CN115066228A

CN115066228A - 包含丝瓜根提取物的组合物

Info

Publication number: CN115066228A
Application number: CN202180013540.1A
Authority: CN
Inventors: M·弗来彻特; H·查杰拉; A·圭劳敏
Original assignee: Clariant International Ltd; Plant Advanced Technologies PAT SAS
Current assignee: Clariant International Ltd; Plant Advanced Technologies PAT SAS
Priority date: 2020-02-25
Filing date: 2021-02-24
Publication date: 2022-09-16
Also published as: WO2021170618A1; EP4110278A1; US20230147977A1; JP2023516927A

Abstract

本发明涉及植物丝瓜的根提取物，其中所述根提取物富含泻根醇酸，其中相对于干提取物的总重量，泻根醇酸占至少10重量％。本发明还涉及包含所述根提取物的组合物。

Description

包含丝瓜根提取物的组合物

发明领域

本发明涉及富含泻根醇酸(bryonolic acid)的植物丝瓜(Luffa cylindrica)的根提取物、制备富集的根提取物的方法和包含富集的根提取物作为活性成分的美容或皮肤病学或营养食品组合物。本发明的另一个主题涉及所述富集的根提取物或包含所述富集的根提取物作为活性成分的组合物的用途，用于恢复失调的生物能量功能(刺激皮肤能量代谢)，用于甚至在疲劳细胞中恢复细胞活力，用于预防由毒性剂诱导的应激，用于预防氧化应激，更一般地用于预防和/或延迟衰老迹象和用于供给皮肤细胞能量，用于调节参与免疫应答、皮肤炎症、皮肤神经元生理机能、皮肤代谢调节、伤口愈合和皮肤应激反应的皮肤异位嗅觉受体(OR)表达。

发明背景

皮肤是人体的第一道屏障。它保护器官免受温度和湿度差异以及免受外部环境(如紫外线或污染物)的损害。然而，过度的化学和物理刺激(暴露于日光、光或UV；应激和营养不良)使皮肤的正常功能退化并诱导其衰老。因此，重要的是通过刺激构成皮肤的细胞的代谢并且特别是细胞能量代谢来维持皮肤更新和修复。具体地，在细胞中，能量尤其用于产生新蛋白质、供应营养物、排出细胞废物和修复DNA损伤。

生物能量过程功能对于维持包括皮肤在内的所有器官的良好性能是至关重要的。在细胞水平上，三个关键的代谢途径：糖酵解、戊糖-磷酸途径和三羧酸(TCA)循环是相互关联的并构成细胞代谢的第一阶段(Respiratory metabolism:glycolysis,the TCA cycleand mitochondrial electron transport,Current Opinion in Plant Biology(2004))。

糖酵解描述了将葡萄糖转化为丙酮酸和氢离子的代谢途径。在这个过程中释放的自由能用于形成高能分子ATP(三磷酸腺苷)和NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。NADH通过接受和供给电子在能量代谢中起关键作用。在线粒体的基质中发生的TCA循环由许多反应组成，其产生NADH和还原的黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH₂)，其又可以被氧化磷酸化途径用于产生ATP。与NADH一样，FADH2也被认为是用于细胞代谢的高能分子。实际上，NADH和FADH2可以将其电子贡献给电子传递链的电子载体，以驱动引起ATP产生的氧化磷酸化。另外，TCA循环是许多代谢途径的中心，并且因此必须始终存在其活性所需的中间体的大量供应。

例如，草酰乙酸(其可以由先前在糖酵解过程中产生的丙酮酸合成)是氨基酸天冬氨酸的直接前体。这种氨基酸对于蛋白质合成是重要的。来自糖酵解的丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶复合物的作用进入TCA循环。发生在胞质溶胶中的戊糖磷酸途径氧化葡萄糖以产生NADPH和其他用于生物合成的碳水化合物。

如上详细描述的，这三种途径产生通过氧化磷酸化过程产生线粒体ATP所需的代谢物。线粒体是这个过程中心的不可或缺的细胞器(organite)。所有这些系列的能量转换被称为细胞呼吸，并且其良好的功能保证了皮肤细胞健康。

实际上，虽然糖酵解发生在细胞质中，但TCA循环发生在线粒体中。因此，来自糖酵解的溶质和代谢物必须通过线粒体膜转运，以便在TCA循环中被接收。该作用由SLC25确保，SLC25是旨在使多种代谢物穿梭穿过线粒体膜的特定转运蛋白家族。

已经证明了为线粒体提供氧化磷酸化底物、无机磷酸盐和ADP的这些SLC25线粒体载体的缺陷引起以能量产生缺陷为特征的疾病(Diseases Caused by Defects ofMitochondrial Carriers：A Review，Biochimica et Biophysica Acta，2008)。Mitochondrial transporters of the SLC25 family and associated diseases:areview，J Inherit Metab Dis.2014年7月；37(4)：565-75，2014)。其中，SLC25A12，一种苹果酸-天冬氨酸穿梭物，被描述为负责将糖酵解期间产生的NADH线粒体转运到线粒体中以供应TCA循环。

因此，SLC25A12在将糖酵解与TCA和氧化磷酸化代谢途径联系起来方面起着至关重要的作用。

环境损害和应激积累导致能量代谢耗尽，从而影响整体代谢(Reprogramming ofenergy metabolism as a driver of aging,Oncotarget.(2016))。此外，已经在几种疾病中描述了线粒体功能障碍，并且与衰老高度相关(López-Otín等，2013,DanielSchniertshauer等，Age-Dependent Loss of Mitochondrial Function in EpithelialTissue Can Be Reversed by Coenzyme Q10,J Aging Res,2018)。这种功能障碍是由外源性有害应激(紫外线、污染...)诱发的改变引起的，而且也是由氧化磷酸化过程本身产生的内源性活性氧(ROS)引起的。在年轻且代谢上“健康的”细胞中，抗氧化系统确保可接受的ROS量的管理，以维持有效的细胞呼吸和ATP的产生，从而有效地对任何威胁做出反应(BeeLing Tan等，2018)。在衰老的细胞中，这些系统随着积累的内部和外部应力而不堪重负。

