一个实施方案中，结合剂是全长IgG1抗体。在本发明的一个实施方案中，结合剂是全长人IgG1抗体。在本发明的一个实施方案中，结合剂是在恒定区具有一个或更多个突变的全长人IgG1抗体。
在本发明的一个实施方案中，结合剂是嵌合、人源化或人抗体。在其中结合剂是双特异性抗体的本发明的一些实施方案中，两个半分子都可以是人的、人源化的或嵌合的，或者半分子的特征可在序列来源方面不同。
在本发明的一个实施方案中，结合剂，特别是多特异性抗体例如双特异性抗体的形式的结合剂，包含第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)，所述重链恒定区(CH)包含CH3区，并且其中两个CH3区包含不对称的突变。
在本发明的一个优选实施方案中，结合剂，特别是多特异性抗体例如双特异性抗体的形式的结合剂，包含第一重链恒定区(CH)和第二重链恒定区(CH)，其中所述第一重链和第二重链中的每一个包含至少铰链区、CH2和CH3区，其中在所述第一重链恒定区(CH)中，在对应于选自根据EU编号的人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置的位置处的至少一个氨基酸已被替换，并且在所述第二重链中，在对应于选自根据EU编号的人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409的位置的位置处的至少一个氨基酸已被替换，并且其中所述第一重链和所述第二重链不是在相同位置被替换。
最优选地，(i)在所述第一重链恒定区(CH)中，在对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置处的氨基酸是L，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，在对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置处的氨基酸是R，或者(ii)在所述第一重链中，在对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置处的氨基酸是R，并且在所述第二重链中，在对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置处的氨基酸是L。
在本发明的一个实施方案中，结合剂是抗体，例如多特异性抗体，优选双特异性抗体，其中所述抗体与包含相同第一抗原结合区和第二抗原结合区以及含有人IgG1铰链区、CH2区和CH3区的两个重链恒定区(CH)的另一种抗体相比诱导Fc介导的效应功能的程度更小。在本发明的一个实施方案中，所述第一重链恒定区和第二重链恒定区被修饰，使得所述抗体与除了包含未经修饰的第一重链和第二重链之外都相同的抗体相比诱导Fc介导的效应功能的程度更小。
在本发明的一个实施方案中，所述Fc介导的效应功能通过与IgG Fc(Fcγ)受体的结合、与C1q的结合或诱导Fc介导的FcR交联来测量。
在本发明的一个优选实施方案中，所述Fc介导的效应功能通过与C1q的结合来测量。
在本发明的一个实施方案中，所述第一重链恒定区和第二重链恒定区已被修饰，使得C1q与所述抗体的结合与野生型抗体相比降低，优选降低至少70％、至少80％，至少90％、至少95％、至少97％或100％，其中C1q结合优选通过ELISA确定。
在本发明的一个实施方案中，在所述第一重链恒定区和第二重链恒定区中的至少一个中，在对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置处的一个或更多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。在本发明的一个实施方案中，在所述第一重链恒定区和第二重链恒定区中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235的位置分别是F和E。在本发明的一个实施方案中，在所述第一重链和第二重链中，对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265的位置分别是F、E和A。
在另一个特别优选的实施方案中，结合剂是包含第一重链恒定区和第二重链恒定区的PD-L1xCD137双特异性抗体，其中第一重链恒定区和第二重链恒定区二者的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265的位置分别是F、E和A，并且其中(i)所述第一重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L，并且所述第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，或者(ii)所述第一重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，并且所述第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L。
在本发明的一个实施方案中，结合剂诱导和/或增强T细胞的增殖。在本发明的一个实施方案中，所述T细胞是CD4+和/或CD8+T细胞。
在本发明的一个实施方案中，结合剂仅在第二抗原结合区与PD-L1结合时激活CD137信号传导。
在本发明的一个实施方案中，T细胞的增殖是通过将表达特异性T细胞受体(TCR)的T细胞与呈递由TCR所识别的在主要组织相容性复合体上的相应抗原的树突细胞(DC)共培养来测量的。
在一个实施方案中，肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸与结合剂或者编码所述结合剂的多核苷酸依次施用，所述肽或蛋白质包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。在一个实施方案中，在施用肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸之后施用所述结合剂或者编码所述结合剂的多核苷酸，所述肽或蛋白质包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。在一个实施方案中，在施用肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸之后6小时或更晚、12小时或更晚或者24小时或更晚施用所述结合剂或者编码所述结合剂的多核苷酸，所述肽或蛋白质包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。在一个实施方案中，在施用肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸之后的12小时至48小时施用所述结合剂或者编码所述结合剂的多核苷酸，所述肽或蛋白质包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
在一个实施方案中，编码所述肽或蛋白质的多核苷酸和/或编码所述结合剂的多核苷酸是RNA，所述肽或蛋白质包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
在一个实施方案中，本发明的方法包括向对象施用：
a.编码所述肽或蛋白质的RNA，所述肽或蛋白质包含用于在所述对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位；和
b.所述结合剂。
在一个实施方案中，施用所述结合剂或编码所述结合剂的多核苷酸提高了针对所述抗原或表达所述抗原的细胞具有特异性的CD8阳性T细胞的数量。
在一个实施方案中，本发明的方法是用于在所述对象中诱导免疫应答的方法。在一个实施方案中，本发明的方法是用于在所述对象中诱导针对所述抗原或表达所述抗原的细胞的免疫应答的方法。在一个实施方案中，本发明的方法是用于在所述对象中治疗或预防癌症的方法，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。
在一个方面中，本发明涉及药物制剂，其包含：
a.肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸，所述肽或蛋白质包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位；和
b.结合剂或者编码所述结合剂的多核苷酸，所述结合剂包含与PD-L1结合的第一抗原结合区和与CD137结合的第二抗原结合区。
在一个实施方案中，结合剂是如上为本发明方法所定义的结合剂。在一个实施方案中，与PD-L1结合的第一抗原结合区和/或与CD137结合的第二抗原结合区是如上为本发明方法所定义的。
在一个实施方案中，所述药物制剂包含：
a.编码所述肽或蛋白质的RNA，所述肽或蛋白质包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位；和
b.所述结合剂。
在一个实施方案中，所述药物制剂是药盒。在一个实施方案中，所述药物制剂包含在单独的容器中的各组分a.和b.。在一个实施方案中，所述药物制剂还包含所述药物制剂用于治疗或预防癌症的使用说明，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。
在一个实施方案中，所述药物制剂用于医药用途。在一个实施方案中，所述医药用途包括疾病或病症的治疗性或预防性治疗。在一个实施方案中，所述药物制剂用于在对象中治疗或预防癌症的方法中，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。
在一个实施方案中，所述药物制剂是药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物还包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
在药物制剂的一个实施方案中，RNA以选自液体形式、固体形式或其组合的形式存在。在一个实施方案中，固体形式为冷冻形式或脱水形式。在一个实施方案中，脱水形式为冷冻干燥或喷雾干燥形式。
在一个方面，本发明涉及本文中所述的药剂或组合物，例如包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或蛋白质、编码所述肽或蛋白质的多核苷酸、包含与PD-L1结合的第一抗原结合区和与CD137结合的第二抗原结合区的结合剂、编码所述结合剂的多核苷酸、或者用于本文中所述方法的药物制剂。
在本文中所述的所有方面的一个实施方案中，编码包含表位的肽或蛋白质的RNA被递送至淋巴系统例如次级淋巴器官以表达所编码的蛋白质和/或被配制用于递送至淋巴系统例如次级淋巴器官。
附图说明
图1：在C57BL/6小鼠中联合TRP1 RNA疫苗时与同种型对照相比用小鼠反应性PD-L1x4-1BB bsAb处理之后抗原特异性CD8+T细胞的扩增。
C57BL/6小鼠(每组n＝5)在第1天用20μg TRP1 RNA-LPX进行静脉内(i.v.)疫苗接种，并随后在第2天和第5天用不同剂量的PD-L1x4-1BB bsAb进行腹膜内(i.p.)处理。对照组同时接受TRP1疫苗和同种型对照抗体。(A)TRP1特异性CD8+T细胞在所有外周CD8+T细胞中的频率，每μL血液中(B)TRP1特异性CD8+T细胞、(C)总CD8+T细胞和(D)CD45+淋巴细胞的绝对数量，其如实施例1所述来自C57BL/6小鼠在疫苗接种之后7天通过流式细胞术测定。点代表个体小鼠，线代表组平均值。示出了平均值±SD。使用单因素ANOVA和随后的Dunnett多重比较检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用GraphPad Prism 6进行。ns P>0.05，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图2：在C57BL/6小鼠中联合TRP1 RNA疫苗时与同种型对照相比用小鼠反应性PD-L1x4-1BB bsAb或抗PD-L1 mAb处理之后抗原特异性CD8+T细胞的扩增。
C57BL/6小鼠(每组n＝5)在第1天用20μg TRP1 RNA-LPX进行i.v.疫苗接种，并随后在第2天用最佳剂量的PD-L1x4-1BB bsAb(50μg)或抗PD-L1 mAb(250μg)进行i.p.处理。对照组同时接受TRP1疫苗和同种型对照抗体。(A)TRP1特异性CD8+T细胞在所有外周CD8+T细胞中的频率，每μL血液中(B)TRP1特异性CD8+T细胞、(C)总CD8+T细胞和(D)CD45+淋巴细胞的绝对数量，其如实施例2所述来自C57BL/6小鼠在疫苗接种之后7天通过流式细胞术测定。点代表个体小鼠，线代表组平均值。示出了平均值±SD。使用单因素ANOVA和随后的Dunnett多重比较检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用GraphPad Prism6进行。ns P>0.05，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图3：在鼠黑素瘤模型B16中联合治疗性RNA疫苗时与同种型对照相比用小鼠反应性PD-L1x4-1BB bsAb处理之后肿瘤生长降低导致存活提高。
C57BL/6小鼠(每组n＝10)用3×105B16-F10黑素瘤细胞进行皮下(s.c.)接种，并用20μg TRP1 RNA-LPX每周3次(第8、15、22天)进行静脉内(i.v.)疫苗接种，随后在第9、12、16、19、23和26天进行PD-L1x4-1BB bsAb处理。对照组接受不编码任何抗原的RNA疫苗(irr疫苗)与PD-L1x4-1BB bsAb或同种型对照抗体，或者接受TRP1疫苗与同种型对照抗体。存在或不存在TRP1疫苗的情况下用PD-L1x4-1BB bsAb或同种型对照抗体处理的小鼠的(A)个体小鼠的肿瘤生长和(B)存活。(A)中的比率代表每组中无肿瘤小鼠的数量相比于小鼠的总数。
图4：在鼠黑素瘤模型B16中联合治疗性RNA疫苗时与同种型对照相比用小鼠反应性PD-L1x4-1BB bsAb处理之后肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的扩增。
(A)两轮疫苗接种(第8、15天)和四次抗体应用(第9、12、16和19天)之后每μL血液中TRP1特异性CD8+T细胞数量的动力学。(B)第1次疫苗接种之后第7天TRP1特异性CD8+T细胞和总CD8+T细胞的绝对数量。(C)第2次疫苗接种之后第7天TRP1特异性CD8+T细胞和总CD8+T细胞的绝对数量。(D)第1次和第2次疫苗接种之后第7天的总CD45+淋巴细胞计数。如实施例3和图3中所述，来自C57BL/6小鼠的细胞数量通过流式细胞术测定。(A)中的点代表组平均值，其中误差条代表SD。(B至D)中的点代表个体小鼠，线代表组平均值。示出了平均值±SD。使用单因素ANOVA和随后的Dunnett多重比较检验确定统计学显著性。所有分析是双尾的，并使用GraphPad Prism 6进行。ns P>0.05，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
具体实施方式
尽管以下详细描述了本公开内容，但是应理解，本公开内容不限于本文中所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述一些具体实施方案的目的，并且不旨在限制本公开内容的范围，本公开内容的范围将仅受所附权利要求书限制。除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
优选地，本文中使用的术语如“Amultilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)”,H.G.W.Leuenberger,B.Nagel和H.
Figure BDA0003779759780000221
编辑,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)中所述进行定义。
除非另外指出，否则本公开内容的实施将采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，其在本领域的文献中进行了说明(参见例如MolecularCloning:ALaboratory Manual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。
在下文中，将描述本公开内容的一些要素。这些要素随一些具体实施方案列出，然而，应理解，其可以以任何方式且以任何数量组合以产生另外的实施方案。不同描述的一些实例和实施方案不应被解释为将本公开内容仅限于明确描述的一些实施方案。本说明书应理解为公开和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则所有描述要素的任何排列和组合应被认为被本说明书所公开。
术语“约”意指大约或接近，并且在本文中所列的数值或范围的情况下在一个实施方案中意指所记载或要求保护的数值或范围的±20％、±10％、±5％、或±3％。
除非本文中另外指出或者与上下文明显矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应解释为涵盖一个/种和/或更多个/种。本文中数值范围的记载仅旨在用作单独提及落入所述范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另外指出，否则每个单独值均被并入本说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。除非本文中另外指出或者另外与上下文明显矛盾，否则本文中所述的所有方法均可以以任何合适的依次进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本公开内容，而不对权利要求书的范围构成限制。本说明书中的语言均不应被解释为指示实施本公开内容所必需的任何未要求保护的要素。
除非另有明确说明，否则在本文件的上下文中使用术语“包含/包括”以指示除由“包含/包括”引入的列表的成员之外还可任选地存在其他成员。然而，作为本公开内容的具体实施方案认为，术语“包含/包括”涵盖不存在其他成员的可能性，即，出于这个实施方案的目的，“包含/包括”应理解为具有“由......组成”的含义。
在本说明书的正文通篇引用了数篇文件。本文中无论是在上文还是在下文引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指南等)均在此通过引用整体并入。本文中的内容均不应解释为承认本公开内容无权早于这样的公开内容。
下面将提供适用于本公开内容的所有方面的定义。除非另外指出，否则以下术语具有以下含义。任何未经定义的术语均具有其本领域公认的含义。
本文中使用的例如“减少”、“降低”、“抑制”或“损害”的术语涉及水平(例如，结合水平)的总体降低或导致总体降低的能力，优选5％或更大、10％或更大、20％或更大，更优选50％或更大，更优选75％或更大且最优选100％。
例如“提高”、“增强”或“超过”的术语优选涉及提高或增强约至少10％，优选至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少80％，并且最优选至少100％，至少200％，至少500％，或甚至更多。
根据本公开内容，术语“肽”包括寡肽和多肽并且是指包含通过肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，并且多至约50个、约100个、或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”或“多肽”是指大肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽，但是术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中通常作为同义词使用。
“治疗性蛋白质”当以治疗有效量提供给对象时，对该对象的病症或疾病状态具有积极或有利作用。在一个实施方案中，治疗性蛋白质具有治愈性或姑息治疗性(palliative)特性并且可被施用以改善、缓解、减轻、逆转疾病或病症、延迟疾病或病症发作，或者减轻疾病或病症的一种或更多种症状的严重程度。治疗性蛋白质可具有预防特性，并且可用于延迟疾病发作或减轻这样的疾病或病理状况的严重程度。术语“治疗性蛋白质”包括完整的蛋白质或肽，并且也可指其治疗活性片段。其还可包括蛋白质的治疗活性变体。治疗活性蛋白质的一些实例包括但不限于用于疫苗接种的肽或蛋白质。
关于氨基酸序列(肽或蛋白质)，“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即表示在N端和/或C端缩短的氨基酸序列的序列。在C端缩短的片段(N端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的3’端的截短的开放阅读框来获得。在N端缩短的片段(C端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的5’端的截短的开放阅读框来获得，只要截短的开放阅读框包含用于起始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含来自氨基酸序列的例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个、特别地至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。
本文中的“变体”或“变体蛋白”或“变体多肽”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于野生型蛋白质的蛋白质。亲本多肽可以是天然存在的或野生型(wild type，WT)多肽，或者可以是野生型多肽的经修饰形式。优选地，变体多肽与亲本多肽相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比，具有1至约20个氨基酸修饰，并且优选1至约10或1至约5个氨基酸修饰。
本文中使用的“亲本多肽”、“亲本蛋白”、“前体多肽”或“前体蛋白”意指随后被修饰以产生变体的未经修饰多肽。亲本多肽可以是野生型多肽，或者野生型多肽的变体或经改造形式。
本文中的“野生型”或“WT”或“天然的”意指在自然界中存在的氨基酸序列，包括等位基因变化。野生型蛋白或多肽具有未经有意修饰的氨基酸序列。
出于本公开内容的目的，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。术语“变体”包括所有剪接变体、翻译后修饰的变体、构象体、异构体和物种同源物，特别是由细胞天然表达的那些。术语“变体”特别地包括氨基酸序列的片段。
氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中单个或两个或更多个氨基酸的插入。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或更多个氨基酸残基被插入氨基酸序列中的特定位点中，但是随机插入并合适筛选所得产物也是可以的。氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸的氨基和/或羧基端融合。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或更多个氨基酸，例如，去除1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸。缺失可在蛋白质的任何位置中。在蛋白质的N端和/或C端末端包含缺失的氨基酸缺失变体也称为N端和/或C端截短变体。氨基酸替换变体的特征在于去除序列中的至少一个残基，并在其位置中插入另外残基。优先考虑的是修饰发生在氨基酸序列中在同源蛋白或肽之间非保守的位置中和/或用具有相似特性的另一些氨基酸来替换氨基酸。优选地，肽和蛋白质变体中的氨基酸变化是保守氨基酸变化，即类似带电荷或不带电荷氨基酸的替换。保守氨基酸变化涉及其侧链相关联的氨基酸的家族之一的替换。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。
在本发明的上下文中，保守替换可通过下表中反映的氨基酸类别内的替换来限定：
Figure BDA0003779759780000251
Figure BDA0003779759780000261
优选地，给定氨基酸序列与作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性，优选同一性的程度将为至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。相似性或同一性的程度优选地针对为参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则相似性或同一性的程度优选地针对至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，优选连续氨基酸给出。在一些优选实施方案中，相似性或同一性的程度针对参考氨基酸序列的全长给出。用于确定序列相似性，优选序列同一性的比对可使用本领域已知的工具，优选地使用最佳序列比对，例如，使用Align，使用标准设置，优选EMBOSS::needle，矩阵:Blosum62，空位开放(Gap Open)10.0，空位延伸(Gap Extend)0.5来完成。
“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。
术语“百分比同一性”旨在表示待比较的两个序列之间在最佳比对之后获得的相同的氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异是随机分布的并且在其全长上。两个氨基酸序列之间的序列比较常规上是通过在最佳地对其比对之后对这些序列进行比较来进行的，所述比较是通过区段或通过“比较窗口”进行的，以便鉴定和比较序列相似性的局部区域。用于比较的序列的最佳比对除了人工之外，还可借助于Smith and Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法、借助于Neddlemanand Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法，借助于Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA85,2444的相似性检索方法，或者借助于使用这些算法的计算机程序(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)来产生。
百分比同一性通过确定待比较的两个序列之间相同的位置的数目，将该数目除以所比较的位置的数目，并将获得的结果乘以100来计算，以便获得这两个序列之间的百分比同一性。