因此，较少产生整体细胞代谢功能所需的能量，这导致不平衡的稳态和异常的蛋白质产生程序。这可能导致与特征性衰老皮肤体征相关的显著后果。特别地，胞外基质是由皮肤细胞合成并赋予皮肤紧致度和弹性的大分子的复杂布局。这些大分子通过内质网(ER)然后是高尔基体产生，它们在其分泌之前在内质网(ER)和高尔基体中合成并成熟。SLC35是核苷酸糖和腺苷3'-磷酸5'-磷酸硫酸酯(PAPS)进入高尔基体和ER的特异性转运蛋白家族，并因此在基质大分子的成熟中具有不可或缺的作用(Molecular physiology andpathology of the nucleotide sugar transporter family(SLC35),Eur J Physiol,2004)。

丝瓜(sponge gourd)，也称为丝瓜(loofah)(丝瓜(Luffa cylindrica)，葫芦科)，是一年生蔬菜旱地作物，其起源于印度和南亚，并且主要分布在热带到暖温带地区。在中国，该植物的各个部分，包括花、果实、种子、叶和根，用于缓解或减轻炎症，如咽炎、鼻炎、乳腺炎、水肿、肿胀、烧伤和痔疮。

泻根醇酸(bryonolic acid)是一种五环三萜类化合物，于1960年从泻根(Bryoniadioica Jacq.)(葫芦科)的根中首次分离得到，之后从丝瓜的根和培养的细胞中分离得到。Roem.Hi Jai Cho等(Formation of bryonolic acid in cucurbitaceous plants andtheir cell cultures,phytochemistry,vol.31,No.11,pp.3893-3896,1992)研究了属于9个属的21个葫芦科植物种或变种及其细胞培养物产生泻根醇酸的能力。除了其中两个之外，在所有研究的物种中都发现了泻根醇酸，其仅位于成熟植物的根中或幼苗的胚根中。

先前已经报道了泻根醇酸的一些生物活性，包括在啮齿动物中的抗过敏特性和在多种癌细胞系中的多种细胞毒性和抗肿瘤活性(Tadahiro Takeda等的“Bryonolic acidproduction in hairy roots of Trhichosanthes kirilowii Max.var.japonicatransformed with Agrobacterium rhizogenes and its cytotoxic activity”(1994))。在她的论文中，Emily Clegg Barker(The isolation and biological evaluation ofanti-inflammatory and chemopreventive triterpenoid natural products，第2章，pp.64-85，2015年5月)显示了泻根醇酸呈现出抗炎和抗氧化活性，如通过其对血红素加氧酶-1表达的强烈诱导所证明的。

一方面，由此确定了泻根醇酸呈现出令人感兴趣的生物活性，其可以例如在美容领域中发挥作用。另外，泻根醇酸仅存在于某些葫芦科物种的根中，如丝瓜属(Luffa)、黄瓜属(Cucumis)和冬瓜属(Benincasa)物种，更特别是丝瓜。因此，能够取得所述植物的根以获得这种感兴趣的化合物是有利的。但是，该操作涉及全部或部分植物的破坏。此外，名古屋议定书(Nagoya protocol)和国际标准(ISO 26000)提供了指导方针，以控制对生物多样性的获取并确保可持续发展和社会责任。

另一方面，上述葫芦科物种的天然根提取物含有泻根醇酸，但其浓度不足以产生显著和令人满意的结果，特别是在美容和/或皮肤病学领域中。

JP-3659424B2描述了一种含有来自丝瓜根提取物的泻根醇酸的组合物，其用于伤口愈合、用于促进细胞生长和用于促进皮肤舒缓。JP-5946717B2公开了可以从丝瓜提取的泻根醇酸，其用于促进III型胶原蛋白的产生和用于促进皮肤上的伤口愈合。此外，EP-0359196A2公开了一种包含丝瓜提取物的局部制剂，用于保湿、用于增白、用于消除皱纹和用于防止皱纹形成。JP-S62226912A2公开了一种组合物，其包含通过农杆菌属感染产生的葫芦科植物的培养物诱导根的提取物。这种提取物可用于皮肤保湿或用于改善细纹，然而，说明书没有提及该途径。此外，JP-2019034899A2公开了一种包含丝瓜果实和茎提取物的组合物，其不含泻根醇酸，用于通过抑制弹性蛋白酶活性作为途径来防止皱纹形成。

JP-H07109214A涉及一种皮脂分泌促进剂，其包含来自葫芦科植物的培养细胞的泻根醇酸。

JP-2009256271A提供了一种来自丝瓜地上部分的提取物，用于促进水通道蛋白表达，然后赋予皮肤水合的能力。此外，CN-107773470A公开了一种基于丝瓜提取物的面膜，其能够使皮肤保湿。

JP-H11240823A公开了一种含有丝瓜提取物的组合物，用于促进毛发乳头生长。

JP-4716692B2公开了一种基于乙醇丝瓜根提取物的组合物，其具有抑制红斑UV的优异抗炎作用。

KR-101256180B1公开了一种含有丝瓜籽提取物作为活性成分的皮肤增白组合物，其能够抑制黑色素细胞中的酪氨酸酶活性。

尽管葫芦科物种(如丝瓜)的根提取物作为活性成分是可利用的，但仍然需要一种新的美容和/或皮肤病学和/或营养食品活性成分，其由所述植物的改进的根提取物组成，富含泻根醇酸。这种富集的根提取物还遵循可持续发展的原则、社会和环境条款获得，意指在保留植物的情况下获得。

还需要新的美容或皮肤病学或营养食品组合物，其包含至少一种富含泻根醇酸的丝瓜根提取物作为活性成分。有利地，所述富集的丝瓜根提取物作为活性成分能够呈现出迄今为止从未获得和描述的美容和/或皮肤病学效果。

已经令人惊奇地发现了例如通过在特定条件下培养所述植物，可以增加丝瓜根中的泻根醇酸的量。本发明人已经证明了在特定条件下培养所述植物允许在其根内富集大量的泻根醇酸。富含泻根醇酸的所述根的提取物可以有利地用作美容和/或皮肤病学和/或营养食品领域中的活性成分。此外，与现有技术中描述的那些相比，富集的丝瓜根提取物突出和达到的生物学目标和途径允许获得全面的皮肤有益效果。实际上，已经证明了富含泻根醇酸的丝瓜根提取物能够通过调节线粒体转运蛋白SLC25来刺激皮肤能量代谢，通过刺激谷胱甘肽s-转移酶θ2、谷胱甘肽过氧化物酶2和3来上调内在抗氧化系统，通过增强过氧化物氧化还原蛋白-2(peroxiredoxin-2)来去除过氧化物的毒性，有效恢复由环境应激物改变的细胞生物能量曲线，通过刺激I型和IV型胶原蛋白表达和弹性纤维来改善皮肤结构和/或减少皱纹和细纹。

根据本发明的丝瓜根提取物以及通过根据本发明的方法获得的丝瓜根提取物出乎意料地呈现出皮肤有益效果，特别是用于基于恢复细胞和线粒体生物能量功能来促进细胞健康和使皮肤恢复活力，同时刺激内源性抗氧化性质以增强整体细胞代谢并最终刺激胞外基质大分子。换句话说，根据本发明的丝瓜根提取物以及通过根据本发明的方法获得的丝瓜根提取物例如适用于刺激和/或恢复皮肤能量代谢，用于恢复细胞活力(甚至在疲劳细胞中)，用于诱导皮肤对抗外部因素(毒性剂、暴露于太阳或UV、暴露于光、应激、营养不良)的保护性反应，用于预防氧化应激，更一般地用于预防和/或延迟衰老迹象，以及用于改善皮肤的紧致性、张力和弹性。

发明概述

本发明涉及植物丝瓜的根提取物，其中所述根提取物包含泻根醇酸，其中相对于干提取物的总重量，泻根醇酸占至少10重量％。

本发明还涉及一种制备植物丝瓜的根提取物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在无土条件下，特别是通过气培，栽培丝瓜的步骤，

b)任选地刺激所述植物的根的步骤，

c)通过任选地在步骤b)中刺激的根的根浸渍进行固/液提取的步骤，

d)回收步骤c)中获得的提取物，和

e)任选地，通过连续过滤，特别是通过澄清过滤和/或灭菌过滤，稀释和/或澄清步骤d)中回收的提取物的步骤。

本发明还涉及美容或皮肤病学或营养食品组合物，其包含如上定义的植物丝瓜的根提取物，和任选的一种或多种赋形剂，其优选是美容学或皮肤病学或营养食品学上可接受的。

本发明还涉及如上定义的植物丝瓜的根提取物或包含如上定义的植物丝瓜的根提取物的组合物，其用于刺激和/或恢复皮肤能量代谢，恢复细胞活力(甚至在疲劳细胞中)，诱导皮肤对抗外部因素的保护性反应，防止氧化应激，防止和/或延迟衰老迹象，和/或改善皮肤的紧致度、张力和/或弹性。

本发明还涉及如上定义的植物丝瓜的根提取物或包含如上定义的植物丝瓜的根提取物的组合物(优选美容组合物)用于刺激和/或恢复皮肤能量代谢、恢复细胞活力(甚至在疲劳细胞中)、诱导皮肤对抗外部因素的保护性反应、防止氧化应激、防止和/或延迟衰老迹象和/或改善皮肤的紧致度、张力和/或弹性的用途。

本发明还涉及用于预防或延迟皮肤衰老效应出现的美容护肤方法，所述方法包括在身体或面部皮肤的至少一部分上施用如上定义的美容组合物。

本文引用或参考的所有文献(“本文引用的文献”)和本文引用的文献中引用或参考的所有文献，以及本文或通过引用并入本文的任何文献中提及的任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品规格和产品页，在此通过引用并入本文，并且可以用于本发明的实施中。更具体地，所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个单独的文献被具体和单独地指出通过引用并入。

附图说明

图1：Seahorse XF细胞线粒体应激测试曲线(生物能量曲线)

图2显示了在应激物(溶剂)存在或不存在的情况下，在含有或不含根据本发明的包含富含泻根醇酸的丝瓜根提取物的美容组合物的情况下，44岁成纤维细胞的SeahorseXF细胞线粒体应激测试曲线(n＝3)。呼吸曲线。NT用于非应激细胞(对照成纤维细胞)。

图3显示了在HES(苏木精-伊红-藏红花)染色后对福尔马林固定的石蜡包埋的皮肤切片进行的皮肤形态学观察。用含有0(安慰剂)、0.125％、0.5％和1％的根据本发明的富含泻根醇酸的丝瓜根提取物的配方处理7天的皮肤外植体模型。真皮致密化通过黄色染色显示。比例尺：100μm。

图4显示了在改良的Verhoeff染色后在福尔马林固定的石蜡包埋的皮肤切片上进行的弹性纤维染色。用含有0(安慰剂)、0.125％、0.5％和1％的根据本发明的富含泻根醇酸的丝瓜根提取物的配方处理7天的皮肤外植体模型。弹性纤维呈深色。细胞核被染成蓝色。比例尺：100μm。

图5显示了在每天两次施用根据本发明的包含1％的富含泻根醇酸的丝瓜根提取物的配方或安慰剂配方后，用皮肤弹性测定仪(cutometer)在老年志愿者的面部皮肤上测量的皮肤生物力学性质。皮肤紧致度(R0)、皮肤张力(Ur)、皮肤弹性(Ue和R6)。结果相对于第0天并与安慰剂组相比来表示。统计学：ANOVA与Dunnett比较。***：P<0.005，**：P<0.01，*：P<0.05。

发明详述

本发明的第一个主题涉及植物丝瓜的根提取物，其中所述根提取物包含泻根醇酸，其中相对于干提取物的总重量，泻根醇酸占至少10重量％。

根据本发明的一个实施方案，相对于干提取物的总重量，泻根酸占至少15重量％，优选至少20重量％，至少25重量％，至少30重量％，至少35重量％，至少40重量％，至少45重量％，至少50重量％，至少55重量％或至少60重量％。