根据本公开内容，同源氨基酸序列显示出氨基酸残基的至少40％，特别地至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，并且优选地至少95％、至少98％或至少99％同一性。
本文中所述的氨基酸序列变体可由技术人员例如通过重组DNA操作来容易地制备。用于制备具有替换、添加、插入或缺失的肽或蛋白质的DNA序列的操作在例如Sambrooket al.(1989)中详细描述。此外，本文中所述的肽和氨基酸变体可借助于已知的肽合成技术例如如通过固相合成和类似方法来容易地制备。
在一个实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体优选是“功能性片段”或“功能性变体”。术语氨基酸序列的“功能性片段”或“功能性变体”涉及以下任何片段或变体，其表现出与该片段或变体所来源的氨基酸序列的一种或更多种功能特性相同或相似的一种或更多种功能特性(即，其是功能等同的)。关于用于疫苗接种的肽或蛋白质，一种特定功能是诱导针对该片段或变体所来源的氨基酸序列(例如天然存在的抗原)和/或由该片段或变体所来源的氨基酸序列(例如天然存在的抗原)所诱导的免疫应答。本文中使用的术语“功能性片段”或“功能性变体”特别是指包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比改变一个或更多个氨基酸并且仍然能够实现亲本分子或序列的一种或更多种功能(例如，诱导针对靶分子的免疫应答)的氨基酸序列的变体分子或序列。在一个实施方案中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不显著影响或改变该分子或序列的免疫原性特性。在一些不同的实施方案中，功能性片段或功能性变体的免疫原性可降低但仍显著存在，例如，功能性变体的免疫原性可为亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在另一些实施方案中，与亲本分子或序列相比，功能性片段或功能性变体的免疫原性可以是增强的。
“来源于”指定氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)是指第二氨基酸序列的来源。优选地，来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员将理解，本文中适用于疫苗接种的肽或蛋白质可以被改变，使得它们的序列与它们所来源的天然存在或天然的靶序列不同，同时保留了诱导针对天然序列的免疫应答的期望活性。
本文中使用的“说明材料”或“说明”包括可用于传达本发明的组合物和方法的有用性的出版物、记录、图表或任何其他表达媒介。例如，本发明的药盒的说明材料可标附到含有本发明组合物的容器上，或者与含有所述组合物的容器一起运输。或者，说明材料可以与容器分开运输，目的是让接受者合作使用说明材料和组合物。
“分离的”意指从天然状态改变或去除。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全从其天然状态的共存物质中分离的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以充分纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境，例如宿主细胞中。
在本发明的上下文中，术语“重组”意指“通过遗传工程制备”。优选地，在本发明的上下文中，“重组物质”例如重组细胞是非天然存在的。
本文中使用的术语“天然存在的”是指物体可在自然界中存在的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从天然来源中分离且没有在实验室中被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
术语“遗传修饰”包括用核酸转染细胞。术语“转染”涉及将核酸，特别是RNA引入细胞中。出于本发明的目的，术语“转染”还包括将核酸引入细胞中或由这样的细胞摄入核酸，其中细胞可存在于对象例如患者中。因此，根据本发明，用于转染本文中所述核酸的细胞可存在于体外或体内，例如，细胞可形成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的一些应用，如果仅瞬时表达所转染的遗传物质就已足够。由于在转染过程中引入的核酸通常不会整合至核基因组中，因此外源核酸将通过有丝分裂而被稀释或者降解。允许核酸进行游离型扩增的细胞大大降低了稀释率。如果期望所转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须发生稳定的转染。这样的稳定转染可通过使用用于转染的基于病毒的系统或基于转座子的系统来实现。通常，将编码用于疫苗接种的肽或蛋白质的核酸瞬时转染到细胞中。可将RNA转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。
在本发明上下文中，术语“免疫效应细胞”或“效应细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应功能的细胞。例如，免疫效应细胞包括T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，并且包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和包括细胞裂解T细胞的细胞毒性T细胞(CTL，CD8+T细胞)。术语“MHC依赖性T细胞”或类似术语涉及当在MHC环境中呈递时识别抗原并优选发挥T细胞效应功能例如杀伤表达抗原的靶细胞的T细胞。
T细胞属于被称为淋巴细胞的白细胞的组群，并且在细胞介导的免疫中发挥主要作用。它们可以通过其细胞表面上被称为T细胞受体(TCR)的特殊受体的存在与其他淋巴细胞类型(例如B细胞和自然杀伤细胞)区分开来。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已经发现了数种不同的T细胞亚群，每种具有独特的功能。
T辅助细胞在免疫过程中辅助其他白细胞，包括B细胞成熟成浆细胞以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化等功能。这些细胞也被称为CD4+T细胞，因为它们在其表面上表达CD4糖蛋白。当辅助T细胞通过在抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)表面上表达的MHC II类分子呈递肽抗原时，其被活化。一旦活化，其迅速分裂并分泌被称为细胞因子的小蛋白，所述小蛋白调节或辅助主动免疫应答。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也参与移植排斥。这些细胞也被称为CD8+T细胞，因为它们在其表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过与存在于身体几乎每个细胞的表面上的MHC I类缔合的抗原结合来识别它们的靶标。
所有T细胞都具有作为数种蛋白质的复合物存在的T细胞受体(TCR)。T细胞的TCR能够与同主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子结合并呈递在靶细胞表面上的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特异性结合触发T细胞内的信号级联，导致增殖和分化成成熟的效应T细胞。在大多数T细胞中，实际的T细胞受体由两条独立的肽链构成，它们由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并被称为α-TCR链和β-TCR链。γδT细胞(gamma delta T细胞)是很不常见(总T细胞的2％)的T细胞组群，其表面上具有由一条γ链和一条δ链构成的独特T细胞受体(TCR)。
所有T细胞都来源于骨髓中的造血干细胞。来源于造血干细胞的造血祖细胞存在于胸腺并通过细胞分裂扩增以产生大量未成熟胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，并因此分类为双阴性(CD4-CD8-)细胞。随着它们通过发育过程进展，它们变成双阳性胸腺细胞(CD4+CD8+)，并且最终成熟成单阳性(CD4+CD8-或CD4-CD8+)胸腺细胞，然后从胸腺释放至外周组织。
本文中使用的术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”是指由CD56或CD16的表达和T细胞受体的缺失定义的外周血淋巴细胞亚群。
人体内MHC分子通常称为HLA(人白细胞抗原)分子。MHC分子有两个主要类别：I类和II类。几乎在身体的所有有核细胞上都发现了MHC I类抗原。这类MHC分子的主要功能是将细胞内蛋白的肽片段展示(或呈递)给CTL。基于这种展示，CTL将攻击展示MHC结合的肽(包括疾病相关肽(抗原)，例如癌症抗原)的那些。CD8阳性T细胞通常具有细胞毒性(因此称为细胞毒性T细胞＝CTL)，识别由任何亚细胞定位的蛋白质在细胞内加工而来并通过MHC I类分子呈递在细胞表面的具有9至10个氨基酸的肽。因此，MHC I类分子的表面表达在决定靶细胞对CTL的敏感性方面起着至关重要的作用。
核酸
本文中使用的术语“多核苷酸”或“核酸”旨在包括DNA和RNA，例如基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的和化学合成的分子。核酸可以是单链或双链的。RNA包括体外转录的RNA(in vitro transcribed RNA，IVT RNA)或合成的RNA。
核酸可包含在载体中。本文中使用的术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，其包括质粒载体、黏粒载体、噬菌体载体(例如λ噬菌体)、病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒或杆状病毒载体)，或人工染色体载体(例如细菌人工染色体(bacterial artificialchromosome，BAC)、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)或P1人工染色体(P1 artificial chromosome，PAC))。所述载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包括质粒以及病毒载体并且一般含有期望编码序列和用于在特定宿主生物体(例如，细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或者在体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所必需的合适的DNA序列。克隆载体一般用于改造和扩增某期望DNA片段，并可缺乏表达所期望DNA片段所需要的功能性序列。
在本发明所有方面的一个实施方案中，核酸例如编码疫苗肽或蛋白质的核酸或编码结合剂的核酸在治疗对象的细胞中表达以提供疫苗肽或蛋白质或者结合剂。在本发明所有方面的一个实施方案中，核酸在对象的细胞中瞬时表达。因此，在一个实施方案中，核酸未整合到细胞的基因组中。在本发明所有方面的一个实施方案中，核酸为RNA，优选体外转录的RNA。
本文中所述核酸可为重组和/或分离的分子。
在本公开内容中，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选实施方案中，RNA包含全部或大部分核糖核苷酸残基。本文中使用的“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2’-位具有羟基的核苷酸。RNA包括但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的RNA之经修饰的RNA。这样的改变可以是指将非核苷酸物质添加至内部RNA核苷酸或RNA的末端。本文中还考虑了RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开内容，这些改变的RNA被认为是天然存在RNA的类似物。
在本公开内容的某些实施方案中，RNA是信使RNA(mRNA)，其是指编码肽或蛋白质的RNA转录物。如本领域中认可的，mRNA通常包含5’非翻译区(5’-UTR)、肽编码区和3’非翻译区(3’-UTR)。在一些实施方案中，RNA通过体外转录或化学合成产生。在一个实施方案中，mRNA通过使用DNA模板进行体外转录产生，其中DNA是指包含脱氧核糖核苷酸的核酸。
在一个实施方案中，RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可通过合适DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸，特别是cDNA并将其引入用于体外转录的合适载体中而获得。cDNA可通过RNA的反转录获得。
在一个实施方案中，本文中所述的RNA可具有经修饰的核苷。在一些实施方案中，RNA包含代替至少一个(例如，每个)尿苷的经修饰的核苷。
本文中使用的术语“尿嘧啶”描述了可存在于RNA的核酸中的核碱基之一。尿嘧啶的结构是：
Figure BDA0003779759780000321
本文中使用的术语“尿苷”描述了可存在于RNA中的核苷之一。尿苷的结构是：
Figure BDA0003779759780000322
UTP(5’-三磷酸尿苷)具有以下结构：
Figure BDA0003779759780000323
假-UTP(5’-三磷酸假尿苷)具有以下结构：
Figure BDA0003779759780000324
“假尿苷”是经修饰的核苷的一个实例，其是尿苷的异构体，其中尿嘧啶通过碳-碳键而不是氮-碳糖苷键与戊糖环连接。
另一示例性的经修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)，其具有以下结构：
Figure BDA0003779759780000331
N1-甲基-假-UTP具有以下结构：
Figure BDA0003779759780000332
另一示例性的经修饰的核苷为5-甲基-尿苷(m5U)，其具有以下结构：
Figure BDA0003779759780000333
在一些实施方案中，本文中所述的RNA中的一个或更多个尿苷被经修饰的核苷替代。在一些实施方案中，经修饰的核苷是经修饰的尿苷。
在一些实施方案中，RNA包含代替至少一个尿苷的经修饰的核苷。
在一些实施方案中，RNA包含代替每个尿苷的经修饰的核苷。
在一些实施方案中，经修饰核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰的核苷包括假尿苷(Ψ)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，经修饰的核苷包括5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，RNA可包含多于一种类型的经修饰的核苷，并且经修饰的核苷独立地选自假尿苷(Ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(ψ)和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，经修饰的核苷包括假尿苷(Ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方案中，替代RNA中的一个或更多个尿苷的经修饰核苷可以是以下中的任一种或更多种：3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5U)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷或本领域中已知的任何其他经修饰尿苷。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含5’-帽。在一个实施方案中，本公开内容的RNA不具有未加帽的5'-三磷酸。在一个实施方案中，RNA可被5'-帽类似物修饰。术语“5’-帽”是指见于mRNA分子的5’-端的结构，并且通常由通过5’至5’三磷酸连接与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7位被甲基化。提供具有5'-帽或5'-帽类似物的RNA可通过体外转录来实现，其中5'-帽共转录表达到RNA链中，或者可使用加帽酶转录后与RNA连接。
在一些实施方案中，RNA的构件单元帽为m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG(有时也称为m2 7,3` OG(5’)ppp(5’)m2’-OApG)，其具有以下结构：
Figure BDA0003779759780000351
下面是示例性帽1RNA，其包含RNA和m2 7,3`OG(5’)ppp(5’)m2’-OApG：
Figure BDA0003779759780000352
下面是另一个示例性的帽1RNA(无帽类似物)：
Figure BDA0003779759780000361
在一些实施方案中，用“帽0”结构修饰RNA，所述“帽0”结构在一个实施方案中使用了具有以下结构的帽类似物反逆转帽(ARCA帽(m2 7,3`OG(5’)ppp(5’)G))：
Figure BDA0003779759780000362
下面是包含RNA和m2 7,3`OG(5’)ppp(5’)G的一个示例性帽0RNA：
Figure BDA0003779759780000363
在一些实施方案中，使用具有以下结构的帽类似物β-S-ARCA(m2 7,2`OG(5’)ppSp(5’)G)产生“帽0”结构：
Figure BDA0003779759780000371
下面是包含β-S-ARCA(m2 7,2`OG(5’)ppSp(5’)G)和RNA的一个示例性帽0RNA：
Figure BDA0003779759780000372
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含5’-UTR和/或3’-UTR。术语“非翻译区”或”UTR”涉及DNA分子中被转录但不被翻译成氨基酸序列的区域，或涉及RNA分子(例如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可存在于开放阅读框的5’(上游)(5’-UTR)和/或开放阅读框的3’(下游)(3’-UTR)。5’-UTR(如果存在的话)位于5’端，在蛋白质编码区的起始密码子的上游。5’-UTR位于5’-帽(如果存在的话)的下游，例如直接与5’帽相邻。3’-UTR(如果存在的话)位于3’端，在蛋白质编码区的终止密码子的下游，但是术语“3’-UTR”优选不包含poly(A)序列。因此，3’-UTR位于poly(A)序列(如果存在的话)的上游，例如直接与poly(A)序列相邻。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含3’-poly(A)序列。本文中使用的术语“poly(A)序列”或“poly-A尾”是指腺苷酸残基的不间断或间断的序列，其通常位于RNA分子的3’端。poly(A)序列为本领域技术人员已知的，并且可在本文中所述RNA中紧接3’UTR。poly(A)序列可以是任意长度。在一些实施方案中，poly(A)序列包含以下或由以下组成：至少20、至少30、至少40、至少80或至少100且至多500、至多400、至多300、至多200或至多150个核苷酸，特别是约110个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列仅由A核苷酸组成。在一些实施方案中，poly(A)序列基本上由A核苷酸组成，但被四种核苷酸(A、C、G和U)的随机序列间断，如通过引用在此并入的WO 2016/005324 A1中所公开的。这样的随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。存在于DNA编码链中基本上由dA核苷酸组成但被具有平均分布的四种核苷酸(dA、dC、dG、dT)且具有例如5至50个核苷酸的长度的随机序列间断的poly(A)盒在DNA水平上显示出质粒DNA在大肠杆菌(E.coli)中的不断增殖，并且在RNA水平上仍然与关于支持RNA稳定性和翻译效率的有益特性相关。在一些实施方案中，除A核苷酸之外，poly(A)序列在其3’端没有侧接其他核苷酸，即poly(A)序列在其3’端不被除A之外的核苷酸掩蔽或紧接。
在本公开内容的上下文中，术语“转录”涉及其中DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，RNA可被翻译成肽或蛋白质。
“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列用作模板在生物过程中合成其他聚合物和大分子的固有特性，所述其他聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列和由其产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA转录模板的非编码链二者均可称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其他产物。类似地，如果RNA(例如mRNA)的翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该RNA编码蛋白质。
本文中使用的“内源性”是指来自或产生于生物体、细胞、组织或系统内部的任何物质。
本文中使用的术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。
本文中使用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
本文中使用的术语“连接的”、“融合的”或“融合/融合体”可互换使用。这些术语是指将两个或更多个要素或组分或结构域连接在一起。
抗原
术语“抗原”涉及包含免疫应答或免疫效应分子如抗体所针对的和/或将要针对的表位的试剂。特别地，术语“抗原”包括蛋白质和肽。在一个实施方案中，抗原为疾病相关抗原，例如肿瘤抗原。
术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原，其优选包含将刺激宿主的免疫系统以产生针对疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答的表位。疾病相关抗原、其表位或靶向疾病相关抗原或表位的试剂(例如诱导免疫应答的肽或蛋白质)因此可用于治疗目的，特别是用于疫苗接种。疾病相关抗原可与微生物感染相关(通常是微生物抗原)或者与癌症(通常是肿瘤)相关。
术语“肿瘤抗原”是指癌细胞的成分，其可来源于细胞质、细胞表面和细胞核。特别地，它是指在细胞内产生或在肿瘤细胞上作为表面抗原产生的那些抗原。肿瘤抗原通常优先地由癌细胞表达(例如，与非癌细胞相比，在癌细胞中其以更高的水平表达)，并且在一些情况下，其仅由癌细胞表达。肿瘤抗原的一些实例包括但不限于：p53，ART-4，BAGE，β-联蛋白/m，Bcr-abL CAMEL，CAP-1，CASP-8，CDC27/m，CDK4/m，CEA，密蛋白家族的细胞表面蛋白例如密蛋白-6、密蛋白-18.2和密蛋白-12，c-MYC，CT，Cyp-B，DAM，ELF2M，ETV6-AML1，G250，GAGE，GnT-V，Gap 100，HAGE，HER-2/neu，HPV-E7，HPV-E6，HAST-2，hTERT(或hTRT)，LAGE，LDLR/FUT，MAGE-A，优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12，MAGE-B，MAGE-C，MART-1/Melan-A，MC1R，肌球蛋白/m，MUC1，MUM-1，MUM-2，MUM-3，NA88-A，NF1，NY-ESO-1，NY-BR-1，pl90小BCR-abL，Pml/RARa，PRAME，蛋白酶3，PSA，PSM，RAGE，RU1或RU2，SAGE，SART-1或SART-3，SCGB3A2，SCP1，SCP2，SCP3，SSX，存活蛋白，TEL/AML1，TPI/m，TRP-1，TRP-2，TRP-2/INT2，TPTE，WT和WT-1。
如本文中所用，“肿瘤抗原”或“癌抗原”包括(i)肿瘤特异性抗原，(ii)肿瘤相关抗原，(iii)肿瘤上的胚胎抗原，(iv)肿瘤特异性膜抗原，(v)肿瘤相关膜抗原，(vi)生长因子受体，和(xi)与癌症相关的任何其他类型的抗原或物质。
任何肿瘤抗原(优选由肿瘤细胞表达)都可通过本文中公开的疫苗接种来靶向。在一个实施方案中，肿瘤抗原由肿瘤细胞呈递，并因此可被T细胞靶向。如本文中所公开的疫苗接种优选地活化对MHC呈递的肿瘤抗原具有特异性的T细胞。肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigen，TSA)或肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)。TSA是肿瘤细胞独有的，并且不在体内的其他细胞上出现。TAA不是肿瘤细胞独有的，并且相反地在无法诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在使得免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。TAA可以是在胚胎发育期间在正常细胞上表达的抗原，此时免疫系统是未成熟的并且不能作出应答，或者TAA可以是通常以极低水平存在于正常细胞上但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。
术语“病毒抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何病毒组分。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。
术语“细菌抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何细菌组分。细菌抗原可来源于细菌的细胞壁或细胞质膜。
术语“在细胞表面上表达”、“与细胞表面相关”或类似术语意指例如抗原的分子与细胞质膜相关并位于细胞质膜上，其中该分子的至少一部分朝向所述细胞的胞外空间并且可从所述细胞的外部接近，例如，通过位于细胞外的抗体。在该背景下，部分为优选至少4个、优选至少8个、优选至少12个、更优选至少20个氨基酸。该相关可以是直接的或间接的。例如，该相关可以是通过一个或更多个跨膜结构域的、一个或更多个脂质锚的，或者是通过与可在细胞质膜外小叶上发现的任何其他蛋白质、脂质、糖类或其他结构的相互作用的。例如，与细胞表面相关的分子可以是具有胞外部分的跨膜蛋白，或者可以是通过与另一种是跨膜蛋白的蛋白质相互作用而与细胞表面相关的蛋白质。
“细胞表面”或“细胞的表面”根据其在本领域中的通常含义使用，并因此包括可由蛋白质和其他分子结合的细胞外部。