根据本发明的一个实施方案，所述根提取物为液体形式，并且包含选自肉豆蔻酸异丙酯、甘油三酯、柠檬酸三乙酯、二辛基醚、异硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、乙酸乙酯、植物油或其混合物的浸渍溶剂。优选地，溶剂是二辛基醚。更优选地，浸渍溶剂是生物基二辛基醚。这种液体根提取物对应于在无土条件下(特别是通过气培)栽培丝瓜的步骤a)、刺激所述植物的根的任选步骤b)、通过在步骤b)中任选地刺激的根的根浸渍进行固/液提取的步骤c)以及回收步骤c)中获得的提取物的步骤d)之后获得的粗液体提取物。因此，“浸渍溶剂”是用于获得根提取物的溶剂。这样的溶剂需要选自特定的溶剂，以达到期望的相对于干提取物的总重量至少10重量％的泻根醇酸含量。

根据本发明的一个实施方案，在干燥液体形式的根提取物的另外的步骤e)后，所述根提取物可以是固体或粘性形式，干燥根据本领域已知的任何方法进行，例如用于将液体形式的根提取物置于热且干燥的气氛中以蒸发浸渍溶剂。

固体或粘性形式的根提取物可以进一步在稀释溶剂中稀释，以获得另一种类型的液体形式的根提取物。因此，“稀释溶剂”是用于稀释已经获得的固体或粘性形式的根提取物的溶剂。稀释溶剂可以特别选自醇、二醇、乙酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、甘油三酯、柠檬酸三乙酯、二辛基醚、异硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、乙酸乙酯、植物油或其混合物。醇优选选自甲醇和乙醇。实际上，虽然需要使用特定的溶剂作为浸渍溶剂以达到期望的相对于干提取物的总重量至少10重量％的泻根醇酸含量，但在使用提取物之前，可以使用其他溶剂来稀释已经获得的固体或粘性形式的根提取物。特别地，稀释溶剂不需要与用于获得提取物的浸渍溶剂相同。在稀释溶剂的情况下，醇优选选自甲醇和乙醇。二醇优选选自戊二醇和甘油。优选地，稀释溶剂选自戊二醇和二辛基醚。在特定实施方案中，二辛基醚是生物基的。更优选地，稀释溶剂是戊二醇。更优选地，稀释溶剂是二辛基醚。特别优选地，稀释溶剂是生物基二辛基醚。

根据液体形式的根提取物是浸渍溶剂中的粗液体根提取物还是在稀释溶剂中稀释的干燥的根提取物，液体形式的根提取物可以包含如上公开的浸渍溶剂或如上公开的稀释溶剂。

“植物的根提取物”是指通过提取植物丝瓜的富集根获得的产物，所述根提取物优选但不限于液体形式。

“富含泻根醇酸的根”和“富集的根”是指与可以在自然界中发现的相同植物的相应根提取物相比，含有更高量的泻根醇酸的所述植物的根提取物。换句话说，“富含泻根醇酸的根提取物”是指相对于干提取物的总重量，包含占至少10重量％的泻根醇酸的根提取物。

“泻根醇酸”是指具有以下通式(I)的五环三萜化合物：

“干提取物”是指可以通过实施根据本发明的方法，接着干燥获得的提取物的步骤获得的植物的根提取物，干燥根据本领域技术人员熟知的任何方法实施，特别是将根提取物置于热且干燥的气氛中或将根提取物置于加热板上以蒸发溶剂。

在下文中，将更详细地描述本发明的要素。这些要素与具体实施方案一起列出，然而，应当理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方案。各种描述的实施例和实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本说明书应理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开的要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合应被认为是由本申请的描述公开的。

在整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”以及诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”的变体将被理解为暗示包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个(a)”和“一个(an)”和“该”以及类似的提及应被解释为涵盖单数和复数。本文中对数值范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则将每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独叙述一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”、“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对另外要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实施是必不可少的。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管本文所述的方法和材料是优选的，但在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述的那些类似或等同的其他方法和材料。

优选地，为了获得根据本发明的植物丝瓜的根提取物，当认为根充分发育时，通过浸泡优选通过浸渍使它们与提取溶剂接触，然后回收并处理所述提取溶剂以从其中提取由所述植物的根释放的包含泻根醇酸的次生代谢物。这种优选的方法改编自由名为PlantAdvanced Technologies(PAT)的公司开发的“PAT Plantes à

”并在国际申请WO-01/33942中描述的方法。该国际申请的教导通过引用并入本发明的说明书中。

本发明的第二个主题涉及一种制备植物丝瓜的根提取物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在无土条件下，特别是通过气培，栽培丝瓜的步骤，

b)任选地刺激所述植物的根的步骤，

d)回收步骤c)中获得的提取物，和

该方法是制备根据本发明的植物丝瓜根提取物的优选方法。在本发明的优选实施方案中，根据本发明的植物丝瓜的根提取物通过本发明的方法获得。在本发明的优选实施方案中，本发明的方法用于制备根据本发明的植物丝瓜的根提取物。

在本发明的上下文中，术语“在无土条件下栽培植物”是指其中植物根的发育不在土壤中发生的任何栽培模式。更确切地说，无土栽培是其中植物的根在与土壤分离的重构介质中生长的栽培类型。该栽培介质定期用众所周知的适于栽培植物的营养液灌溉。

存在各种无土栽培技术，如需要富氧营养液的无基质系统和基于基质的系统。无基质系统包括：水产养殖，其中营养液是非循环的并且包含在培养罐中；营养膜技术(NFT)，其中营养液在其移动过程中通过与空气交换而富含溶解氧；以及气培，其中植物的根既不与固体介质接触，也不与液体介质接触。实际上，将通过在封闭环境中雾化(经由喷雾器)营养液而获得的营养雾供给根。基于基质的系统包括：地下灌溉，其中营养液通过基质的下部渗透基质；以及渗滤，其中营养液通过不连续灌溉分布在系统的上表面，然后渗滤到基质的底部。所述矿物或有机基质是中性和惰性的，如沙子、粘土或岩棉。这种基质也可以是合成来源的。