在本发明的上下文中，术语“胞外部分”或“外结构域”是指朝向细胞的胞外空间并且优选地从所述细胞的外部接近(例如通过位于细胞外部的结合分子，例如抗体)的分子(例如，蛋白质)部分。优选地，该术语是指一个或更多个胞外环或结构域或者其片段。
术语“表位”是指分子中的抗原决定簇，即分子(例如抗原)中被免疫系统识别的部分或片段。例如，表位可以被T细胞、B细胞或抗体识别。抗原的表位可包含抗原的连续或不连续部分，并且长度可为约5至约100，例如约5至约50，更优选约8至约30，最优选约10至约25个氨基酸，例如，表位的长度可优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一个实施方案中，表位的长度为约10至约25个氨基酸。术语“表位”包括B细胞表位和T细胞表位。
术语“T细胞表位”是指蛋白质中当在MHC分子的情况下呈递时被T细胞识别的部分或片段。术语“主要组织相容性复合体”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合体。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的，其中MHC蛋白或分子结合肽表位并呈递它们以被T细胞上的T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并将自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，侵入的微生物的片段)二者展示给T细胞。在MHC I类/肽复合体的情况下，结合肽通常长约8至约10个氨基酸，但是更长或更短的肽也可以是有效的。在MHC II类/肽复合体的情况下，结合肽通常长约10至约25个氨基酸，并且特别地长约13至约18个氨基酸，然而更长和更短的肽也可以是有效的。
根据本公开内容适用的肽和蛋白质抗原通常包括包含用于诱导免疫应答的表位的肽或蛋白质。肽或蛋白质或表位可以来源于靶抗原，即针对其待引发免疫应答的抗原。例如，肽或蛋白质抗原或包含在肽或蛋白质抗原内的表位可以是靶抗原或靶抗原的片段或变体。
以本身或以编码肽或蛋白质抗原的RNA形式施用的肽或蛋白质抗原，即疫苗抗原，优选在治疗对象中导致T细胞的刺激、引发和/或扩增。所述刺激、引发和/或扩增的T细胞优选针对靶抗原，特别是由病变细胞、组织和/或器官表达的靶抗原，即疾病相关抗原。因此，疫苗抗原可包含疾病相关抗原或其片段或变体。在一个实施方案中，这样的片段或变体与疾病相关抗原免疫学上等同。在本公开内容的上下文中，术语“抗原的片段”或“抗原的变体”意指导致T细胞的刺激、引发和/或扩增的物质，该刺激、引发和/或扩增的T细胞靶向抗原，即疾病相关抗原，特别是当由病变细胞、组织和/或器官呈递时。因此，疫苗抗原可对应于或可包含疾病相关抗原，可对应于或可包含疾病相关抗原的片段，或者可对应于或可包含与疾病相关抗原或其片段同源的抗原。如果疫苗抗原包含疾病相关抗原的片段或与疾病相关抗原的片段同源的氨基酸序列，则所述片段或氨基酸序列可包含疾病相关抗原的表位(例如T细胞表位)或与疾病相关抗原的表位(例如T细胞表位)同源的序列。因此，根据本公开内容，疫苗抗原可包含疾病相关抗原的免疫原性片段或与疾病相关抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。根据本公开内容的“抗原的免疫原性片段”优选地涉及当在MHC分子的环境中呈递时能够刺激、引发和/或扩增T细胞的抗原片段。优选的是，疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)可由细胞例如抗原呈递细胞呈递，以提供相关表位用于通过T细胞结合。疫苗抗原可以是重组抗原。
术语“免疫学上等同的”意指例如关于免疫效应类型表现出相同或基本上相同的免疫学特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学效应的免疫学上等同的分子，例如免疫学上等同的氨基酸序列。在本公开内容的上下文中，术语“免疫学上等同的”优选地关于抗原或抗原变体用于免疫接种的免疫学效应或特性使用。例如，如果氨基酸序列在暴露于对象的免疫系统(例如与参考氨基酸序列结合的T细胞或表达该参考氨基酸序列的细胞)时诱导具有与参考氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，则所述氨基酸序列与该参考氨基酸序列在免疫学上等同。因此，在免疫学上等同于抗原的分子在T细胞的刺激、引发和/或扩增方面表现出与T细胞所靶向的抗原相同或基本上相同的特性和/或发挥相同或基本上相同的作用。
术语“引发”是指其中T细胞首次与其特异性抗原接触并导致分化成效应T细胞的过程。
术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体扩增的过程。在本公开内容的上下文中，该术语优选在免疫应答的情况下使用，在所述免疫应答中淋巴细胞被抗原刺激，增殖，并且扩增识别所述抗原的特异性淋巴细胞。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞分化。
在一个实施方案中，靶抗原是肿瘤抗原，并且包含表位的肽或蛋白质或其片段(例如，表位)来源于肿瘤抗原。肿瘤抗原可以是“标准”抗原，通常已知其在多种癌症中表达。肿瘤抗原也可以是“新抗原”，其对个体的肿瘤具有特异性，并且先前未被免疫系统识别。新抗原或新表位可以是由癌细胞基因组中导致氨基酸变化的一种或更多种癌症特异性突变导致的。如果肿瘤抗原是新抗原，则包含表位的肽或蛋白质优选地包含含有一个或更多个氨基酸变化的所述新抗原的表位或片段。
癌症突变因个体而异。因此，编码新型表位(新表位)的癌症突变在疫苗组合物和免疫治疗的开发中代表有吸引力的靶标。肿瘤免疫治疗的效力取决于能够在宿主内诱导强效免疫应答的癌症特异性抗原和表位的选择。RNA可用于将患者特异性肿瘤表位递送至患者。存在于脾中的树突细胞(DC)代表对免疫原性表位或抗原(例如肿瘤表位)的RNA表达特别感兴趣的抗原呈递细胞。已显示，多表位的使用促进肿瘤疫苗组合物中的治疗效力。肿瘤突变组的快速测序可为个体化疫苗提供多个表位，其可由本文中所述的RNA编码，例如作为单一多肽，在其中表位任选地被接头分开。在本公开内容的某些实施方案中，RNA编码至少一个表位、至少两个表位、至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位或至少十个表位。一些示例性的实施方案包括编码至少五个表位(称为“五表位(pentatope)”)的RNA和编码至少十个表位(称为“十表位(decatope)”)的RNA。
肽和蛋白质抗原的长度可以为2至100个氨基酸，包括例如至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸、至少30个氨基酸、至少35个氨基酸、至少40个氨基酸、至少45个氨基酸或至少50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可大于50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可大于100个氨基酸。
肽或蛋白质抗原可以是可诱导或提高免疫系统产生针对靶抗原(例如，疾病相关抗原)的抗体和T细胞应答的能力的任何肽或蛋白质。
结合剂
术语“免疫球蛋白”是指一类结构相关的糖蛋白，其由两对多肽链(一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链)组成，所有四条链通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已被良好地表征。参见例如Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))。简而言之，每条重链通常由重链可变区(本文中缩写为VH或VH)和重链恒定区(本文中缩写为CH或CH)构成。重链恒定区通常由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。铰链区是重链CH1和CH2结构域之间的区域，并且具有高度柔性。铰链区中的二硫键是IgG分子中两条重链之间相互作用的一部分。每条轻链通常由轻链可变区(本文中缩写为VL或VL)和轻链恒定区(本文中缩写为CL或CL)构成。轻链恒定区通常由一个结构域CL构成。VH和VL区可进一步细分为高变的区(或高变区，其可以是序列高变的和/或形成结构上限定的环)，也称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，散布有更保守的区，称为框架区(framework region，FR)。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(还参见Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196,901-917(1987))。除非另有说明或与上下文相矛盾，否则本文中的CDR序列是根据IMGT规则使用DomainGapAlign来鉴定的(Lefranc MP.,Nucleic AcidsResearch1999；27:209-212和Ehrenmann F.,Kaas Q.and Lefranc M.-P.Nucleic AcidsRes.,38,D301-307(2010)；另见互联网http地址www.imgt.org/。除非另有说明或与上下文相矛盾，否则本发明中对恒定区中氨基酸位置的引用是根据EU编号进行的(Edelman etal.,Proc Natl Acad Sci U S A.1969May；63(1):78-85；Kabat et al.,Sequences ofProteins of Immunological Interest,Fifth Edition.1991NIH Publication No.91-3242)。例如，本文中的SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18示出了IgG1重链恒定区的根据EU编号的氨基酸位置118至447。
如本文中所用，术语“对应于……的位置的氨基酸”是指人IgG1重链中的氨基酸位置编号。通过与人IgG1比对，可发现其他免疫球蛋白中相应的氨基酸位置。因此，一个序列中“对应于”另一序列中的氨基酸或片段的氨基酸或片段是使用标准序列比对程序与另一氨基酸或片段比对(例如通常默认设置的ALIGN、ClustalW或类似程序)，并且与人IgG1重链具有至少50％、至少80％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸或片段。如何比对序列或序列中的片段并由此确定序列中对应于根据本发明的氨基酸位置的位置与在本领域中被认为是公知的。
本发明上下文中的术语“结合剂”是指能够与期望抗原结合的任何试剂。在本发明的某些实施方案中，结合剂是抗体、抗体片段或其构建体。结合剂还可包含合成的、经修饰的或非天然存在的部分，特别是非肽部分。这样的部分可例如连接所期望的抗原结合官能团或区域，例如抗体或抗体片段。在一个实施方案中，结合剂是包含抗原结合CDR或可变区的合成构建体。
本发明上下文中的术语“抗体”(Ab)是指具有结合、优选与抗原特异性结合的能力的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一者的衍生物。在一个实施方案中，结合发生在典型的生理条件下，其具有相当长时间段的半衰期，例如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约一小时、至少约两小时、至少约四小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更多、约48小时或更多、约3、4、5、6、7或更多天等，或任何其他相关的功能限定的时间段(例如足以诱导、促进、增强和/或调节与抗体与抗原结合相关的生理应答的时间和/或足以使抗体募集效应活性的时间)。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合区。如本文中所用，术语“抗原结合区”是指与抗原相互作用的区域并且通常包含VH区和VL区。当用于本文中时，术语抗体不仅包括单特异性抗体，还包括多特异性抗体，其包含多个，例如两个或更多个，例如三个或更多个不同的抗原结合区。抗体(Ab)的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和补体系统的成分，例如C1q，其是补体活化经典途径中的第一组分。如上所述，除非另有说明或与上下文明显矛盾，本文中所用的术语抗体包括作为抗原结合片段(即保留抗原特异性结合的能力)的抗体片段和抗体衍生物，即，来源于抗体的构建体。已表明，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。涵盖在术语“抗体”内的抗原结合片段的实例包括(i)Fab’或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，或如WO2007059782(Genmab)中所述的单价抗体；(ii)F(ab’)2片段，包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)基本上由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward et al.,Nature 341,544-546(1989))，其基本上由VH结构域组成并且也称为结构域抗体(Holt et al；TrendsBiotechnol.2003Nov；21(11):484-90)；(vi)骆驼或纳米抗体分子(Revets et al；ExpertOpin Biol Ther.2005Jan；5(1):111-24)和(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头连接起来，使得它们能够成为单蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(single chain Fv，scFv)，参见例如Bird et al.,Science 242,423-426(1988)andHuston et al.,PNAS USA 85,5879-5883(1988))。除非另有说明或上下文明确指出，否则这样的单链抗体涵盖在术语抗体之内。尽管这样的片段通常被包括在抗体的含义之内，但是它们共同且各自独立地是本发明的独特特征，表现出不同的生物学特性和效用。在本发明情况下的这些和其他可用的抗体片段以及这样的片段的双特异性形式在本文中进一步讨论。还应理解，除非另有指明，否则术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、抗体样多肽，例如嵌合抗体和人源化抗体，以及通过任意已知技术(例如酶切割、肽合成和重组技术)提供的保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段(抗原结合片段)。
如此产生的抗体可具有任意同种型。如本文中所用，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。当本文中提及特定同种型例如IgG1时，该术语不限于特定同种型序列例如特定IgG1序列，而是用于指示抗体在序列上更接近该同种型例如IgG1而不是其他同种型。因此，例如本发明的IgG1抗体可以是天然存在的IgG1抗体的序列变体，包括恒定区中的变体。
如本文中所用，术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示出针对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人单克隆抗体可由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与永生化细胞融合的从转基因或转染色体非人动物例如转基因小鼠获得的B细胞，其基因组包含人重链转基因和轻链转基因。
本发明上下文中的术语“双特异性抗体”或“bs”是指具有由不同抗体序列限定的两个不同抗原结合区的抗体。在一些实施方案中，所述不同的抗原结合区结合相同抗原上的不同表位。然而，在一些优选的实施方案中，所述不同的抗原结合区结合不同的靶抗原。双特异性抗体可以是任何形式，包括下文中所述的任何双特异性抗体形式。
当在本文中使用时，除非与上下文相矛盾，否则术语“Fab臂”或“臂”包括一个重链-轻链对并且在本文中与“半分子”可互换使用。
当双特异性抗体被描述为包含“来源于”第一抗体的半分子抗体和“来源于”第二抗体的半分子抗体时，术语“来源于”表示双特异性抗体是通过任何已知的方法通过将来自所述第一抗体和第二抗体中的每一个的所述半分子重组为所得双特异性抗体来产生的。在该上下文中，“重组”不旨在受任何特定重组方法的限制，并因此包括下文中所述的用于产生双特异性抗体的所有方法，包括例如通过半分子交换进行重组，以及在核酸水平上和/或通过两个半分子在同一细胞中的共表达进行重组。
在本发明的上下文中，术语“单价抗体”意指抗体分子能够结合单个抗原分子，并因此不能够交联抗原或细胞。
当在抗体的上下文中使用时，术语“全长”表示抗体不是片段，而是包含特定同种型的通常在自然界中发现的该同种型的所有结构域，例如IgG1抗体的VH、CH1、CH2、CH3、铰链、VL和CL结构域。
当在本文中使用时，除非与上下文相矛盾，否则术语“Fc区”是指由免疫球蛋白重链的两个Fc序列组成的抗体区，其中所述Fc序列包含至少铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
当在本文中使用时，术语“第一CH3区与第二CH3区之间的异二聚体相互作用”是指在第一CH3/第二CH3异二聚体蛋白中的第一CH3区与第二CH3区之间的相互作用。
当在本文中使用时，术语“第一CH3区与第二CH3区的同二聚体相互作用”是指在第一CH3/第一CH3同二聚体蛋白中的第一CH3区与另一个第一CH3区之间的相互作用以及在第二CH3/第二CH3同二聚体蛋白中的第二CH3区与另一个第二CH3区之间的相互作用。
如本文中所用，在抗体与预定抗原或表位结合的上下文中的术语“结合”或“能够结合”通常是当使用生物层干涉术(Bio-Layer Interferometry，BLI)确定时，或者例如当使用表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)技术在BIAcore 3000仪器中使用抗原作为配体和抗体作为分析物确定时，以对应于约10-7M或更小的KD的亲和力的结合，例如约10-8M或更小，例如约10-9M或更小，约10-10M或更小，或约10-11M或甚至更小。抗体以对应于以下KD的亲和力与预定抗原结合：比其与除预定抗原或紧密相关抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力低至少十倍，例如低至少100倍，例如低至少1,000倍，例如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍。亲和力低的量取决于抗体的KD，所以当抗体的KD非常低(即抗体高度特异)时，对抗原的亲和力低于对非特异性抗原的亲和力的程度可以是至少10,000倍。
如本文中所用，术语“kd”(秒-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称为koff值。
如本文中所用，术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
在一个优选的实施方案中，本文中所述的抗体是分离的。如本文中所用，“分离的抗体”旨在是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。在一个优选的实施方案中，与PD-L1和CD137特异性结合的分离的双特异性抗体基本上不含与PD-L1或CD137特异性结合的单特异性抗体。
当在本文中使用时，术语“PD-L1”是指程序性死亡配体1蛋白。PD-L1存在于人和其他物种中，并且因此，除非与上下文相矛盾，术语“PD-L1”不限于人PD-L1。人、猕猴、非洲象、野猪和小鼠的PD-L1序列可通过分别为NP_054862.1、XP_005581836、XP_003413533、XP_005665023和NP_068693的Genbank登录号找到。人PD-L1的序列也在SEQ ID NO:21中示出，其中1至18位氨基酸被预测为信号肽。
当在本文中使用时，术语“PD-L2”是指人程序性死亡1-配体2蛋白(Genbank登录号NP_079515)。
当在本文中使用时，术语“PD-1”优选是指人程序性死亡-1蛋白，也称为CD279。
如本文中所用，术语“CD137”是指分化簇137蛋白，优选人CD137。CD137(4-1BB)，也称为TNFRSF9，是配体TNFSF9/4-1BBL的受体。认为CD137与T细胞活化有关。在一个实施方案中，CD137是人CD137，其具有UniProt登录号Q07011。人CD137的序列也在SEQ ID NO:22中示出，其中1至23位氨基酸被预测为信号肽。
“PD-L1抗体”或“抗PD-L1抗体”是如上所述的抗体，其与抗原PD-L1特别是人PD-L1特异性结合。
“CD137抗体”或“抗CD137抗体”是如上所述的抗体，其与抗原CD137特异性结合。
“CD137xPD-L1抗体”、“抗CD137xPD-L1抗体”、“PD-L1xCD137抗体”或“抗PD-L1xCD137抗体”是双特异性抗体，其包含两个不同的抗原结合区，其中一个与抗原PD-L1特异性结合，并且其中一个与CD137特异性结合。
本发明还设想包含本文中所述抗体的VL区、VH区或者一个或更多个CDR的功能变体的抗体。在抗体的上下文中使用的VL、VH或CDR的功能变体仍然允许抗体保留至少相当大比例(至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的“参考”或“亲本”抗体的亲和力和/或特异性/选择性，并且在一些情况下，这样的抗体可与比亲本抗体更高的亲和力、选择性和/或特异性相关。
这样的功能变体通常保留与亲本抗体的显著序列同一性。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数(即，同源性％＝相同位置的数量/位置的总数量×100)，考虑到空位的数量和每个空位的长度，空位需要引入以实现两个序列的最佳比对。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比可例如使用已并入到ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers and W.Miller,Comput.Appl.Biosci 4,11-17(1988)的算法，使用PAM120加权残基表(weight residue table)、为12的空位长度罚分以及为4的空位罚分来确定。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可使用Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48,444-453(1970)算法来确定。
示例性变体包括主要通过保守替换而与亲本抗体序列的VH和/或VL和/或CDR区不同的变体；例如，变体中的10个，例如9、8、7、6、5、4、3、2或1个替换是保守氨基酸残基替代。
本文中所述抗体序列(例如VL区或VH区)或与本文中所述抗体序列(例如VL区或VH区)具有一定程度同源性或同一性的抗体序列的功能变体优选在非CDR序列中包含修饰或变异，而CDR序列优选保持不变。
在本发明的上下文中，除非另有说明，否则以下符号用于描述突变：i)在给定位置的氨基酸替换被写为例如K409R，这意指在蛋白质第409位用精氨酸替换赖氨酸；和ii)对于特定变体，使用特定的三字母代码或单字母代码，包括代码Xaa和X以表示任何氨基酸残基。因此，在第409位用精氨酸替换赖氨酸被指定为：K409R，而在第409位用任何氨基酸残基替换赖氨酸被指定为K409X。在第409位赖氨酸缺失的情况下，用K409*表示。
在本发明的上下文中，“抑制PD-L1与PD-1结合”是指在存在能够结合PD-L1的抗体的情况下，PD-L1与PD-1的结合的任何可检测显著降低。通常，抑制意指由抗PD-L1抗体的存在引起的PD-L1与PD-1之间的结合降低至少约10％，例如至少约15％，例如至少约20％，例如至少40％。PD-L1与PD-1结合的抑制可通过任何合适的技术来确定。
除非与上下文相矛盾，否则本文中使用的术语“特异性”旨在具有以下含义。如果两种抗体与相同的抗原和相同的表位结合，则它们具有“相同的特异性”。
本文中使用的术语“嵌合抗体”是指其中可变区来源于非人物种(例如，来源于啮齿动物)并且恒定区来源于不同物种例如人的抗体。开发用于治疗应用的嵌合单克隆抗体以降低抗体的免疫原性。在嵌合抗体的情况下使用的术语“可变区”或“可变结构域”是指包含免疫球蛋白的重链和轻链二者的CDR和框架区的区域。嵌合抗体可通过使用Sambrook etal.,1989,Molecular Cloning:A laboratory Manual,New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,Ch.15所述的标准DNA技术产生。嵌合抗体可以是经遗传改造或经酶改造的重组抗体。产生嵌合抗体在技术人员的知识范围内，并因此，根据本发明的嵌合抗体的产生可通过除本文中所述之外的其他方法来进行。
本文中使用的术语“人源化抗体”是指遗传改造的非人抗体，其包含人抗体恒定结构域和被修饰以与人可变结构域具有高水平序列同源性的非人可变结构域。这可通过将一起形成抗原结合位点的六个非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源人接纳体框架区(FR)上来实现(参见WO92/22653和EP0629240)。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可需要将来自亲本抗体(即非人抗体)的框架残基替换为人框架区(回复突变)。结构同源性建模可帮助鉴定框架区中对于抗体的结合特性重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可包含非人CDR序列、任选地包含针对非人氨基酸序列的一个或更多个氨基酸回复突变的主要人框架区，以及完全人恒定区。任选地，可应用不一定是回复突变的另外的氨基酸修饰以获得具有优选特征例如亲和力和生物化学特性的人源化抗体。