术语“气培植物栽培”是指植物的根既不与固体介质也不与液体营养介质永久接触的无土栽培模式。

术语“营养液”是指包含最佳量和彼此比例最佳的必需矿物盐(氮-N、磷-P、钾-K)以获得最大程度的根生长和次生代谢物的最大程度的产生的溶液。

术语“刺激营养液”是指包含最佳量的必需矿物盐(氮-N、磷-P、钾-K)以获得最大程度的根生长和次生代谢物(特别是泻根醇酸)的最大程度的产生的缺氮溶液，。

根据本发明方法的实施方案，可以向植物供给营养液雾，该营养液雾通过喷雾器雾化封闭环境中的营养液而获得。

根据本发明方法的实施方案，植物可以放置在托盘上，其中植物的地上部分在托盘上方并且根部在托盘下方，托盘放置在形成保留区域的桌子上以收集向植物扩散的过量液体，并且托盘转移到各个站点的桌子上。关于这种适于气培植物培养的技术的教导在国际申请WO2018054704A1中更详细地描述，其也通过引用并入本发明的说明书中。

根据本发明方法的实施方案，在步骤a)期间，通过向根喷洒必需矿物盐(氮-N、磷-P、钾-K)的营养液来向气培植物施肥，以获得最大程度的根生长和最大浓度的次生代谢物(包括泻根醇酸)，而不损害植物的存活。本领域技术人员凭借其常识知道如何调整各种矿物盐的比例和浓度以优化植物生长，特别是根生长。在这种情况下，营养液的矿物盐浓度在低电导率范围内，有利地在0.4至1.6mS/cm之间，优选在0.8至1.2mS/cm之间，以促进根提取物中更高的次生代谢物(包括泻根醇酸)的多样性。

有利地，上述气培培养条件允许获得一些次生代谢物，包括泻根醇酸，其量优于土壤培养中获得的泻根醇酸的量。

根据本发明方法的实施方案，该方法可以包括根部的刺激步骤。在这种情况下，所述植物的根刺激的步骤b)包括将根与缺氮刺激营养液接触的步骤。在这种情况下，所述溶液可以是这样的溶液：其包含的氮比例小于通常认为对于植物生长特别是根生长最佳的氮比例，有利地小于15％的氮，更有利地不包含任何氮，所述步骤是顺序的或同时的。

根据本发明的优选实施方案，制备植物丝瓜的根提取物的方法包括以下步骤：

a)气培丝瓜的步骤，

b)刺激所述植物的根的步骤，

c)通过在步骤b)中刺激的根在溶剂中的根浸渍进行固/液提取的步骤，

d)回收步骤c)中获得的提取物，

根据本发明方法的实施方案，步骤b)中所述植物的根刺激包括将根与缺氮营养液接触的步骤。将植物与缺氮营养液接触引起“氮胁迫”，其负责刺激次生代谢物的产生，特别是泻根醇酸的产生。

根据本发明方法的特定实施方案，所述缺氮刺激营养液是包含小于15％的氮，优选小于10％的氮，有利地小于8％，更有利地小于6％，小于5％，小于4％，小于3％，小于2％，小于1％的氮，甚至更有利地0％的氮的溶液。

根据本发明方法的实施方案，根刺激步骤b)使得可以显著增加根中次生代谢物(包括泻根醇酸)的含量，从而促进所述代谢物从根流入选择用于提取的溶剂中，并且这样做不会完全损失植物的活力，使得其可以返回培养然后再利用。换句话说，植物刺激步骤促进次生代谢物(包括泻根醇酸)的生产产量和分泌。

根据本发明方法的实施方案，步骤b)中的根刺激通过向所述植物的根供给蒸发或雾化到根上的缺氮N/P/K刺激营养液来进行。

根据本发明方法的实施方案，步骤b)通过用包含小于6％、更优选小于3％的氮的N/P/K营养液喷雾或浸渍所述植物的根来进行，所述溶液优选被蒸发或雾化到根上。

根据本发明方法的实施方案，通过用蒸发到所述根上的缺氮N/P/K营养液供给所述植物的根来刺激根的步骤b)有利地进行10天至8周，优选3周的时间。

根据本发明方法的实施方案，在步骤b)期间，营养液的矿物盐浓度在低电导率范围内，有利地在0.4至1.2mS/cm之间，优选在0.6至1.0mS/cm之间，以促进根提取物中更高的次生代谢物(包括泻根醇酸)的多样性。

根据本发明方法的实施方案，步骤b)在步骤a)后进行。

根据本发明方法的实施方案，步骤b)和步骤a)同时进行，然后用刺激溶液代替营养液。

然后通常在给定的溶剂、温度和提取时间的条件下通过根浸渍对培养和刺激的植物进行固/液提取的步骤c)，以获得富含泻根醇酸的根提取物，并且当然还含有其他次生代谢物。实际上，在丝瓜的刺激根提取物的薄层色谱(TLC)分析后，某些脂肪酸(棕榈酸、亚油酸和α-亚麻酸)的量也增加(数据未显示)。固/液提取是基于溶剂的提取技术，其包括提取作为固体并且可溶于所述溶剂中的一种或多种化学物质。提取通过使所述溶剂与根接触(也称为浸泡步骤)合适的时间，使得在合适的溶剂中回收根中包含的次生代谢物(包括泻根醇酸)。接着，回收由根释放的含有次生代谢物(包括泻根醇酸)的所述溶剂。

根据本发明方法的优选实施方案，在步骤b)期间刺激的根的固/液提取的步骤c)之前是另外的洗涤步骤，其中扩散到植物的溶剂是清水。因此，在溶剂中浸泡的步骤期间，营养液或刺激营养液中包含的元素在提取溶剂中的供应受到限制。

根据本发明方法的实施方案，对切割和干燥的根进行根浸渍。

根据本发明方法的另一个更特别的实施方案，对切割然后干燥和任选研磨的根进行根浸渍。干燥方法可以是本领域技术人员已知的任何合适的干燥方法，特别是通过将根生物质在30℃至60℃的温度下放置24小时至72小时，优选在干燥环境中。根生物质可以特别地在通风烘箱中干燥。根生物质的研磨可以通过实施本领域技术人员已知的任何合适的研磨方法来进行，特别是通过将根生物质置于球磨机或刀磨机或锤磨机中。在切根步骤之后，将植物返回到根据步骤a)和任选的b)的气培培养，以重新开始其根生长并促进根产生次生代谢物，优选泻根醇酸。

根据本发明方法的另一个更特别的实施方案，该方法包括在浸渍步骤前切割根并干燥切割的根的步骤，浸渍通过将切割的干燥的根与溶剂接触来进行。

根据本发明方法的另一个更特别的实施方案，该方法包括在浸渍所述根的步骤前，切割根，干燥切割的根，然后研磨切割的干燥根的步骤，浸渍通过将切割的干燥研磨的根与溶剂接触来进行。

根据本发明方法的优选实施方案，通过根浸渍的固/液提取步骤c)包括将根与选自肉豆蔻酸异丙酯、甘油三酯、柠檬酸三乙酯、二辛基醚、异硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、乙酸乙酯、植物油或其混合物的溶剂接触。

优选地，溶剂可以选自肉豆蔻酸异丙酯、甘油三酯、柠檬酸三乙酯、二辛基醚、异硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、乙酸乙酯和植物油(例如杏仁油、葵花油、菜籽油)。

在优选实施方案中，溶剂是二辛基醚。在特别的实施方案中，二辛基醚是生物基的。更优选地，溶剂是生物基二辛基醚。

根据本发明方法的另一个优选实施方案，固/液提取步骤c)包括例如通过浸渍将根与二辛基醚，特别优选生物基二辛基醚接触。

根据本发明方法的实施方案，步骤c)包括例如通过浸渍将根与溶剂接触30min至48小时，更特别地1小时至4小时的时间。

根据本发明方法的另一个特别实施方案，步骤c)包括例如通过浸渍在20℃(室温)至80℃，更特别是40℃至60℃的温度下将根与溶剂接触。

根据本发明方法的另一个特别的实施方案，对于干燥根的根浸渍，干燥根的量与溶剂的量的比例范围为1kg干燥根/10kg溶剂至1kg干燥根/100kg溶剂，更优选1kg干燥根/20kg溶剂至1kg干燥根/40kg溶剂。

在本发明的上下文中，术语“在溶剂中的根浸渍”优选是指溶剂与根接触的根浸渍，所述溶剂可以是例如肉豆蔻酸异丙酯、甘油三酯、柠檬酸三乙酯、二辛基醚、异硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、乙酸乙酯和植物油(例如杏仁油、葵花油、菜籽油)，且更优选所述溶剂是二辛基醚。

根据实施方案，根据本发明的方法有利地可以包括处理所述植物根提取物的一个或多个另外的步骤，其可以选自：

-稀释，

-至少一次过滤，特别是澄清过滤和/或灭菌过滤，

-固/液提取，

-纯化，

-液体根提取物的漂白。

这样的处理方法是本领域技术人员熟知的。

本发明的另一个主题涉及通过如上详述的方法获得的植物丝瓜的根提取物。

在本申请的上下文中，通过测量对应于所述根提取物通过液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)分析的色谱图上的泻根醇酸的峰面积来确定植物(例如丝瓜)的根提取物中泻根醇酸的浓度。相对于包含125mg/L泻根醇酸的标准溶液的UPLC-MS分析的色谱图中的峰面积，得到泻根醇酸峰的面积。泻根醇酸的定量等于以下：

本发明的另一个主题涉及美容或皮肤病学或营养食品组合物，其包含如上定义的植物丝瓜的根提取物和任选的一种或多种赋形剂，所述赋形剂优选为美容学或皮肤病学或营养食品学上可接受的。在优选实施方案中，本发明的组合物是美容组合物，其包含如上定义的植物丝瓜的根提取物和任选的一种或多种美容学上可接受的赋形剂。在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物是皮肤病学组合物，其包含如上定义的植物丝瓜的根提取物和任选的一种或多种皮肤病学上可接受的赋形剂。在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物是营养食品组合物，其包含如上定义的植物丝瓜的根提取物和任选的一种或多种营养食品学上可接受的赋形剂。

根据本发明的组合物的优选实施方案，相对于干提取物的总重量，泻根酸占至少10重量％，优选至少15重量％，至少20重量％，至少25重量％，至少30重量％，至少35重量％，至少40重量％，至少45重量％，至少50重量％，至少55重量％或至少60重量％。

根据本发明组合物的优选实施方案，相对于组合物的总重量，所述植物丝瓜的根提取物占0.0001至15重量％，优选0.001至10重量％，更优选0.01至5重量％。

根据本发明的美容组合物的施用方式、剂量和最佳剂型可以根据建立适合于受试者的美容处理时通常考虑的标准(例如皮肤类型)来确定。根据期望的施用类型，根据本发明的美容组合物还可包含至少一种美容学上可接受的赋形剂。根据本发明的美容组合物还可以包含至少一种本领域技术人员已知的美容助剂，其选自增稠剂、防腐剂、香料、染料、化学或矿物过滤剂、保湿剂、温泉水等。

根据本发明的美容组合物可以进一步包含其他美容活性剂，如其他抗衰老剂或保湿剂，具有平静、舒缓或放松活性的试剂，刺激皮肤微循环的试剂，用于护理油性皮肤的皮脂调节剂，清洁或净化剂，抗自由基剂，抗炎剂，化学或矿物防晒剂等。

合适的美容赋形剂是本领域技术人员熟知的那些。例如，合适的美容赋形剂可以选自聚合物、硅酮化合物、表面活性剂、流变剂、保湿剂、渗透剂、油性组分、蜡、乳化剂、成膜剂和香料、电解质、pH调节剂、抗氧化剂、防腐剂、染料、珠光剂、颜料及其混合物。