如本文中所用，术语“人抗体”是指具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文中所用，术语“人抗体”不旨在包括其中来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠或大鼠)种系的CDR序列已接枝到人框架序列上的抗体。人单克隆抗体可通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体法，例如，Kohler and Milstein,Nature 256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。尽管原则上优选体细胞杂交方案，但是也可采用其他用于产生单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌转化或使用人抗体基因的文库的噬菌体展示技术。用于制备分泌人单克隆抗体的杂交瘤的合适动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是已经非常成熟的方案。分离用于融合的经免疫接种脾细胞的免疫接种方案和技术是本领域中已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方案也是已知的。因此，人单克隆抗体可例如使用携带部分人免疫系统而不是小鼠或大鼠系统的转基因或转染色体小鼠或大鼠产生。因此，在一个实施方案中，人抗体从携带人种系免疫球蛋白序列而不是动物免疫球蛋白序列的转基因动物例如小鼠或大鼠中获得。在这样的实施方案中，抗体源自引入动物中的人种系免疫球蛋白序列，但最终抗体序列是所述人种系免疫球蛋白序列通过内源性动物抗体机制的体细胞超突变和亲和力成熟进一步修饰的结果，参见例如Mendez et al.1997Nat Genet.15(2):146-56。
术语“还原条件”或“还原环境”是指底物，这里是抗体铰链区中的半胱氨酸残基，更可能被还原而不是被氧化的条件或环境。
如本文中所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在是指已引入表达载体(例如编码本发明抗体的表达载体)的细胞。重组宿主细胞包括例如转染瘤，例如CHO、CHO-S、HEK、HEK293、HEK-293F、Expi293F、PER.C6或NS0细胞，以及淋巴细胞。
术语“抗独特型抗体”是指识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定簇的抗体。
术语“竞争”是指在第一抗体和第二抗体之间针对相同抗原的竞争。或者，“竞争”也可以是指抗体与内源性配体之间竞争与内源性配体的相应受体的结合。如果抗体阻止内源性配体与其受体结合，则称这样的抗体阻断配体与其受体的内源性相互作用，并因此与内源性配体竞争。如何测试抗体与靶抗原的结合的竞争的本领域技术人员公知的。这样的方法的一个实例是所谓的交叉竞争测定，其可例如作为ELISA或通过流式细胞术进行。或者，可使用生物层干涉术来确定竞争。
竞争与靶抗原结合结合的抗体可结合抗原上的不同表位，其中表位彼此如此接近以至于与一个表位结合的第一抗体阻止了第二抗体与另一个表位的结合。然而，在另一些情况下，两种不同的抗体可结合抗原上的相同表位，并且会在竞争结合测定中竞争结合。这样的结合相同表位的抗体在本文中被认为具有相同的特异性。因此，在一个实施方案中，认为与相同表位结合的抗体与靶分子上的相同氨基酸结合。可通过本领域技术人员已知的标准丙氨酸扫描实验或抗体-抗原结晶实验来确定抗体与靶抗原上的相同表位结合。
如上所述，本领域已经描述了多种形式的抗体。本发明的结合剂原则上可以是任何同种型的抗体。同种型的选择通常通过期望的Fc介导的效应功能来指导，例如ADCC诱导，或对缺乏Fc介导的效应功能的抗体(“惰性”抗体)的要求。示例性同种型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可使用人轻链恒定区，κ或λ中任一者。本发明的抗体的效应功能可通过同种型转换为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体而改变以用于多种治疗用途。在一个实施方案中，本发明抗体的两条重链都是IgG1同种型，例如IgG1，κ。任选地，重链可在铰链区和/或CH3区进行修饰，如本文中别处所述。
优选地，每个抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并且其中所述可变区各自包含三个CDR序列，分别为CDR1、CDR2和CDR3，以及四个框架序列，分别为FR1、FR2、FR3和FR4。此外，优选地，抗体包含两个重链恒定区(CH)和两个轻链恒定区(CL)。
在本发明的一个实施方案中，结合剂是全长抗体，例如全长IgG1抗体。在另一个实施方案中，抗体是全长IgG4抗体，优选具有稳定铰链区的全长IgG4抗体。本领域已经描述了稳定IgG4铰链区的修饰，例如核心铰链中的S228P突变，参见例如Labrijn et al.,2009NatBiotechnol.27(8):767-71。
在本发明的另一些实施方案中，本发明的结合剂包含抗体片段，例如Fab’或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，如WO2007059782(Genmab)中所述的单价抗体，F(ab’)2片段，Fd片段，Fv片段，dAb片段，骆驼或纳米抗体，或者分离的互补决定区(CDR)。
本发明的结合剂优选是人的、人源化的或嵌合抗体。在其中抗体是双特异性抗体的实施方案中，两个半分子可以是人的、人源化的或嵌合的，或者半分子的特征可在序列来源方面不同。
例如，在一个实施方案中，结合剂，例如双特异性抗体，包含两个半分子，每个半分子包含抗原结合区。优选地，包含能够与人PD-L1结合的抗原结合区的半分子是人的，并且包含能够与人CD137结合的抗原结合区的半分子是人源化的。
双特异性抗体的许多不同形式和用途是本领域已知的，并由Kontermann；DrugDiscov Today,2015Jul；20(7):838-47和MAbs,2012Mar-Apr；4(2):182-97进行了综述。
根据本发明的双特异性抗体不限于任何特定的双特异性形式或产生其的方法。
可用于本发明的双特异性抗体分子的实例包括(i)具有包含不同抗原结合区的两个臂的单抗体；(ii)对两个不同表位具有特异性的单链抗体，例如通过由额外肽接头串联连接的两个scFv；(iii)双可变结构域抗体(dual-variable-domain antibody，DVD-Ig)，其中每条轻链和重链包含通过短肽键串联的两个可变结构域(Wu et al.,Generation andCharacterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-IgTM)Molecule,In:Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg(2010))；(iv)化学连接的双特异性(Fab’)2片段；(v)Tandab，其是两个单链双抗体的融合，产生对每种靶抗原均具有两个结合位点的四价双特异性抗体；(vi)柔性抗体(flexibody)，其是scFv与双抗体的组合，产生多价分子；(vii)基于蛋白激酶A中的“二聚化和对接结构域”的所谓的“对接与锁定(dockand lock)”分子，当将其应用于Fab时，可产生由与不同Fab片段连接的两个相同Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(viii)所谓的蝎形分子(Scorpion molecule)，其包含例如与人Fab臂的两个末端融合的两个scFv；以及(ix)双抗体。
在本发明的一个实施方案中，本发明的结合剂是双抗体或交叉抗体(cross-body)。在一个实施方案中，本发明的结合剂是通过受控的Fab臂交换获得的双特异性抗体(例如在WO2011131746(Genmab)中所述)。
不同类别的根据本发明的结合剂的实例包括但不限于(i)具有互补CH3结构域以迫使异二聚化的IgG样分子；(ii)重组IgG样双靶向分子，其中所述分子的两侧各自包含至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的一部分；(iii)IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的一部分融合；(iv)Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定的双抗体与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；(v)Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起，与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合；以及(vi)基于ScFv和双抗体的抗体和重链抗体(例如，结构域抗体、纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双抗体或不同的重链抗体(例如，结构域抗体、纳米抗体)彼此融合或者与与重链恒定结构域、Fc区或其部分融合的另一种蛋白质或载体分子融合。
具有互补CH3结构域分子的IgG样分子的实例包括但不限于Triomab/Quadroma分子(Trion Pharma/Fresenius Biotech；Roche,WO2011069104)，所谓的结进孔(Knobs-into-Holes)分子(Genentech,WO9850431)，CrossMAb(Roche,WO2011117329)和静电匹配分子(Amgen,EP1870459和WO2009089004；Chugai,US201000155133；Oncomed,WO2010129304)、LUZ-Y分子(Genentech,Wranik et al.J.Biol.Chem.2012,287(52):43331-9,doi:10.1074/jbc.M112.397869.Epub 2012Nov 1)、DIG体和PIG体分子(Pharmabcine,WO2010134666,WO2014081202)、链交换工程化结构域体(Strand Exchange EngineeredDomain body，SEEDbody)分子(EMD Serono,WO2007110205)、Biclonics分子(Merus,WO2013157953)、FcΔAdp分子(Regeneron,WO201015792)、双特异性IgG1和IgG2分子(Pfizer/Rinat,WO11143545)、Azymetric支架分子(Zymeworks/Merck,WO2012058768)分子、mAb-Fv分子(Xencor,WO2011028952)、二价双特异性抗体(WO2009080254)和
Figure BDA0003779759780000541
分子(Genmab,WO2011131746)。
重组IgG样双靶向分子的实例包括但不限于双靶向(Dual Targeting，DT)-Ig分子(WO2009058383)、二合一抗体(Two-in-one Antibody)(Genentech；Bostrom,et al2009.Science 323,1610–1614.)、交联Mab(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star,WO2008003116)、Zybody分子(Zyngenia；LaFleur et al.MAbs.2013Mar-Apr；5(2):208-18)、使用共同轻链的方法(Crucell/Merus,US7,262,028)，κλBody(NovImmune,WO2012023053)和CovX-body(CovX/Pfizer；Doppalapudi,V.R.,et al2007.Bioorg.Med.Chem.Lett.17,501–506.)。
IgG融合分子的实例包括但不限于双可变结构域(Dual Variable Domain，DVD)-Ig分子(Abbott,US7,612,181)、双结构域双头抗体(Unilever；Sanofi Aventis,WO20100226923)、IgG样双特异性分子(ImClone/Eli Lilly,Lewis et al.NatBiotechnol.2014Feb；32(2):191-8)、Ts2Ab(MedImmune/AZ；Dimasi et al.J MolBiol.2009Oct 30；393(3):672-92)和BsAb分子(Zymogenetics,WO2010111625)、HERCULES分子(Biogen Idec,US007951918)、scFv融合分子(Novartis)、scFv融合分子(ChangzhouAdam Biotech Inc,CN 102250246)和TvAb分子(Roche,WO2012025525,WO2012025530)。
Fc融合分子的实例包括但不限于ScFv/Fc融合体(Pearce et al.,Biochem MolBiol Int.1997Sep；42(6):1179-88)、SCORPION分子(Emergent BioSolutions/Trubion,Blankenship JW,et al.AACR 100th Annual meeting2009(摘要#5465)；Zymogenetics/BMS,WO2010111625)；双亲和力再靶向技术(Dual Affinity Retargeting Technology)(Fc-DART)分子(MacroGenics,WO2008157379,WO2010080538)和双(ScFv)2-Fab分子(国家抗体医学研究中心-中国(National Research Center for Antibody Medicine–China))。
Fab融合双特异性抗体的实例包括但不限于F(ab)2分子(Medarex/AMGEN；Deo etal J Immunol.1998Feb 15；160(4):1677-86.)、Dual-Action或Bis-Fab分子(Genentech,Bostrom,et al 2009.Science 323,1610–1614.)、对接与锁定(DNL)分子(ImmunoMedics,WO2003074569,WO2005004809)、二价双特异性分子(Biotecnol,Schoonjans,JImmunol.2000Dec 15；165(12):7050-7.)和Fab-Fv分子(UCB-Celltech,WO2009040562A1)。
基于ScFv、双抗体的抗体和结构域抗体的实例包括但不限于双特异性T细胞接合剂(Bispecific T Cell Engager，BiTE)分子(Micromet,WO2005061547)、串联双抗体分子(Tandem Diabody，TandAb)(Affimed)Le Gall et al.,Protein Eng Des Sel.2004Apr；17(4):357-66.)、双亲和力再靶向技术(DART)分子(MacroGenics,WO2008157379,WO2010080538)、单链双抗体分子(Lawrence,FEBS Lett.1998Apr 3；425(3):479-84)、TCR样抗体(AIT,ReceptorLogics)、人血清白蛋白ScFv融合体(Merrimack,WO2010059315)和COMBODY分子(Epigen Biotech,Zhu et al.Immunol Cell Biol.2010Aug；88(6):667-75.)、双靶向纳米抗体(Ablynx,Hmila et al.,FASEB J.2010)和双靶向仅重链结构域抗体。
在一个方面，本发明的双特异性抗体包含第一Fc序列和第二Fc序列，所述第一Fc序列包含第一CH3区，所述第二Fc序列包含第二CH3区，其中第一CH3区和第二CH3区的序列不同并且使得所述第一CH3区与第二CH3区之间的异二聚体相互作用比所述第一CH3区和第二CH3区各自的同二聚体相互作用更强。WO2011131746和WO2013060867(Genmab)(其在此通过引用并入)中提供了关于这些相互作用以及它们如何可实现的更多详细信息。
如本文中进一步描述的，可使用基于仅在CH3区含有少数保守的不对称突变的一种同二聚体起始PD-L1抗体和一种同二聚体起始CD137抗体的特定方法以高产率获得稳定的双特异性PD-L1xCD137抗体。不对称突变意指所述第一CH3区和第二CH3区的序列在不相同的位置含有氨基酸替换。
在一个实施方案中，本文中公开的任何实施方案中限定的本发明的双特异性抗体包含在选自以下的位置处具有氨基酸替换的第一CH3区：人IgG1重链中的366、368、370、399、405、407和409，以及在选自以下的位置处具有氨基酸替换的第二CH3区：人IgG1重链中的366、368、370、399、405、407和409，并且其中第一CH3区和第二CH3区在相同位置没有被替换。
在一个实施方案中，本文中公开的任何实施方案中限定的本发明的双特异性抗体包含在人IgG1重链的第366位处具有氨基酸替换的第一CH3区，以及在选自以下的位置处具有氨基酸替换的第二CH3区：人IgG1重链中的368、370、399、405、407和409。在一个实施方案中，人IgG1重链中第366位的氨基酸选自Ala、Asp、Glu、His、Asn、Val或Gln。
在一个实施方案中，本文中公开的任何实施方案中限定的本发明的双特异性抗体包含在人IgG1重链的第368位处具有氨基酸替换的第一CH3区，以及在选自以下的位置处具有氨基酸替换的第二CH3区：人IgG1重链中的366、370、399、405、407和409。
在一个实施方案中，本文中公开的任何实施方案中限定的本发明的双特异性抗体包含在人IgG1重链的第370位处具有氨基酸替换的第一CH3区，以及在选自以下的位置处具有氨基酸替换的第二CH3区：人IgG1重链中的366、368、399、405、407和409。
在一个实施方案中，本文中公开的任何实施方案中限定的本发明的双特异性抗体包含在人IgG1重链的第399位处具有氨基酸替换的第一CH3区，以及在选自以下的位置处具有氨基酸替换的第二CH3区：人IgG1重链中的366、368、370、405、407和409。
在一个实施方案中，本文中公开的任何实施方案中限定的本发明的双特异性抗体包含在人IgG1重链的第405位处具有氨基酸替换的第一CH3区，以及在选自以下的位置处具有氨基酸替换的第二CH3区：人IgG1重链中的366、368、370、399、407和409。
在一个实施方案中，本文中公开的任何实施方案中限定的本发明的双特异性抗体包含在人IgG1重链的第407位处具有氨基酸替换的第一CH3区，以及在选自以下的位置处具有氨基酸替换的第二CH3区：人IgG1重链中的366、368、370、399、405和409。
在一个实施方案中，本文中公开的任何实施方案中限定的本发明的双特异性抗体包含在人IgG1重链的第409位处具有氨基酸替换的第一CH3区，以及在选自以下的位置处具有氨基酸替换的第二CH3区：人IgG1重链中的366、368、370、399、405和407。
因此，在一个实施方案中，本文中公开的任何实施方案中限定的本发明的双特异性抗体包含所述第一CH3区和第二CH3区的序列，该序列含有不对称突变，即在两个CH3区中不同位置处的突变，例如在一个CH3区中在第405位的突变和在另一个CH3区中在第409位的突变。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的一个实施方案中，第一CH3区在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且所述第二CH3区在选自以下的位置处具有氨基酸替换：366、368、370、399、405和407。在一个这样的实施方案中，所述第一CH3区在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且所述第二CH3区在第405位具有除Phe之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Met、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr、Cys、Lys或Leu。在其另外的实施方案中，所述第一CH3区在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且所述第二CH3区在第405位具有除Phe、Arg或Gly之外的氨基酸，例如Leu、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Met、Lys、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第405位包含Phe，并在第409位包含除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且所述第二CH3区在第405位包含除Phe之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Lys、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr、Leu、Met或Cys，并在第409位包含Lys。在其另外的实施方案中，所述第一CH3区在第405位包含Phe，并在第409位包含除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且所述第二CH3区在第405位包含除Phe、Arg或Gly之外的氨基酸，例如Leu、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Met、Lys、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并在第409位包含Lys。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第405位包含Phe，并在第409位包含除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且所述第二CH3区在第405位包含Leu，并在第409位包含Lys。在其另外的实施方案中，所述第一CH3区在第405位包含Phe，并在第409位包含Arg，并且所述第二CH3区在第405位包含除Phe、Arg或Gly之外的氨基酸，例如Leu、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Lys、Met、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并在第409位包含Lys。在另一个实施方案中，所述第一CH3区在第405位包含Phe，并在第409位包含Arg，并且所述第二CH3区在第405位包含Leu，并在第409位包含Lys。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另外的实施方案中，所述第一CH3区在第409位包含除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且所述第二CH3区在第409位包含Lys、在第370位包含Thr、并在第405位包含Leu。在另外的实施方案中，所述第一CH3区在第409位包含Arg，并且所述第二CH3区在第409位包含Lys、在第370位包含Thr、并在第405位包含Leu。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另外的实施方案中，所述第一CH3区在第370位包含Lys、在第405位包含Phe、并在第409位包含Arg，并且所述第二CH3区在第409位包含Lys、在第370位包含Thr、并在第405位包含Leu。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第409位包含除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且所述第二CH3区在第409位包含Lys以及：a)在第350位包含Ile并在第405位包含Leu，或b)在第370位包含Thr并在第405位包含Leu。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第409位包含Arg，并且所述第二CH3区在第409位包含Lys以及：a)在第350位包含Ile并在第405位包含Leu，或b)在第370位包含Thr并在第405位包含Leu。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第350位包含Thr、在第370位包含Lys、在第405位包含Phe并在第409位包含Arg，并且所述第二CH3区在第409位包含Lys以及：a)在第350位包含Ile并在第405位包含Leu，或b)在第370位包含Thr并在第405位包含Leu。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第350位包含Thr、在第370位包含Lys、在第405位包含Phe并在第409位包含Arg，并且所述第二CH3区在第350位包含Ile、在第370位包含Thr、在第405位包含Leu并在第409位包含Lys。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的一个实施方案中，所述第一CH3区在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二CH3区在第405位具有除Phe之外的氨基酸，例如在第405位具有除Phe、Arg或Gly之外的氨基酸；或者所述第一CH3区在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二CH3区在第407位具有除Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、Ser或Thr之外的氨基酸。
在一个实施方案中，本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体包含第一CH3区和第二CH3区，所述第一CH3区在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二CH3区在第407位具有除Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、Ser或Thr之外的氨基酸。
在一个实施方案中，本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体包含第一CH3区和第二CH3区，所述第一CH3区在第407位具有Tyr并在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二CH3区在第407位具有除Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、Ser或Thr之外的氨基酸，并在第409位具有Lys。