根据本发明的美容组合物有利地旨在用于局部施用。特别地，其可以是乳膏、乳、洗剂、凝胶、血清、喷雾剂、摩丝、溶液、软膏、乳液、贴剂或面膜的形式。

根据本发明的美容组合物旨在延迟或修复皮肤衰老迹象(内在或外在)的出现，特别是外在衰老，包括紧致度、弹性、外观和皱纹。有利地，根据本发明的组合物能够刺激和/或恢复皮肤能量代谢，甚至在疲劳细胞中恢复细胞活力，诱导皮肤对抗外部物质(有毒物质、暴露于太阳或UV、暴露于光、应激、营养不良)的保护性反应，用于预防氧化应激，更一般地用于预防和/或延迟衰老迹象，以及用于改善皮肤的紧致度、张力和弹性。

合适的皮肤病学赋形剂也是本领域技术人员熟知的那些。例如，合适的皮肤病学赋形剂可以与旨在用于美容的那些相同。

合适的营养食品赋形剂是本领域技术人员熟知的。实例包括水溶性聚合物，如纤维素聚合物、丙烯酸酯聚合物和共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、水溶性聚乙二醇、乙烯共聚物。营养食品组合物可以是包含根据本发明的丝瓜根提取物的食品补充剂。通常，所述营养食品组合物可以是固体、包衣或非包衣片剂、液体、粉末、软或硬明胶胶囊等的形式。

本发明的另一个主题涉及如上定义的植物丝瓜的根提取物或包含如上定义的植物丝瓜的根提取物的组合物，其用于刺激和/或恢复皮肤能量代谢，恢复细胞活力(甚至在疲劳细胞中)，诱导皮肤对抗外部因素的保护性反应，防止氧化应激，防止和/或延迟衰老迹象，和/或改善皮肤的紧致度、张力和/或弹性。

特别地，所述根提取物或包含所述根提取物的所述组合物适于通过调节线粒体转运蛋白SLC25来刺激皮肤能量代谢，通过刺激谷胱甘肽s-转移酶θ2、谷胱甘肽过氧化物酶2和3来上调内在抗氧化系统，通过增强过氧化物氧化还原蛋白-2来去除过氧化物的毒性，有效恢复由环境应激物改变的细胞生物能量曲线，通过刺激I型和IV型胶原蛋白表达和弹性纤维来改善皮肤结构和/或减少皱纹和细纹。

本发明的另一个主题涉及如上定义的植物丝瓜的根提取物或包含如上定义的植物丝瓜的根提取物的组合物(优选美容组合物)用于刺激和/或恢复皮肤能量代谢、恢复细胞活力(甚至在疲劳细胞中)、诱导皮肤对抗外部物质的保护性反应、防止氧化应激、防止和/或延迟衰老迹象和/或改善皮肤的紧致度、张力和/或弹性的用途。

本发明的另一个主题涉及用于预防或延迟皮肤衰老效应的出现的美容护肤方法，所述方法包括在身体或面部皮肤的至少一部分上施用如上所述的美容组合物。

嗅觉受体(OR)在包括皮肤在内的各种人体组织中表达并具有活性。主要位于嗅觉上皮中并介导气味识别的第一步的异位OR在整个身体的鼻区域外表达。这些异位OR可能具有远远超出嗅觉作用的生理细胞功能调节作用。然而，这些生理作用中的大多数仍有待阐明。

根据对如上定义的植物丝瓜的根提取物进行的转录组学研究(数据未显示)，证明了在如下表4所述的所述提取物的不同浓度下，这随后可以在人表皮中调节几种嗅觉受体基因家族的转录，如OR1、OR2、OR4、OR5、OR8、OR9、OR10、OR11、OR51、OR52和OR56，并且每个家族的大多数成员被描述为参与几种主要的生理功能，如免疫应答、炎症、神经元生理学、代谢调节、伤口愈合和皮肤应激反应。因此，根据本发明的植物丝瓜的根提取物可以用作整体皮肤稳态保护物。

在人类皮肤中，已经确定了嗅觉受体OR2AT4、OR2A4/7、OR2AG2、OR6M1、OR6V1、OR5V1、OR10A6、OR11H4、OR11A1和OR51B5。例如，由一些植物提取物调节的OR2AT4参与皮肤上皮再形成、皮肤愈合过程和毛发生长。

显示了如上定义的植物丝瓜的根提取物调节嗅觉受体OR10A6和OR2AG2，其被描述为参与皮肤的应激反应(Duroux等，2020)。所述提取物还调节可能参与皮肤炎症的OR2AG2。此外，可以假设，如通过使用针对OR2AG2的所述提取物所显示的，下调人角质形成细胞中OR2AG1和OR1D2的表达可以引起由外部因素(如UV和污染物质)触发的皮肤炎症的调节。另外，OR10G7可以涉及炎性皮肤障碍，如特应性皮炎，因为已经证明其在从特应性皮炎分离的未分化角质形成细胞中过表达。此外，OR2AG1和OR1D2还涉及气道炎症，如哮喘和其他慢性肺病。

由于角质形成细胞具有免疫调节功能，如用如上定义的植物丝瓜的根提取物所证明的，代谢活化后OR1N1的上调可以调节皮肤免疫。实际上，显示了所述提取物诱导OR1N1的过表达。

还显示了如上定义的植物丝瓜的根提取物调节参与血管形成过程的OR52B4的表达。因此，所述提取物能够调节皮肤血管疾病，如红斑痤疮、皮肤衰老和黑眼圈。此外，所述提取物调节OR8J1和OR4D2可能涉及的人皮肤细胞代谢。

OR1L4、OR4D11和OR5B3分别属于OR1、OR4和OR5的嗅觉家族。由于作为嗅觉上皮的皮肤是受神经支配的组织并且与挥发性颗粒物质直接接触，因此这些基因可以参与压力反应机制。有趣的是，已经显示了如上定义的植物丝瓜的根提取物以与颗粒物质类似的方式调节OR114。

如上定义的植物丝瓜的根提取物也上调OR5P3的表达，表明所述提取物在皮肤神经元生理学中的功能。实际上，提出了OR5P3可以通过其与源自神经生长因子(VGF)的肽的相互作用而参与神经发生和神经分化。