在本发明的一个实施方案中，本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体包含第一CH3区和第二CH3区，所述第一CH3区在第407位具有Tyr并在第409位具有Arg，并且所述第二CH3区在第407位具有除Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、Ser或Thr之外的氨基酸，并在第409位具有Lys。
在本发明的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且所述第二CH3区在第407位具有除Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、Ser或Thr之外的氨基酸，例如Leu、Met、Gly、Ala、Val、Ile、His、Asn、Pro、Trp或Cys。在本发明的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且所述第二CH3区在第407位具有Ala、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Val或Trp。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且所述第二CH3区在第407位具有Gly、Leu、Met、Asn或Trp。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第407位具有Tyr并在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且所述第二CH3区在第407位具有除Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、Ser或Thr之外的氨基酸，例如Leu、Met、Gly、Ala、Val、Ile、His、Asn、Pro、Trp或Cys，并在第409位具有Lys。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第407位具有Tyr并在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且所述第二CH3区在第407位具有Ala、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Val或Trp，并在第409位具有Lys。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第407位具有Tyr并在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且所述第二CH3区在第407位具有Gly、Leu、Met、Asn或Trp，并在第409位具有Lys。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第407位具有Tyr并在第409位具有Arg，并且所述第二CH3区在第407位具有除Tyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、Ser或Thr之外的氨基酸，例如Leu、Met、Gly、Ala、Val、Ile、His、Asn、Pro、Trp或Cys，并在第409位具有Lys。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第407位具有Tyr并在第409位具有Arg，并且所述第二CH3区在第407位具有Ala、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Val或Trp，并在第409位具有Lys。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第407位具有Tyr并在第409位具有Arg，并且所述第二CH3区在第407位具有Gly、Leu、Met、Asn或Trp，并在第409位具有Lys。
在本文中公开的任何实施方案中限定的本发明双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Phe、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，并且第二CH3区：
(i)在第368位具有除Phe、Leu和Met之外的氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Lys、Arg、His、Asp、Asn、Glu、Gln、Pro、Trp、Tyr或Cys，或
(ii)在第370位具有Trp，或
(iii)在第399位具有除Asp、Cys、Pro、Glu或Gln之外的氨基酸，例如Phe、Leu、Met、Gly、Ala、Val、Ile、Ser、Thr、Lys、Arg、His、Asn、Trp、Tyr或Cys，或
(iv)在第366位具有除Lys、Arg、Ser、Thr或Trp之外的氨基酸，例如Phe、Leu、Met、Ala、Val、Gly、Ile、Asn、His、Asp、Glu、Gln、Pro、Tyr或Cys。
在一个实施方案中，第一CH3区在第409位具有Arg、Ala、His或Gly，并且第二CH3区：
(i)在第368位具有Lys、Gln、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Asn、Arg、Ser、Thr、Val或Trp，或
(ii)在第370位具有Trp，或
(iii)在第399位具有Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、Trp、Phe、His、Lys、Arg或Tyr，或
(iv)在第366位具有Ala、Asp、Glu、His、Asn、Val、Gln、Phe、Gly、Ile、Leu、Met或Tyr。
在一个实施方案中，第一CH3区在第409位具有Arg，并且第二CH3区：
(i)在第368位具有Asp、Glu、Gly、Asn、Arg、Ser、Thr、Val或Trp，或
(ii)在第370位具有Trp，或
(iii)在第399位具有Phe、His、Lys、Arg或Tyr，或
(iv)在第366位具有Ala、Asp、Glu、His、Asn、Val、Gln。
在本发明的一个优选实施方案中，双特异性抗体包含第一重链和第二重链，其中所述第一重链和第二重链中的每一个包含至少铰链区、CH2区和CH3区，其中(i)在所述第一重链中，在对应于人IgG1重链中的F405的位置处的氨基酸是L，并且在所述第二重链中，在对应于人IgG1重链中的K409的位置处的氨基酸是R，或者(ii)在所述第一重链中，在对应于人IgG1重链中的K409的位置处的氨基酸是R，并且在所述第二重链中，在对应于人IgG1重链中的F405的位置处的氨基酸是L。
除上述指定的氨基酸替换之外，所述第一重链和第二重链相对于野生型重链序列可包含另外的氨基酸替换、缺失或插入。
在本发明的一个实施方案中，所述第一Fc序列和所述第二Fc序列在(核心)铰链区中均不包含Cys-Pro-Ser-Cys序列。
在本发明的另一个实施方案中，所述第一Fc序列和所述第二Fc序列二者在(核心)铰链区中均包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。
传统方法例如杂交杂交瘤和化学缀合方法(Marvin and Zhu(2005)ActaPharmacol Sin 26:649)可用于制备本发明的双特异性抗体。由不同重链和轻链组成的两种抗体在宿主细胞中的共表达导致除了期望的双特异性抗体之外可能的抗体产物的混合物，其随后可通过例如亲和色谱或类似方法分离。
也可使用有利于在不同抗体构建体共表达之后形成功能性双特异性产物的策略，例如Lindhofer et al.(1995J Immunol 155:219)所述的方法。由于优先的物种限制的重/轻链配对，产生不同抗体的大鼠和小鼠杂交瘤的融合导致数量有限的异二聚体蛋白。促进异二聚体优先于同二聚体形成的另一种策略是“结进孔(knob-into-hole)”策略，其中在第一重链多肽上引入突起(protuberance)并在第二重链多肽中引入相应的空腔，使得突起可位于这两条重链界面的空腔中，以促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。“突起”是通过用较大的侧链替换来自第一多肽界面的小氨基酸侧链而构建的。与突起尺寸相同或相似的补偿“空腔”是在第二多肽的界面中通过用较小的氨基酸侧链替换大的氨基酸侧链产生的(美国专利5,731,168)。EP1870459(Chugai)和WO2009089004(Amgen)描述了在宿主细胞中共表达不同抗体结构域之后有利于异二聚体形成的其他策略。在这些方法中，在两个CH3结构域中构成CH3-CH3界面的一个或更多个残基被带电荷的氨基酸替换，使得同二聚体的形成在静电上是不利的，而异二聚体在静电上是有利的。WO2007110205(Merck)描述了另一种策略，其中利用IgA和IgG CH3结构域之间的差异来促进异二聚化。
WO2008119353(Genmab)中已经描述了另一种用于产生双特异性抗体的体外方法，其中双特异性抗体通过在还原条件下孵育之后两个单特异性IgG4或IgG4样抗体之间的“Fab臂”或“半分子”交换(交换重链和连接的轻链)来形成。所得产物是具有两个可包含不同序列的Fab臂的双特异性抗体。
用于制备本发明的双特异性PD-L1xCD137抗体的优选方法包括WO2011131746和WO2013060867(Genmab)中所述的方法，其包括以下步骤：
a)提供包含Fc区的第一抗体，所述Fc区包含第一CH3区；
b)提供包含第二Fc区的第二抗体，所述Fc区包含第二CH3区，其中所述第一抗体是CD137抗体并且所述第二抗体是PD-L1抗体，或反之亦然；其中所述第一CH3区和第二CH3区的序列不同并且使得所述第一CH3区与第二CH3区之间的异二聚体相互作用比所述第一CH3区和第二CH3区各自的同二聚体相互作用更强；
c)在还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起孵育；以及
d)获得所述双特异性PD-L1xCD137抗体。
类似地，提供了用于产生根据本发明的抗体的方法，其包括以下步骤：
a)培养产生第一抗体的宿主细胞，并从培养物中纯化所述第一抗体，所述第一抗体包含本文中限定的能够与人CD137结合的抗原结合区；
b)培养产生第二抗体的宿主细胞，并从培养物中纯化所述第二抗体，所述第二抗体包含本文中限定的能够与人PD-L1结合的抗原结合区；
c)在足以使铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起孵育，以及
d)获得所述双特异性抗体。
在本发明的一个实施方案中，在足以使铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起孵育，其中在所得异二聚体中的所述第一抗体与第二抗体之间的异二聚体相互作用是这样的：在37℃下24小时之后在0.5mM GSH下不会发生Fab臂交换。
不受理论的限制，在步骤c)中，亲本抗体的铰链区中的重链二硫键被还原并且随后所得半胱氨酸能够与另一个亲本抗体分子(最初具有不同的特异性)的半胱氨酸残基形成重链间二硫键。在该方法的一个实施方案中，步骤c)中的还原条件包括添加还原剂，例如选自以下的还原剂：2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选选自以下的还原剂：2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧基乙基)膦。在另外的实施方案中，步骤c)包括恢复条件以变为非还原性或低还原性，例如通过去除还原剂，例如通过脱盐。
对于该方法，可使用上述任何CD137和PD-L1抗体，包括分别包含第一Fc区和/或第二Fc区的第一和第二CD137和PD-L1抗体。这样的第一Fc区和第二Fc区(包括这样的第一Fc区和第二Fc区的组合)的实例可包括上述那些中的任一个。在一个具体实施方案中，可分别选择第一和第二CD137和PD-L1抗体以获得如本文中所述的双特异性抗体。
在该方法的一个实施方案中，所述第一和/或第二抗体是全长抗体。
第一抗体和第二抗体的Fc区可以是任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在该方法的一个实施方案中，所述第一抗体和所述第二抗体二者的Fc区都是IgG1同种型。在另一个实施方案中，所述抗体的一个Fc区是IgG1同种型，而另一个是IgG4同种型。在后一个实施方案中，所得双特异性抗体包含IgG1的Fc序列和IgG4的Fc序列，并因此可具有关于激活效应功能的令人感兴趣的中间特性。
在另外的实施方案中，抗体起始蛋白之一已被改造为不结合蛋白A，因此允许通过将产物通过蛋白A柱将异二聚体蛋白与所述同二聚体起始蛋白分离。
如上所述，同二聚体起始抗体的第一CH3区和第二CH3区的序列是不同的并且使得所述第一CH3区和第二CH3区之间的异二聚体相互作用比所述第一CH3区和第二CH3区各自的同二聚体相互作用更强。WO2011131746和WO2013060867(Genmab)(其在此通过引用整体并入)中提供了关于这些相互作用以及如何实现它们的更多详细信息。
特别地，可使用基于分别结合CD137和PD-L1并且在CH3区中仅含有少数保守的不对称突变的两种同二聚体起始抗体的本发明的上述方法以高产率获得稳定的双特异性PD-L1xCD137抗体。不对称突变意指所述第一CH3区和第二CH3区的序列在不相同的位置含有氨基酸替换。
本发明的双特异性抗体也可通过在单个细胞中共表达编码第一多肽和第二多肽的构建体来获得。因此，在另一方面，本发明涉及用于产生双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供编码第一多肽的第一核酸构建体，所述第一多肽包含第一抗体重链的第一Fc序列和第一抗原结合区，所述第一Fc序列包含第一CH3区，
b)提供编码第二多肽的第二核酸构建体，所述第二多肽包含第二抗体重链的第二Fc序列和第二抗原结合区，所述第二Fc序列包含第二CH3区，其中所述第一CH3区和第二CH3区的序列不同并且使得所述第一CH3区和第二CH3区之间的异二聚体相互作用比所述第一CH3区和第二CH3区各自的同二聚体相互作用更强，并且其中所述第一同二聚体蛋白在第409位具有除Lys、Leu或Met之外的氨基酸，并且所述第二同二聚体蛋白在选自以下位置处具有氨基酸替换：366、368、370、399、405和407，任选地其中所述第一核酸构建体和第二核酸构建体编码所述第一抗体和第二抗体的轻链序列；
c)在宿主细胞中共表达所述第一核酸构建体和第二核酸构建体，以及
d)从细胞培养物中获得所述异二聚体蛋白。
在本发明的一些实施方案中，根据本发明的结合剂除了包含抗原结合区之外，还包含由两条重链的Fc序列组成的Fc区。
第一Fc序列和第二Fc序列可各自具有任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且可包含一个或更多个突变或修饰。在一个实施方案中，第一Fc序列和第二Fc序列中的每一个是IgG4同种型或来源于其，任选地具有一个或更多个突变或修饰。在另一个实施方案中，第一Fc序列和第二Fc序列中的每一个是IgG1同种型或来源于其，任选地具有一个或更多个突变或修饰。在另一个实施方案中，一个Fc序列是IgG1同种型，而另一个是IgG4同种型，或者来源于这样的各自的同种型，任选地具有一个或更多个突变或修饰。
在本发明的一个实施方案中，一个或两个Fc序列是效应功能缺陷的。例如，Fc序列可以是IgG4同种型或非IgG4类型，例如IgG1、IgG2或IgG3，其已经突变使得介导效应功能(例如ADCC)的能力已经降低或甚至被消除。这样的突变已在例如Dall'Acqua WF et al.,JImmunol.177(2):1129-1138(2006)和Hezareh M,J Virol.；75(24):12161-12168(2001)中进行了描述。在另一个实施方案中，一个或两个Fc序列包含IgG1野生型序列。
本发明上下文中的术语“效应功能”包括由免疫系统组分介导的任何功能，这些功能导致例如杀伤病变细胞例如肿瘤细胞，或抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展，包括抑制肿瘤散播和转移。优选地，本发明上下文中的效应功能是T细胞介导的效应功能。这样的功能包括ADCC、ADCP或CDC。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是细胞毒性效应细胞通过非吞噬过程杀伤抗体包被的靶细胞，其特征在于释放细胞毒性颗粒的内容物或表达细胞死亡诱导分子。ADCC独立于免疫补体系统，免疫补体系统也裂解靶标，但不需要任何其他细胞。ADCC是通过靶标结合抗体(属于IgG或IgA或IgE类)与某些Fc受体(FcR)的相互作用触发的，FcR是存在于效应细胞表面上的与免疫球蛋白(Ig)的Fc区结合的糖蛋白。介导ADCC的效应细胞包括自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和树突细胞。ADCC是一种快速效应机制，其功效取决于许多参数(靶细胞表面上的抗原的密度和稳定性；抗体亲和力和FcR结合亲和力)。涉及人IgG1(治疗性抗体最常用的IgG亚类)的ADCC高度依赖于其Fc部分的糖基化谱和Fcγ受体的多态性。
抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)
ADCP是许多抗体治疗的一种重要作用机制。它被定义为这样的高度调节的过程，通过该过程，抗体通过将其Fc结构域与吞噬细胞上的特定受体连接并引发吞噬作用来消除结合的靶标。与ADCC不同，ADCP可以由单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞通过FcγRIIa、FcγRI和FcγRIIIa介导，其中巨噬细胞上的FcγRIIa(CD32a)代表主要途径。
补体依赖性细胞毒性(CDC)
CDC是可通过抗体指引的另一种细胞杀伤方法。IgM是用于补体活化的最有效同种型。IgG1和IgG3在通过经典补体活化途径指引CDC方面也都非常有效。优选地，在该级联中，抗原-抗体复合体的形成导致在参与的抗体分子(例如，IgG分子)的CH2结构域上暴露多个紧邻C1q结合位点(C1q是补体C1的三种亚组分之一)。优选地，这些暴露的C1q结合位点将先前的低亲和力C1q-IgG相互作用转变为一种高亲合力相互作用，这触发了涉及一系列其他补体蛋白的级联事件并且导致效应细胞趋化剂/活化剂C3a和C5a的蛋白水解释放。优选地，该补体级联最终形成膜攻击复合体，其在细胞膜中产生孔，这有利于水和溶质自由地进入和离开细胞。
根据本发明的抗体可在Fc区中包含修饰。当抗体包含这样的修饰时，其可变为惰性或非活化抗体。如本文中所用，术语“惰性”、“惰性的”或“非活化”是指至少不能够通过单个抗体的两个Fc区诱导FcR介导的靶抗原交联、诱导Fc介导的FcR交联或结合任何Fcγ受体、，或者不能够结合C1q的Fc区。使用单特异性形式的抗体有利地测试人源化或嵌合CD137或PD-L1抗体的Fc区的惰性。
可构建数种变体以使抗体的Fc区对与Fcγ受体和C1q的相互作用无活性用于治疗性抗体的开发。这样的变体的实例在本文中进行了描述。
因此，在本发明抗体的一个实施方案中，所述抗体包含第一重链和第二重链，其中一条或两条重链被修饰，使得抗体相对于除了包含未经修饰的第一重链和第二重链之外都相同的抗体诱导Fc介导的效应功能的程度更小。所述Fc介导的效应子功能可通过测定、通过与Fcγ受体结合、通过与C1q结合或通过诱导Fc介导的FcR交联来测量。
在另一个这样的实施方案中，重链恒定序列和轻链恒定序列已被修饰，使得C1q与所述抗体的结合与未经修饰抗体相比降低至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或100％，其中C1q结合通过ELISA确定。
因此，Fc区中在与C1q和Fcγ受体的相互作用中发挥主导作用的氨基酸可被修饰。
可被修饰的氨基酸位置的实例，例如在IgG1同种型抗体中，包括位置L234、L235和P331。其组合，例如L234F/L235E/P331S，可导致与人CD64、CD32、CD16和C1q的结合显著降低。
因此，在一个实施方案中，在对应于L234、L235和P331的至少一个位置处的氨基酸可分别是A、A和S(Xu et al.,2000,Cell Immunol.200(1):16-26；Oganesyan et al.,2008,Acta Cryst.(D64):700-4)。此外，L234F和L235E氨基酸替换可导致Fc区与Fcγ受体和C1q的相互作用被消除(Canfield et al.,1991,J.Exp.Med.(173):1483-91；Duncan etal.,1988,Nature(332):738-40)。因此，在一个实施方案中，在对应于L234和L235的位置处的氨基酸可分别是F和E。D265A氨基酸替换可降低与所有Fcγ受体的结合并阻止ADCC(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.(276):6591-604)。因此，在一个实施方案中，在对应于D265的位置处的氨基酸可以是A。与C1q的结合可通过突变位置D270、K322、P329和P331来消除。将这些位置突变为D270A或K322A或P329A或P331A可使抗体缺乏CDC活性(IdusogieEE,et al.,2000,J Immunol.164:4178-84)。因此，在一个实施方案中，在对应于D270、K322、P329和P331的至少一个位置处的氨基酸可分别是A、A、A和A。
使Fc区与Fcγ受体和C1q的相互作用最小化的一种替代方法是通过去除抗体的糖基化位点。将位置N297突变为例如Q、A或E会去除对IgG-Fcγ受体相互作用至关重要的糖基化位点。因此，在一个实施方案中，在对应于N297的位置处的氨基酸可以是G、Q、A或E(Leabman et al.,2013,MAbs；5(6):896-903)。使Fc区与Fcγ受体的相互作用最小化的另一替代方法可通过以下突变获得：P238A、A327Q、P329A或E233P/L234V/L235A/G236del(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.(276):6591-604)。
或者，人IgG2和IgG4亚类在其与C1q和Fcγ受体的相互作用中被认为是天然受损的，尽管报道了与Fcγ受体的相互作用(Parren et al.,1992,J.Clin Invest.90:1537-1546；Bruhns et al.,2009,Blood 113:3716-3725)。消除这些残留相互作用的突变可在两种同种型中进行，从而降低与FcR结合相关的不期望的副作用。对于IgG2，这些包括L234A和G237A，并且对于IgG4，包括L235E。因此，在一个实施方案中，在对应于人IgG2重链中L234和G237位置处的氨基酸可分别是A和A。在一个实施方案中，在对应于人IgG4重链中L235位置处的氨基酸可以是E。
进一步使IgG2抗体中与Fcγ受体和C1q的相互作用最小化的另一些方法包括在WO2011066501和Lightle,S.,et al.,2010,Protein Science(19):753-62中描述的那些。
抗体的铰链区对于与Fcγ受体和补体的相互作用也是重要的(Brekke et al.,2006,J Immunol 177:1129-1138；Dall’Acqua WF,et al.,2006,JImmunol 177:1129-1138)。因此，铰链区的突变或缺失可影响抗体的效应功能。
因此，在一个实施方案中，抗体包含第一免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白重链，其中在所述第一免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白重链中的至少一个中，在对应于人IgG1重链中的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置处的一个或更多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。
在一个实施方案中，在第一重链和第二重链二者中，在对应于人IgG1重链中的位置L234、L235、D265、N297和P331的位置处的一个或更多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。
在本发明的一个实施方案中，在所述第一重链和第二重链二者中，在对应于人IgG1重链中的位置D265的位置处的氨基酸不是D。
因此，在本发明的一个实施方案中，在所述第一重链和第二重链二者中，在对应于人IgG1重链中位置D265的位置处的氨基酸选自A和E。
在本发明的另一个实施方案中，在所述第一重链和第二重链中的至少一个中，在对应于人IgG1重链中的位置L234和L235的位置处的氨基酸分别不是L和L。
在本发明的一个具体实施方案中，在所述第一重链和第二重链中的至少一个中，在对应于人IgG1重链中的位置L234和L235的位置处的氨基酸分别是F和E。
在本发明的一个实施方案中，在所述第一重链和第二重链二者中，在对应于人IgG1重链中的位置L234和L235的位置处的氨基酸分别是F和E。
在本发明的一个具体实施方案中，在所述第一重链和第二重链中的至少一个中，在对应于人IgG1重链中位置L234、L235和D265的位置处的氨基酸分别是F、E和A。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，在所述第一重链和第二重链二者中，在对应于人IgG1重链中的位置L234、L235和D265的位置处的氨基酸分别是F、E和A。
在本发明的另一个特别优选的实施方案中，结合剂是包含第一重链和第二重链的双特异性抗体，其中第一重链和第二重链二者的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235的位置分别是F和E，并且其中(i)第一重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L，并且第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，或者(ii)第一重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，并且第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L。
在本发明的另一个特别优选的实施方案中，结合剂是包含第一重链和第二重链的双特异性抗体，其中第一重链和第二重链二者的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265的位置分别是F、E和A，并且其中(i)第一重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L，并且第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，或者(ii)第一重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的K409的位置是R，并且第二重链的对应于根据EU编号的人IgG1重链中的F405的位置是L。
具有三个氨基酸替换L234F、L235E和D265A以及另外地K409R或F405L突变的组合的抗体变体在本文中分别带有后缀“FEAR”或“FEAL”。
在一个优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含：
(i)来源于IgG1-CD137-FEAL的半分子抗体和来源于IgG1-PDL1-547-FEAR的半分子抗体，或
(ii)来源于IgG1-CD137-FEAR的半分子抗体和来源于的半分子抗体和来源于IgG1-PD-L1-547-FEAL的半分子抗体。
在本发明的另一个实施方案中，形成双特异性抗体的一部分的一种或两种抗体已被改造以降低或提高与新生儿Fc受体(FcRn)的结合，以操纵双特异性抗体的血清半衰期。用于提高或降低血清半衰期的技术是本领域公知的。参见例如Dall’Acqua et al.2006,J.Biol.Chem.,281:23514-24；Hinton et al.2006,J.Immunol.,176:346-56；和Zalevskyet al.2010Nat.Biotechnol.,28:157-9。
在另一个实施方案中，本文中所述的结合剂或抗体与一种或更多种治疗性部分连接或缀合，所述治疗性部分例如细胞因子、免疫抑制剂、免疫刺激分子和/或放射性同位素。这样的缀合物在本文中称为“免疫缀合物”或“药物缀合物”。包含一种或更多种细胞毒素的免疫缀合物被称为“免疫毒素”。
在一个实施方案中，第一Fc序列和/或第二Fc序列与药物或前药缀合或包含其的受体基团。这样的受体基团可例如是非天然氨基酸。
RNA递送
根据本发明特别优选的是，本文中所述的肽、蛋白质或多肽，特别是肽或蛋白质抗原和/或抗体，以编码本文中所述的肽、蛋白质或多肽的RNA的形式施用。在一个实施方案中，不同的本文中所述的肽、蛋白质或多肽由不同的RNA分子编码。
在一个实施方案中，RNA在递送载剂中配制。在一个实施方案中，递送载剂包含颗粒。在一个实施方案中，递送载剂包含至少一种脂质。在一个实施方案中，所述至少一种脂质包含至少一种阳离子脂质。在一个实施方案中，脂质与RNA形成复合体和/或包封RNA。在一个实施方案中，脂质包含在包封RNA的囊泡中。在一个实施方案中，RNA在脂质体中配制。
根据本公开内容，在施用本文中所述的RNA之后，至少一部分RNA被递送至靶细胞。在一个实施方案中，至少一部分RNA被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，RNA被靶细胞翻译以产生所编码的肽或蛋白质。
本公开内容的一些方面涉及将本文中所公开的RNA(例如编码包含表位的肽或蛋白质的RNA)靶向递送至某些组织。
在一个实施方案中，本公开内容涉及靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别是脾。如果施用的RNA是编码包含表位的肽或蛋白质的RNA，则特别优选靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别是脾。
在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职性抗原呈递细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。
“淋巴系统”是循环系统的一部分并且是免疫系统的重要部分，其包含运送淋巴的淋巴管网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管的传导网络和循环淋巴组成。原发性或中央淋巴器官从未成熟的祖细胞产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成初级淋巴器官。次级或外周淋巴器官(包括淋巴结和脾)维持成熟的初始淋巴细胞并启动适应性免疫应答。
RNA可通过所谓的脂质复合体制剂递送至脾，其中RNA与包含阳离子脂质和任选地另外的或辅助脂质(helper lipid)的脂质体结合以形成可注射的纳米粒制剂。脂质体可通过将脂质在乙醇中的溶液注入到水或合适的水相中而获得。RNA脂质复合体颗粒可通过将脂质体与RNA混合来制备。靶向RNA脂质复合体颗粒的脾在WO 2013/143683中描述，其通过引用并入本文。已发现具有净负电荷的RNA脂质复合体颗粒可用于优先靶向脾组织或脾细胞，例如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在施用RNA脂质复合体颗粒之后，在脾中发生RNA积聚和/或RNA表达。因此，本公开内容的RNA脂质复合体颗粒可用于在脾中表达RNA。在一个实施方案中，在RNA脂质复合体颗粒的施用之后，在肺和/或肝中没有或基本上没有RNA积累和/或RNA表达发生。在一个实施方案中，在RNA脂质复合体颗粒的施用之后，在脾中在抗原呈递细胞例如专职抗原呈递细胞中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开内容的RNA脂质复合体颗粒可用于在这样的抗原呈递细胞中表达RNA。在一个实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。
在本公开内容的上下文中，术语“RNA脂质复合体颗粒”涉及包含脂质(特别是阳离子脂质)和RNA的颗粒。带正电荷的脂质体和带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNA脂质复合体颗粒的络合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可使用阳离子脂质(例如DOTMA)和另外的脂质(例如DOPE)合成。在一个实施方案中，RNA脂质复合体颗粒是纳米粒。
如本文中所用，“阳离子脂质”是指具有净正电荷的脂质。阳离子脂质通过与脂质基质的静电相互作用结合带负电荷的RNA。通常来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，并且脂质的头基通常携带正电荷。阳离子脂质的实例包括但不限于：1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、二甲基双二十八烷基铵(DDAB)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、2,3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基铵(DMRIE)、1,2-二豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、1,2-二豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1,2-二油氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)、和2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-三氟乙酸丙铵(DOSPA)。优选的是DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。在一些具体实施方案中，阳离子脂质是DOTMA和/或DOTAP。
可以并入另外的脂质以调整总的正负电荷比和RNA脂质复合体颗粒的物理稳定性。在某些实施方案中，所述另外的脂质是中性脂质。如本文中所用，“中性脂质”是指净电荷为零的脂质。中性脂质的实例包括但不限于1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇和脑苷脂。在一些具体实施方案中，另外的脂质是DOPE、胆固醇和/或DOPC。
在某些实施方案中，RNA脂质复合体颗粒包含阳离子脂质和另外的脂质二者。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是DOTMA，并且另外的脂质是DOPE。
在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2、或约3:1至约1:1。在一些具体实施方案中，摩尔比可以为约3:1、约2.75:1、约2.5:1、约2.25:1、约2:1、约1.75:1、约1.5:1、约1.25:1、或约1:1。在一个示例性实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约2:1。
在一个实施方案中，本文中所述的RNA脂质复合体颗粒的平均直径为约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm、或约350nm至约400nm。在一些具体实施方案中，RNA脂质复合体颗粒的平均直径为约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm、或约1000nm。在一个实施方案中，RNA脂质复合体颗粒的平均直径为约250nm至约700nm。在另一个实施方案中，RNA脂质复合体颗粒的平均直径为约300nm至约500nm。在一个示例性实施方案中，RNA脂质复合体颗粒的平均直径为约400nm。
本公开内容的RNA脂质复合体颗粒的电荷是至少一种阳离子脂质中存在的电荷与RNA中存在的电荷的总和。电荷比是至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷的比。至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷的电荷比通过以下等式来计算：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中正电荷总数)]/[(RNA浓度(mol))*(RNA中负电荷总数)]。
本文中所述的靶向脾的RNA脂质复合体颗粒在生理pH下优选具有净负电荷，例如正电荷与负电荷的电荷比为约1.9:2至约1:2。在一些具体实施方案中，在生理pH下RNA脂质复合体颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.9:2.0、约1.8:2.0、约1.7:2.0、约1.6:2.0、约1.5:2.0、约1.4:2.0、约1.3:2.0、约1.2:2.0、约1.1:2.0或约1:2.0。
RNA递送系统对肝具有固有的偏好。这涉及基于脂质的颗粒、阳离子和中性纳米粒，特别是脂质纳米粒，例如脂质体、纳米胶束和亲脂性配体，其在生物缀合物中。肝积聚是由肝血管系统或脂质代谢(脂质体和脂质或胆固醇缀合物)的不连续性质引起的。
为了在体内将RNA递送至肝，可以使用药物递送系统通过防止其降解将RNA运送到肝中。例如，由聚(乙二醇)(PEG)包被的表面和包含mRNA的核心组成的复合纳米胶束是有用的系统，因为纳米胶束在生理条件下提供了优异的体内RNA稳定性。此外，由密集的PEG栅栏构成的复合纳米胶束表面所提供的隐身特性有效地规避了宿主免疫防御。
药物组合物
本文中所述的药剂可以以药物组合物或药物施用用于治疗性或预防性治疗，并且可以以任何合适的药物组合物的形式施用。
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效剂，优选与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起的治疗有效剂的制剂。通过将所述药物组合物施用于对象，所述药物组合物可用于治疗、预防或者减轻疾病或病症的严重程度。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。
本公开内容的药物组合物优选包含一种或更多种佐剂或者可以与一种或更多种佐剂一起施用。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包括化合物例如油乳剂(例如，弗氏佐剂(Freund’s adjuvant))、矿物质化合物(例如明矾)、细菌产品(例如百日咳鲍特菌毒素)或免疫刺激复合物的非均质组。佐剂的实例包括但不限于：LPS、GP96、CpG寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。趋化因子可以是IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL12、IFNα、IFNγ、GM-CSF、LT-a。另一些已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油类，例如
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ISA51。用于本公开内容的另一些合适的佐剂包括脂肽，例如Pam3Cys。
根据本公开内容的药物组合物通常以“药学有效量”和在“可药用制剂”中施加。
术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的物质的无毒性。
术语“药学有效量”或“治疗有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望的反应或期望的效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选地涉及对疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的进展，并且特别是中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中的期望反应还可以是延迟所述疾病或所述病症的发生或预防其发生。本文中所述的组合物的有效量将取决于：待治疗的病症，疾病的严重程度，患者的个体参数，包括年龄、生理状况、身高和体重，治疗持续时间，伴随治疗(如果存在的话)的类型，具体施用途径以及类似因素。因此，本文中所述的组合物的施用剂量可以取决于多种这样的参数。在采用初始剂量患者中的反应不足的情况下，可以使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现有效更高的剂量)。
本公开内容的药物组合物可以包含盐、缓冲剂、防腐剂和任选地其他治疗剂。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
用于本公开内容的药物组合物中的合适的防腐剂包括但不限于：苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
如本文中所用，术语“赋形剂”是指可存在于本公开内容的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于：载体、黏合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释剂(diluting agent)和/或冲淡剂(thinning agent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体混悬剂和/或混合介质中的任何一种或更多种。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。
术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，在其中将活性组分组合以促进、增强或实现药物组合物的施用。如本文中所用，载体可以是适合于施用于对象的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载体包括但不限于：无菌水、林格液(Ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、等张盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘以及特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含等张盐水。
用于治疗用途的可药用载体、赋形剂或稀释剂在药学领域中是公知的，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R Gennaroedit.1985)中。
可以根据预期的施用途径和标准药物实践来选择药用载体、赋形剂或稀释剂。
在一个实施方案中，本文中所述的药物组合物可静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内施用。在某些实施方案中，将药物组合物配制成用于局部施用或全身性施用。全身性施用可以包括涉及通过胃肠道吸收的肠施用，或肠胃外施用。如本文中所用，“肠胃外施用”是指以除通过胃肠道之外的任何方式的施用，例如通过静脉内注射。在一个优选实施方案中，将药物组合物配制成用于全身性施用。在另一个优选实施方案中，全身性施用是通过静脉内施用。
如本文中所用，术语“共同施用”意指将不同化合物或组合物(例如，编码包含表位的肽或蛋白质的RNA和结合剂)施用于同一患者的过程。编码包含表位的肽或蛋白质的RNA和结合剂可同时、基本上同时或依次施用。如果施用是依次进行的，则可在施用编码包含表位的肽或蛋白质的RNA之前或之后施用结合剂。优选地，在施用编码包含表位的肽或蛋白质的RNA之后施用结合剂。如果施用是同时发生的，则结合剂和编码包含表位的肽或蛋白质的RNA不需要在同一组合物中来施用。结合剂和编码包含表位的肽或蛋白质的RNA可施用一次或更多次，并且每种组分的施用次数可相同或不同。另外，结合剂和编码包含表位的肽或蛋白质的RNA不需要在相同位点施用。
用途
本文中所述的药剂可用于治疗性或预防性治疗多种疾病，特别是这样的疾病：其中将包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或蛋白质提供于所述对象产生治疗性或预防性效果。例如，提供来源于病毒的抗原或表位可用于治疗由所述病毒引起的病毒性疾病。提供肿瘤抗原或表位可用于治疗其中癌细胞表达所述肿瘤抗原的癌症疾病。
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可以由最初来自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者疾病可以由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。在人中，“疾病”通常被更广泛地用于是指引起患病个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡或者与该个体接触的那些的类似问题的任何病症。在此更广泛的意义上，疾病有时包括损伤、失能、障碍、综合征、感染、孤立症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些情况下和出于另一些目的，这些可被视为可区分的类别。疾病通常不仅在身体上而且在情感上影响个体，因为对许多疾病的感染和经历可改变个体对生命的看法和个体的性格。
在本发明背景下，术语“治疗”或“治疗性干预”涉及出于对抗病症例如疾病或障碍目的的对对象的管理和护理。该术语旨在包括针对对象所遭受的给定病症的全谱治疗，例如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病、障碍或病症的进展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症，其中预防应理解为出于对抗疾病、病症或障碍目的的对个体的管理和护理，并且包括施用活性化合物以防止症状或并发症的发生。
术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或延长(提高)个体寿命的任何治疗。所述治疗可以在个体中消除疾病、在个体中阻止或减缓疾病的发展、在个体中抑制或减缓疾病的发展，在个体中降低症状的频率或严重程度，和/或在目前患有或以前曾患有疾病的个体中降低复发。
术语“预防性治疗”或“防止性治疗”涉及旨在防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“防止性治疗”在本文中可互换使用。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可受疾病或病症(例如，癌症)折磨或易于患有疾病或病症(例如，癌症)但是可患有或可未患有疾病或病症的人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄，并且因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开内容的一些实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。
术语“患者”意指治疗的个体或对象，特别是患病的个体或对象。
在本公开内容的一个实施方案中，目的是提供针对表达抗原的患病细胞(例如表达肿瘤抗原的癌细胞)的免疫应答，以及治疗涉及表达抗原例如肿瘤抗原的细胞的疾病例如癌症疾病。
可将包含含有表位的肽或蛋白质或多核苷酸(例如编码包含表位的肽或蛋白质的RNA)的药物组合物施用于对象，以在对象中引发针对包含所述表位的抗原的免疫应答，其可以是治疗性的或者部分或完全保护性的。本领域技术人员将知道免疫治疗和疫苗接种的原理之一是基于以下事实：通过用抗原或表位对对象进行免疫接种来产生针对疾病的免疫保护性反应，所述抗原或表位在免疫学上与待治疗的疾病相关。因此，本文中所述的药物组合物可应用于诱导或增强免疫应答。因此，本文中所述的药物组合物可用于涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。
如本文中所用，“免疫应答”是指对抗原或表达抗原的细胞的整合的身体应答，并且是指细胞免疫应答和/或体液免疫应答。细胞免疫应答包括但不限于针对表达抗原的细胞并且以用I类或II类MHC分子呈递抗原为特征的细胞应答。细胞应答与T淋巴细胞有关，T淋巴细胞可分类为辅助T细胞(也称为CD4+T细胞)，它们通过调节免疫应答或杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞，CD8+T细胞或CTL)发挥主要作用，所述杀伤细胞在感染的细胞或癌细胞中诱导凋亡。在一个实施方案中，施用本公开内容的药物组合物涉及刺激针对表达一种或更多种肿瘤抗原的癌细胞的抗肿瘤CD8+T细胞应答。在一个具体实施方案中，肿瘤抗原由I类MHC分子呈递。
本公开内容考虑了可以是保护性、阻止性、预防性和/或治疗性的免疫应答。本文中使用的“诱导免疫应答”可指示在诱导之前不存在针对特定抗原的免疫应答，或者其可指示在诱导之前存在针对特定抗原的基础水平的免疫应答，其在诱导之后增强。因此，“诱导免疫应答”包括“增强免疫应答”。
术语“免疫治疗”涉及通过诱导或增强免疫应答来治疗疾病或病症。术语“免疫治疗”包括抗原免疫接种或抗原疫苗接种。
术语“免疫接种”或“疫苗接种”描述了以诱导免疫应答为目的例如出于治疗性或预防性的原因而向个体施用抗原的过程。
在一个实施方案中，本公开内容设想了这样的实施方案，其中施用靶向脾组织的本文中所述的RNA制剂(例如RNA脂质复合体颗粒)。RNA编码例如包含例如本文中所述表位的肽或蛋白质。RNA被脾中的抗原呈递细胞(例如树突细胞)摄取以表达肽或蛋白质。在抗原呈递细胞进行任选的加工和呈递之后，可产生针对表位的免疫应答，从而导致对涉及表位或包含所述表位的抗原的疾病的预防性和/或治疗性治疗。在一个实施方案中，由本文中所述RNA诱导的免疫应答包括抗原呈递细胞例如树突细胞和/或巨噬细胞对抗原或其片段例如表位的呈递，以及由于该呈递而引起的细胞毒性T细胞的活化。例如，由RNA编码的肽或蛋白质或其加工产物可由在抗原呈递细胞上表达的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白来呈递。然后，MHC肽复合物可被免疫细胞(例如T细胞或B细胞)识别，从而导致它们的活化。
因此，本公开内容涉及本文中所述的RNA，其用于涉及抗原的疾病(优选癌症疾病)的预防性和/或治疗性治疗。
术语“巨噬细胞”是指通过单核细胞的分化产生的吞噬细胞的亚组。被炎症、免疫细胞因子或微生物产物活化的巨噬细胞在巨噬细胞内通过水解和氧化攻击非特异性地吞噬并杀伤外来病原体，从而导致病原体的降解。来自降解的蛋白质的肽显示在巨噬细胞表面上，在这里其可以被T细胞识别，并且其可以直接与B细胞表面上的抗体相互作用，从而导致T细胞和B细胞活化并进一步刺激免疫应答。巨噬细胞属于抗原呈递细胞的类别。在一个实施方案中，巨噬细胞是脾巨噬细胞。
术语“树突细胞”(DC)是指吞噬细胞的另一亚型，其属于抗原呈递细胞的类别。在一个实施方案中，树突细胞来源于造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟细胞的特征在于高吞噬活性和低T细胞活化潜能。未成熟的树突细胞不断采样周围环境中的病原体，例如病毒和细菌。一旦其与可呈递的抗原接触，其就被活化成为成熟的树突细胞，并且开始迁移至脾或淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将其蛋白质降解为小块(piece)，并且在成熟之后，使用MHC分子将这些片段呈递在其细胞表面处。同时，其上调了在T细胞活化中充当共受体的细胞表面受体，例如CD80、CD86和CD40，极大地增强了其活化T细胞的能力。其还上调了CCR7，所述CCR7是诱导树突细胞穿过血流到达脾，或穿过淋巴系统到达淋巴结的趋化性受体。在此其充当抗原呈递细胞，并通过与非抗原特异性共刺激信号一起呈递其抗原来活化辅助T细胞和杀伤T细胞以及B细胞。因此，树突细胞可以主动诱导T细胞或B细胞相关的免疫应答。在一个实施方案中，树突细胞是脾树突细胞。
术语“抗原呈递细胞”(APC)是能够在其细胞表面上(或在其表面处)展示、获得和/或呈递至少一种抗原或抗原性片段的多种细胞中的细胞。抗原呈递细胞可以区分为专职性抗原呈递细胞和非专职性抗原呈递细胞。
术语“专职性抗原呈递细胞”涉及组成型表达与初始T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合体II类(MHC II类)分子的抗原呈递细胞。如果T细胞与抗原呈递细胞膜上的MHC II类分子复合体相互作用，则抗原呈递细胞产生诱导T细胞活化的共刺激分子。专职性抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。
术语“非专职性抗原呈递细胞”涉及不组成型表达MHC II类分子，但是在受到某些细胞因子例如干扰素-γ刺激之后表达MHC II类分子的抗原呈递细胞。示例性的非专职性抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、胶质细胞、胰腺β细胞或血管内皮细胞。
“抗原加工”是指抗原降解为加工产物，其是所述抗原的片段(例如，蛋白质降解为肽)，并且是指这些片段中的一个或更多个与MHC分子的缔合(例如，通过结合)用于由细胞例如抗原呈递细胞呈递到特定的T细胞。
术语“涉及抗原的疾病”或“涉及表位的疾病”是指与抗原或表位相关的任何疾病，例如以抗原或表位的存在为特征的疾病。涉及抗原或表位的疾病可以是感染性疾病或癌症疾病或仅是癌症。如上所述，抗原可以是疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原、病毒抗原或细菌抗原，并且表位可源自这样的抗原。
术语“感染性疾病”是指可在个体之间或生物体之间传播并且由微生物原(microbial agent)引起的任何疾病(例如，普通感冒)。感染性疾病是本领域中已知的，并且包括例如病毒性疾病、细菌性疾病或寄生物性疾病，这些疾病分别由病毒、细菌和寄生物引起。在这方面，感染性疾病可以是，例如，肝炎、性传播疾病(例如衣原体或淋病)、肺结核、HIV/获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、白喉、B型肝炎、C型肝炎、霍乱、严重急性呼吸道疾病综合征(SARS)、禽流感和流感。
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于：上皮癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的实例包括骨癌、血癌肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(Hodgkin’s Disease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(central nervous system，CNS)赘生物、神经外胚层癌症、脊椎轴肿瘤(spinal axistumor)、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。根据本公开内容的术语“癌症”还包括癌症转移。
由于产生的协同作用，在癌症治疗中的组合策略可以是理想的，它可比单一治疗方法的影响要强得多。在一个实施方案中，药物组合物与免疫治疗剂一起施用。本文中使用的“免疫治疗剂”涉及可参与活化特异性免疫应答和/或免疫效应物功能的任何药剂。本公开内容考虑了抗体作为免疫治疗剂的用途。不希望受到理论的束缚，抗体可通过多种机制实现针对癌细胞的治疗效果，包括诱导凋亡、阻断信号转导途径的组分或抑制肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体可通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)来诱导细胞死亡，或结合补体蛋白，导致直接的细胞毒性，称为补体依赖性细胞毒性(complement dependentcytotoxicity，CDC)。可与本公开内容组合使用的抗癌抗体和潜在抗体靶标(在括号里)的一些非限制性实例包括：阿巴伏单抗(CA-125)、阿昔单抗(CD41)、阿达木单抗(EpCAM)、阿夫土珠单抗(Afutuzumab)(CD20)、培化阿珠单抗(Alacizumab pegol)(VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(CEA)、阿麦妥昔单抗(Amatuximab)(MORAb-009)、马安那莫单抗(TAG-72)、阿泊珠单抗(HLA-DR)、阿昔莫单抗(CEA)、阿特珠单抗(Atezolizumab)(PD-L1)、巴维昔单抗(磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(CD22)、贝利木单抗(BAFF)、贝伐珠单抗(VEGF-A)、莫比伐单抗(Bivatuzumab mertansine)(CD44 v6)、博纳吐单抗(Blinatumomab)(CD 19)、布妥昔单抗(CD30 TNFRSF8)、莫坎妥珠单抗(黏蛋白CanAg)、雷坎妥珠单抗(MUC1)、卡罗单抗喷地肽(前列腺癌细胞)、卡鲁单抗(Carlumab)(CNT0888)、卡妥索单抗(EpCAM、CD3)、西妥昔单抗(EGFR)、泊西他珠单抗(Citatuzumab bogatox)(EpCAM)、西妥木单抗(IGF-1受体)、克劳西单抗(Claudiximab)(密蛋白)、替坦司可利妥珠单抗(Clivatuzumab tetraxetan)(MUC1)、西他土珠单抗(TRAIL-R2)、达西珠单抗(CD40)、达罗土珠单抗(Dalotuzumab)(胰岛素样生长因子I受体)、地诺单抗(RANKL)、地莫单抗(B-淋巴瘤细胞)、多兹图单抗(Drozitumab)(DR5)、依美昔单抗(GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(EpCAM)、埃罗妥珠单抗(SLAMF7)、依那妥珠单抗(PDL192)、恩司昔单抗(Ensituximab)(NPC-1C)、依帕珠单抗(CD22)、厄妥索单抗(HER2/neu、CD3)、伊瑞西珠单抗(整合素ανβ3)、法勒珠单抗(Farletuzumab)(叶酸受体1)、FBTA05(CD20)、芬克拉妥珠单抗(Ficlatuzumab)(SCH 900105)、芬妥木单抗(Figitumumab)(IGF-1受体)、弗拉伏妥单抗(Flanvotumab)(糖蛋白75)、夫苏木单抗(Fresolimumab)(TGF-β)、加利昔单抗(Galiximab)(CD80)、盖尼塔单抗(IGF-I)、吉妥单抗奥唑米星(CD33)、吉伏珠单抗(Gevokizumab)(ILIβ)、吉瑞妥昔单抗(Girentuximab)(碳酸酐酶9(CA-IX))、格莱木单抗维多汀(Glembatumumab vedotin)(GPNMB)、替伊莫单抗(CD20)、依库单抗(Icrucumab)(VEGFR-1)、伊戈伏单抗(CA-125)、依坦希单抗(Indatuximab ravtansine)(SDC1)、英妥木单抗(Intetumumab)(CD51)、奥英妥珠单抗(CD22)、伊匹单抗(CD 152)、伊妥木单抗(Iratumumab)(CD30)、拉贝珠单抗(CEA)、来沙木单抗(TRAIL-R2)、利韦单抗(乙型肝炎表面抗原)、林妥珠单抗(CD33)、洛妥珠单抗(Lorvotuzumab mertansine)(CD56)、鲁卡木单抗(CD40)、鲁昔单抗(CD23)、马帕木单抗(TRAIL-R1)、马妥珠单抗(EGFR)、美泊利单抗(IL5)、米拉珠单抗(Milatuzumab)(CD74)、米妥莫单抗(GD3神经节苷脂)、莫加珠单抗(Mogamulizumab)(CCR4)、莫妥莫单抗(Moxetumomab pasudotox)(CD22)、他那可单抗(C242抗原)、他那莫单抗(5T4)、纳那妥单抗(Namatumab)(RON)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)(EGFR)、尼妥珠单抗(EGFR)、纳武单抗(IgG4)、奥法木单抗(CD20)、奥拉单抗(Olaratumab)(PDGF-R a)、奥纳珠单抗(Onartuzumab)(人分散因子受体激酶)、莫奥珠单抗(Oportuzumabmonatox)(EpCAM)、奥戈伏单抗(CA-125)、欧西鲁单抗(Oxelumab)(OX-40)、帕尼单抗(EGFR)、帕曲妥单抗(Patritumab)(HER3)、培妥莫单抗(Pemtumoma)(MUC1)、帕妥珠单抗(HER2/neu)、平妥单抗(腺癌抗原)、普托木单抗(波形蛋白)、雷妥莫单抗(Racotumomab)(N-羟乙酰神经氨酸)、雷德图单抗(Radretumab)(纤连蛋白额外结构域-B)、雷韦单抗(狂犬病病毒糖蛋白)、雷莫芦单抗(VEGFR2)、利妥木单抗(Rilotumumab)(HGF)、利妥昔单抗(CD20)、罗妥木单抗(Robatumumab)(IGF-1受体)、沙玛立珠单抗(Samalizumab)(CD200)、西罗珠单抗(FAP)、司妥昔单抗(IL6)、他贝鲁单抗(Tabalumab)(BAFF)、他珠单抗(甲胎蛋白)、帕他普莫单抗(CD 19)、替妥莫单抗(Tenatumomab)(生腱蛋白C)、替妥木单抗(Teprotumumab)(CD221)、西木单抗(CTLA-4)、替加珠单抗(TRAIL-R2)、TNX-650(IL13)、托西莫单抗(CD20)、曲妥珠单抗(HER2/neu)、TRBS07(GD2)、替西木单抗(CTLA-4)、西莫白介素图考珠单抗(Tucotuzumab celmoleukin)(EpCAM)、优利妥昔单抗(Ublituximab)(MS4A1)、乌瑞鲁单抗(Urelumab)(4-1BB)、伏洛昔单抗(整合素α5β1)、伏妥莫单抗(肿瘤抗原CTAA16.88)、扎妥木单抗(EGFR)和扎木单抗(CD4)。
序列
Figure BDA0003779759780000831
Figure BDA0003779759780000841
Figure BDA0003779759780000851
Figure BDA0003779759780000861
本文中所引用的文件和研究的引证并不旨在承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
呈现以下描述以使本领域普通技术人员能够制造和使用多种实施方案。特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文中所述的实例的多种修改对于本领域普通技术人员而言将是明显的，并且在不脱离多种实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可应用于另一些实例和应用。因此，多种实施方案不旨在限于本文中描述和示出的实例，而是与符合权利要求书的范围相一致。
实施例
实施例1：小鼠反应性PD-L1x4-1BB双特异性抗体扩大治疗性RNA疫苗诱导的抗原特异性T细胞应答
为了评估小鼠反应性PD-L1x4-1BB双特异性抗体(bispecific antibody，bsAb)在体内对RNA疫苗诱导的T细胞应答的作用，C57BL/6小鼠(每组n＝5)在第1天用20μg脂质体配制的TRP1 RNA(TRP1RNA-LPX)进行静脉内(i.v.)疫苗接种，并随后在第2天和第5天用50μg、10μg或2μg的小鼠反应性PD-L1x4-1BB bsAb进行腹膜内(i.p.)给药。对照组接受TRP1 RNA疫苗联合50μg同种型对照抗体。TRP1是鼠黑素体抗原酪氨酸相关蛋白-1并且是在B16-F10黑素瘤细胞上以及正常黑素细胞中组成型表达的自身抗原。这种TRP1疫苗的抗肿瘤效力先前已在Kranz,L.M.et al.Nature 534,396–401(2016)中得到证实。在第8天通过流式细胞术(BD FACSCelestaTM,BD Biosciences)测定外周血中的淋巴细胞亚群和TRP1特异性CD8+T细胞应答。如Kranz,L.M.et al.Nature 534,396–401(2016)所述进行胞外染色。
虽然单独的TRP1疫苗接种导致弱的TRP1特异性CD8+T细胞应答(在所有CD8+T细胞中TRP1特异性CD8+T细胞为2.00±0.99％)，但TRP1疫苗与PD-L1x4-1BB bsAb的组合导致TRP1特异性CD8+T细胞的强且显著扩增，这导致在所有CD8+T细胞中TRP1反应性CD8+细胞的频率为22.79±5.68％(50μg/小鼠PD-L1x4-1BB bsAb)(图1A，表1)。由于在经PD-L1x4-1BBbsAb处理的动物中观察到淋巴细胞减少的发作(图1C和D；如先前Niu,L.et al.J Immunol178,4194-4213(2007)对4-1BB激动剂抗体所述)，在经PD-L1x4-1BB bsAb处理的组群和对照组群之间TRP1特异性CD8+T细胞绝对计数的诱导变化不如频率显著，但仍然是显著的，其中每μL血液中TRP1特异性CD8+T细胞为13.12±5.92(同种型对照)与65.48±31.29(50μg/小鼠PD-L1x4-1BB bsAb)(图1B，表1)。PD-L1x4-1BB bsAb处理对外周血中TRP1-四聚体阳性CD8+T细胞频率以及绝对计数的作用相对稳定，或当剂量降低至10μg抗体/小鼠时甚至略微更显著(对于50μg/小鼠和10μg/小鼠组群分别为：每μL血液中所有CD8+T细胞的19.03±3.36％与25.82±1.86％以及TRP1特异性CD8+T细胞70.91±17.31与113.85±17.91)。重要的是要注意，即使在测试的最低剂量(2μg/小鼠)下，与同种型对照相比，观察到每μl血液中TRP1特异性CD8+T细胞显著提高。
表1：第8天外周血中绝对和相对TRP1特异性CD8+T细胞应答
Figure BDA0003779759780000871
Figure BDA0003779759780000881
数据显示为n＝3动物/组群的平均值±标准差
实施例2：小鼠反应性PD-L1x4-1BB双特异性抗体在扩大治疗性RNA疫苗诱导的抗原特异性T细胞应答方面优于抗PD-L1 mAb
为了比较小鼠反应性PD-L1x4-1BB双特异性抗体(bsAb)和经典抗PD-L1检查点阻断单克隆抗体(mAb)在体内对RNA疫苗诱导的T细胞应答的作用，C57BL/6只小鼠(每组n＝5)在第1天用20μg脂质体配制的TRP1 RNA(TRP1 RNA-LPX)进行i.v.疫苗接种，并随后在第2天用50μg小鼠反应性PD-L1x4-1BB bsAb或抗PD-L1 mAb(克隆MPDL3280A)进行腹膜内(i.p.)给药。对照组接受TRP1 RNA疫苗联合50μg同种型对照抗体。如实施例1所述，在第8天通过流式细胞术(BD FACSCelestaTM,BD Biosciences)测定外周血中的淋巴细胞亚群和TRP1特异性CD8+T细胞应答。
单独的TRP1疫苗接种导致弱的TRP1特异性CD8+T细胞应答，其无法通过RNA疫苗与抗PD-L1抗体的组合来扩大(在所有CD8+T细胞中TRP1特异性CD8+T细胞分别是2.21±1.47％与1.78±0.42％)。相比之下，与同种型对照和抗PD-L1处理的组群二者相比，TRP1疫苗与PD-L1x4-1BB bsAb的组合导致TRP1特异性CD8+T细胞显著扩增，这导致在所有CD8+T细胞中TRP1反应性CD8+细胞的频率为9.51±3.67％(图2A，表2)。由于在经PD-L1x4-1BB bsAb处理的动物中观察到淋巴细胞减少的发作(图2C和D；如先前Niu,L.et al.J Immunol 178,4194-4213(2007)对4-1BB激动剂抗体所述)，在经PD-L1x4-1BB bsAb处理的组群和抗PD-L1以及对照组群之间TRP1特异性CD8+T细胞绝对计数的诱导变化不如频率显著。然而，当将经PD-L1x4-1BB bsAb处理的组群与经抗PD-L1处理的组群相比时，变化仍然是显著的，其中每μL血液中TRP1特异性CD8+T细胞为28.59±12.88(PD-L1x4-1BB bsAb)与8.45±0.90(抗PD-L1mAb)(图2B，表2)。
表2：第8天外周血中绝对和相对TRP1特异性CD8+T细胞应答
Figure BDA0003779759780000891
数据显示为n＝3动物/组群的平均值±标准差
实施例3：小鼠反应性PD-L1x4-1BB双特异性抗体联合治疗性RNA疫苗在鼠黑素瘤模型B16中增强抗肿瘤免疫
在下一步中，我们表征了小鼠反应性PD-L1x4-1BB bsAb提高RNA疫苗在体内的治疗性抗肿瘤效力的功效。C57BL/6小鼠用3×105B16-F10黑素瘤细胞进行皮下(s.c.)接种，并在第8、15和22天用20μg TRP1RNA-LPX或不相关的RNA-LPX作为对照进行i.v.疫苗接种。两个经疫苗接种的组群在第9、12、16、19、23和26天用50μg PD-L1x4-1BB bsAb或同种型对照抗体进行i.p.处理，得到四个处理组，每组n＝10只动物。如实施例1所述，在前两次处理之后7天(第15天和第22天)通过流式细胞术测定血液淋巴细胞亚群和TRP1特异性T细胞应答。将抗肿瘤效力确定为与对照组相比测试组中的肿瘤生长抑制以及在肿瘤接种之后长达90天的观察期内的总体存活。
与用同种型对照和不相关的RNA疫苗处理的对照组相比，单独的TRP1疫苗接种显示出中等的治疗效力，有3/10的初始应答者，其中2/3最终死于复发。对照组群的其余动物表现出适度的肿瘤生长降低和中位存活提高的趋势(图3A，B)。相比之下，PD-L1x4-1BBbsAb单一治疗导致2/10(20％)的动物对肿瘤的完全排斥，然而，其余动物未表现出中位存活提高。最重要的是，PD-L1x4-1BB bsAb处理受益于同时进行的TRP1疫苗接种，导致与每种单独治疗相比进一步降低肿瘤生长并提高存活。在用PD-L1x4-1BB bsAb与TRP1疫苗联合治疗的动物中，4/10(40％)表现出对其肿瘤的完全排斥。
仅用PD-L1x4-1BB bsAb的处理不会诱导TRP1特异性CD8+T细胞，而TRP1疫苗接种导致在第一次疫苗接种之后弱的TRP1特异性CD8+T细胞应答(22.41±15.27TRP1特异性CD8+T细胞)，其可通过第二次疫苗接种显著增强(图4A至C；102.01±67.17TRP1特异性CD8+T细胞)。PD-L1x4-1BB bsAb与TRP1疫苗的组合在第一次疫苗接种之后就已经强烈提高了TRP1特异性CD8+T细胞数量，当与单独的TRP1疫苗接种相比时，在外周血中可检测到的TRP1特异性CD8+T细胞数量高>10倍(与22.41±15.27相比，386.60±181.04)。在第二次TRP1疫苗接种和抗体处理周期之后，TRP1特异性CD8+T细胞数量下降至201.32±59.73，然而，与TRP1疫苗接种单一治疗中的TRP1特异性T细胞应答相比仍然是优异的。如前所观察到的(实施例1和2，图1C至D，图2C至D)，PD-L1x4-1BB bsAb处理导致在第一次疫苗接种之后第7天在两个经PD-L1x4-1BB bsAb处理的组群中出现短暂的淋巴细胞减少。重要的是，淋巴细胞计数在第2次疫苗接种之后7天恢复到基线(图4D)。
总之，PD-L1x4-1BB bsAb作为单一治疗在低免疫原性肿瘤模型中在一定程度上也是有效的，并通过扩大疫苗诱导的T细胞应答与T细胞疫苗接种协同作用。
序列表
<110> BioNTech SE
<120> 涉及抗原疫苗接种以及与PD-L1和CD137结合的结合剂的治疗
<130> 674-296/1 PCT2
<150> PCT/EP2020/052774
<151> 2020-02-04
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区（VH）
<400> 1
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asp Tyr Trp
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Asp Val Gly Gly Ser Leu Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly
85 90 95
Leu Thr Tyr Gly Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 2
Gly Phe Ser Leu Asn Asp Tyr Trp
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 3
Ile Asp Val Gly Gly Ser Leu
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 4
Ala Arg Gly Gly Leu Thr Tyr Gly Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 5
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区（VL）
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ala Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Tyr Tyr Ala Thr Ile Ser Gly
85 90 95
Leu Gly Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 6
Glu Asp Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 7
His Tyr Tyr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Gly Val Ala
1 5 10
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区（VH）
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Val Gly Gly Ser Leu Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Leu Thr Tyr Gly Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区（VL）
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Tyr Tyr Ala Thr Ile Ser Gly
85 90 95
Leu Gly Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区（VH）
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Pro Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Phe Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Arg Gly Tyr Asn Tyr Gly Ser Phe Gln His Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 11
Gly Ser Thr Phe Ser Thr Tyr Ala
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 12
Phe Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr
1 5
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 13
Ala Ile Pro Ala Arg Gly Tyr Asn Tyr Gly Ser Phe Gln His
1 5 10
<210> 14
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区（VL）
<400> 14
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Leu Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 15
Asn Ile Gly Ser Lys Ser
1 5
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 16
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val
1 5 10
<210> 17
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链恒定区（CH）
<400> 17
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 18
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链恒定区（CH）
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链恒定区（CL）
<400> 19
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 20
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链恒定区（CL）
<400> 20
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 21
<211> 290
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 22
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 23
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu
165 170 175
Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg
180 185 190
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
195 200 205
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
210 215 220
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
225 230
<210> 24
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区（VH）
<400> 24
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Phe His
20 25 30
Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Thr Ile Ile Thr Ser Ala Ser Thr Thr Ala Tyr Ala Thr Trp Ala Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ser Ser Thr Thr Val Asn Leu Lys Ile
65 70 75 80
Val Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser
85 90 95
Thr Tyr Thr Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 25
Gly Phe Thr Ile Ser Asp Phe His
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 26
Ile Ile Thr Ser Ala Ser Thr Thr
1 5
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 27
Ala Arg Ser Thr Tyr Thr Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe
1 5 10 15
<210> 28
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区（VL）
<400> 28
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Ile Ile Asn Cys Gln Ser Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Gly
20 25 30
Asn Arg Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Ala Ile Ser Asp Val
65 70 75 80
Gln Ser Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys
85 90 95
Asp Ser Ala Asp Cys Phe Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val
100 105 110
Glu
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 29
Gln Ser Ile Tyr Asn Gly Asn Arg
1 5
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补决定区（CDR）
<400> 30
Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Asp Ser Ala Asp Cys Phe Ala
1 5 10

Claims (70)

1.用于治疗对象的方法，其包括向所述对象施用：
a.肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸，所述肽或蛋白质包含用于在所述对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位；和
b.结合剂或者编码所述结合剂的多核苷酸，所述结合剂包含与PD-L1结合的第一抗原结合区和与CD137结合的第二抗原结合区。
2.权利要求1所述的方法，其中所述对象是人。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述PD-L1是人PD-L1和/或所述CD137是人CD137。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区抑制人PD-L1与人PD-1的结合。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:13所示序列的HCDR3。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:12所示序列的HCDR2。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:11所示序列的HCDR1。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的序列。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有SEQ ID NO:16所示序列的LCDR3。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有序列DDN的LCDR2。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有SEQ ID NO:15所示序列的LCDR1。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含SEQ ID NO:15、DDN和SEQ ID NO:16所示的序列。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含SEQ ID NO:15、DDN和SEQ ID NO:16所示的序列。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:10所示VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含SEQ ID NO:10所示的序列。
16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:14所示VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
17.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含SEQ ID NO:14所示的序列。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO:10所示的序列并且所述VL包含SEQ ID NO:14所示的序列。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述与PD-L1结合的第一抗原结合区包含抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体与包含权利要求5至18中任一项所示重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的抗体竞争PD-L1结合和/或具有其针对PD-L1的特异性。
20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:4所示序列的HCDR3。
21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:3所示序列的HCDR2。
22.权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:2所示序列的HCDR1。
23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列。
24.权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有SEQ ID NO:7所示序列的LCDR3。
25.权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有序列GAS的LCDR2。
26.权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有SEQ ID NO:6所示序列的LCDR1。
27.权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含SEQ ID NO:6、GAS和SEQ ID NO:7所示的序列。
28.权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含SEQ ID NO:6、GAS和SEQ ID NO:7所示的序列。
29.权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8所示VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
30.权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:8所示的序列。
31.权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9所示VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
32.权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9所示的序列。
33.权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO:1所示的序列并且所述VL包含SEQ ID NO:5所示的序列。
34.权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO:8所示的序列并且所述VL包含SEQ ID NO:9所示的序列。
35.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:27所示序列的HCDR3。
36.权利要求1至19和35中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:26所示序列的HCDR2。
37.权利要求1至19、35和36中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含具有SEQ ID NO:25所示序列的HCDR1。
38.权利要求1至19和35至37中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示的序列。
39.权利要求1至19和35至38中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有SEQ ID NO:30所示序列的LCDR3。
40.权利要求1至19和35至39中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有序列SAS的LCDR2。
41.权利要求1至19和35至40中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含具有SEQ ID NO:29所示序列的LCDR1。
42.权利要求1至19和35至41中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含SEQ ID NO:29、SAS和SEQ ID NO:30所示的序列。
43.权利要求1至19和35至42中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列，所述轻链可变区(VL)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3序列分别包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示的序列，并且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3序列分别包含SEQ ID NO:29、SAS和SEQ ID NO:30所示的序列。
44.权利要求1至19和35至43中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:24所示VH序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
45.权利要求1至19和35至44中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含SEQ ID NO:24所示的序列。
46.权利要求1至19和35至45中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:28所示VL序列的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性的序列。
47.权利要求1至19和35至46中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含SEQ ID NO:28所示的序列。
48.权利要求1至19和35至47中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含SEQ ID NO:24所示的序列并且所述VL包含SEQ ID NO:28所示的序列。
49.权利要求1至48中任一项所述的方法，其中所述与CD137结合的第二抗原结合区包含抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体与包含权利要求20至48中任一项所示重链可变区和/或轻链可变区的抗体竞争CD137结合和/或具有其针对CD137的特异性。
50.权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述结合剂是全长抗体的形式。
51.权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述结合剂是抗体片段的形式。
52.权利要求1至51中任一项所述的方法，其中所述结合剂是多特异性抗体，例如双特异性抗体。
53.权利要求1至52中任一项所述的方法，其中所述肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸与所述结合剂或编码所述结合剂的多核苷酸依次施用，所述肽或蛋白质包含用于在所述对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
54.权利要求1至53中任一项所述的方法，其中在施用所述肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸之后施用所述结合剂或编码所述结合剂的多核苷酸，所述肽或蛋白质包含用于在所述对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
55.权利要求1至54中任一项所述的方法，其中在施用所述肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸之后6小时或更晚、12小时或更晚或者24小时或更晚施用所述结合剂或编码所述结合剂的多核苷酸，所述肽或蛋白质包含用于在所述对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
56.权利要求1至55中任一项所述的方法，其中在施用所述肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸之后的12小时至48小时施用所述结合剂或编码所述结合剂的多核苷酸，所述肽或蛋白质包含用于在所述对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
57.权利要求1至56中任一项所述的方法，其中编码所述肽或蛋白质的多核苷酸和/或编码所述结合剂的多核苷酸是RNA，所述肽或蛋白质包含用于在所述对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
58.权利要求1至57中任一项所述的方法，其包括向所述对象施用：
a.编码所述肽或蛋白质的RNA，所述肽或蛋白质包含用于在所述对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位；和
b.所述结合剂。
59.权利要求1至58中任一项所述的方法，其中施用所述结合剂或编码所述结合剂的多核苷酸提高了针对所述抗原或表达所述抗原的细胞具有特异性的CD8阳性T细胞的数量。
60.权利要求1至59中任一项所述的方法，其是用于在所述对象中诱导免疫应答的方法。
61.权利要求1至60中任一项所述的方法，其是用于在所述对象中诱导针对所述抗原或表达所述抗原的细胞的免疫应答的方法。
62.权利要求1至61中任一项所述的方法，其是用于在所述对象中治疗或预防癌症的方法，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。
63.药物制剂，其包含：
a.肽或蛋白质或者编码所述肽或蛋白质的多核苷酸，所述肽或蛋白质包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位；和
b.结合剂或编码所述结合剂的多核苷酸，所述结合剂包含与PD-L1结合的第一抗原结合区和与CD137结合的第二抗原结合区。
64.权利要求63所述的药物制剂，其包含：
a.编码所述肽或蛋白质的RNA，所述肽或蛋白质包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位；和
b.所述结合剂。
65.权利要求63或64所述的药物制剂，其是药盒。
66.权利要求63至65中任一项所述的药物制剂，其包含在单独的容器中的各组分a.和b.。
67.权利要求63至66中任一项所述的药物制剂，其还包含所述药物制剂用于治疗或预防癌症的使用说明，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。
68.权利要求63至67中任一项所述的药物制剂，其用于医药用途。
69.权利要求68所述的药物制剂，其中所述医药用途包括疾病或病症的治疗性或预防性治疗。
70.权利要求63至69中任一项所述的药物制剂，其用于在对象中治疗或预防癌症的方法中，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL311771A (en) * 2021-10-06 2024-05-01 BioNTech SE Multispecific binding agents against PD-L1 and CD137 in combination

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU675916B2 (en) 1991-06-14 1997-02-27 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0979281B1 (en) 1997-05-02 2005-07-20 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20100081792A1 (en) 2001-06-28 2010-04-01 Smithkline Beecham Corporation Ligand
KR20040088572A (ko) 2002-03-01 2004-10-16 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 제거율 증강을 위한 양특이성 항체 점 돌연변이들
PT1523496E (pt) 2002-07-18 2011-09-29 Merus B V Produção de misturas de anticorpos de forma recombinante
KR20060041205A (ko) 2003-07-01 2006-05-11 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 양특이성 항체들의 다가 담체들
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
US7741568B2 (en) 2005-01-13 2010-06-22 The Wiremold Company Downward facing receptacle assembly for cable raceway
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1973576B1 (en) 2005-11-28 2019-05-15 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
KR101516823B1 (ko) 2006-03-17 2015-05-07 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 안정화된 폴리펩티드 조성물
WO2007110205A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
CN104497143B (zh) 2007-03-29 2020-08-25 健玛保 双特异性抗体及其制造方法
CA2691434C (en) 2007-06-21 2020-07-21 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
EP2535350B1 (en) 2007-09-26 2018-01-24 UCB Biopharma SPRL Dual specificity antibody fusions
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
EP2235064B1 (en) 2008-01-07 2015-11-25 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
WO2010015792A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Argenta Discovery Limited Nitrogen containing heterocyclic compounds useful as bifunctional modulators of m3 receptors and beta-2 receptors
JP5397668B2 (ja) 2008-09-02 2014-01-22 ソニー株式会社 記憶素子および記憶装置
US8927694B2 (en) 2008-11-18 2015-01-06 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
RU2744176C2 (ru) 2008-12-19 2021-03-03 Макродженикс, Инк. Ковалентные диантитела и их применение
MX2011009810A (es) 2009-03-27 2011-09-30 Zymogenetics Inc Composiciones y metodos para usar proteinas de union multiespecificas que comprenden una combinacion anticuerporeceptor.
ES2708124T3 (es) 2009-04-27 2019-04-08 Oncomed Pharm Inc Procedimiento para preparar moléculas heteromultiméricas
KR101224468B1 (ko) 2009-05-20 2013-01-23 주식회사 파멥신 신규한 형태의 이중표적항체 및 그 용도
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
EA030792B1 (ru) 2009-11-30 2018-09-28 Янссен Байотек, Инк МУТИРОВАННЫЕ Fc АНТИТЕЛ С УСТРАНЕННЫМИ ЭФФЕКТОРНЫМИ ФУНКЦИЯМИ
RU2016105962A (ru) 2009-12-04 2018-11-23 Дженентек, Инк. Мультиспецифические антитела, аналоги антител, композиции и способы
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
CN103097417B (zh) 2010-04-20 2019-04-09 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
JP6022444B2 (ja) 2010-05-14 2016-11-09 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法
ES2537207T3 (es) 2010-08-16 2015-06-03 Novimmune S.A. Métodos para la generación de anticuerpos multiespecíficos y multivalentes
WO2012025530A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
CN103068847B (zh) 2010-08-24 2019-05-07 罗切格利卡特公司 可活化的双特异性抗体
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
CN102250246A (zh) 2011-06-10 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用
HUE044633T2 (hu) 2011-10-27 2019-11-28 Genmab As Heterodimer fehérjék elõállítása
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
SI2838918T1 (sl) 2012-04-20 2019-11-29 Merus Nv Postopki in sredstva za proizvodnjo heterodimernih IG-podobnih molekul
US9963512B2 (en) 2012-11-21 2018-05-08 Pharmabcine Inc. Dual-target antibody targeting VEGFR-2 and DLL4, and pharmaceutical composition including same
WO2016005004A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stabilization of poly(a) sequence encoding dna sequences
CA3071211A1 (en) * 2017-08-04 2019-02-07 Genmab A/S Binding agents binding to pd-l1 and cd137 and use thereof
EP3470426A1 (en) * 2017-10-10 2019-04-17 Numab Therapeutics AG Multispecific antibody

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