因此，本发明的另一个主题涉及如上定义的植物丝瓜的根提取物或包含如上定义的植物丝瓜的根提取物的组合物(优选美容组合物)在调节选自OR1、OR2、OR4、OR5、OR8、OR9、OR10、OR11、OR51、OR52和OR56家族的皮肤异位嗅觉受体(OR)表达中的用途。

特别地，通过所述提取物或通过包含所述提取物的组合物调节皮肤异位嗅觉受体可优选用于：

a)激活皮肤的应激反应机制，其中涉及OR1L4、OR4D11、OR5B3、OR10A6和OR2AG2，

b)调节由外部因素触发的皮肤炎症，其中涉及OR2AG2、OR1D2和OR10G7，

c)改善血管疾病，特别是红斑痤疮、皮肤衰老和黑眼圈，其中涉及OR52B4，

d)代谢细胞调节，其中涉及OR8J1和OR4D2，

e)皮肤的神经元生理学，特别是皮肤神经发生和皮肤神经分化，其中涉及OR5P3。

然而，根据本发明的植物丝瓜的根提取物的功能效果不应被解释为限于本文所述的描述，并且可以在没有科学矛盾的情况下以其他方式解释。

实施例

以下实施例说明了本发明的不同实施方案，但本发明不限于这些实施例。

实施例1：对不同物种中的泻根醇酸含量的研究

基于它们在气培系统中的良好根产量来选择不同的物种(列于表1中，从商业种子获得)。从植物收获根样品，所述植物在没有刺激的情况下用对应于15/10/30的N/P/K组成和0.4至1.6mS/cm电导率的限定营养液在气培条件下培养1个月的时间。根据以下方案分析每种样品中的泻根醇酸含量：根在切割后在通风烘箱中在40℃下干燥48小时。然后用球磨机研磨干燥的根。对于一式两份的每种样品，将10mg干燥的研磨的根粉在1mL乙醇(100％)中在室温(20℃)下在搅拌下浸渍30min。然后，在如下文实施例3中所述的，将待分析的提取物在注射器过滤器上过滤通过0.2μm，然后HPLC-UV-MS进样。

表1：不同植物物种中泻根醇酸(BA)的含量

丝瓜是在气培培养系统中一个月后，即使在没有刺激的情况下，在其根中产生最多泻根醇酸(3至4倍)的物种。该量也比Jai Cho等的表1中所述的量高6倍(Formation ofbryonolic acid in cucurbitaceous plants and their cell cultures,phytochemistry，vol.31，No.11，pp.3893-3896，1992)。根据该文献，该研究证实丝瓜叶不含泻根醇酸。

为了证实在非气培培养中在根中的泻根醇酸浓度，在温室中在具有土壤的盆中栽培丝瓜幼苗。根据以下方案分析根中的泻根醇酸含量：洗涤根，然后在切割后在40℃的通风烘箱中干燥48h。然后用球磨机研磨干燥的根。对于一式两份的每种样品，将12mg干燥研磨的根粉在1.2ml乙醇(100％)中在室温(约20℃)下在搅拌下浸渍60分钟。然后，离心待分析的提取物，并将上清液吸入小瓶中，然后HPLC-UV-MS进样，如下文实施例3中所述。检测到用非气培培养物培养的根中的泻根醇酸，然而其含量低于HPLC定量限。这一结果证实了气培培养对提高丝瓜根中泻根醇酸含量的影响。

实施例2：在有或没有刺激步骤的气培系统中培养的丝瓜的根提取物中的泻根醇酸含量的比较

从商业种子(法国供应商，Graines Baumaux)获得的丝瓜的干燥根制备根提取物。将幼苗安置在气培培养系统中。将气培中的植物用营养介质培养4周，所述营养介质由相应的15/10/30的氮/磷/钾(N/P/K)组成并具有0.4至1.6mS/cm的电导率。将根切割(T0)，然后将植物布置在两种分开的气培系统中(20m²的表面)中：

-对于非刺激条件，将植物用营养介质保持培养6周，所述营养介质由15/10/30(N/P/K)组成并具有0.4至1.6mS/cm的电导率，

-对于刺激条件，将植物用营养介质保持培养6周，所述营养介质由0/15/40(N/P/K)组成并具有0.4和1.2mS/cm的电导率。

然后，收获根样品，干燥并研磨：这构成第一次切割。

在该第一次切割后，如下重新为植物施肥：

-对于非刺激条件，将植物用营养介质维持培养3周，所述营养介质由15/10/30(N/P/K)组成并具有0.4至1.6mS/cm的电导率，

-对于刺激条件，将植物用营养介质维持培养3周，所述营养介质由0/15/40(N/P/K)组成并具有0.4至1.2mS/cm的电导率。

然后，再次收获根样品，干燥并研磨：这构成第二次切割。

根据以下方案分析每种样品中的泻根醇酸含量：根在切割后在通风烘箱中在40℃下干燥48小时。然后，用刀磨机研磨干燥的根。对于一式两份的每种样品，将100mg干燥研磨的根粉在1.4ml甲醇(100％)中在室温(约20℃)下在搅拌下浸渍30min。然后，将待分析的提取物在注射器过滤器上过滤通过0.45μm，然后如下所述HPLC-UV-MS进样。

用于分析步骤的装置是HPLC Agilent 1200(1260Infinity四元泵，1200系列HiP-ALS SL⁺自动进样器，1260 Infinity恒温柱室，1260 Infinity二极管阵列检测器)，用具有尺寸为150mm×3.0m，2.7μm的Poroshell 120(Agilent)C18以反相运行。流动相由溶剂A(超纯Milli-Q水，Merck Millipore+0.1％甲酸，Carlo Erba，Val-de-Reuil，法国)和溶剂B(乙腈，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Steinheim，德国)组成，其梯度以以下方式编程：相B(％)94％(0-14min)；94-100％(14-15min)；100％(15-20min)。分析流速为0.4mL/min，烘箱温度为25℃。在柱出口处，二极管阵列检测器记录210至600nm之间的UV光谱。该装置与质谱仪(Agilent 6120四极杆LC/MS)偶联，在100至1000的m/z范围内以负模式的电喷雾电离(4.5kV)和大气压化学电离运行。软件ChemStation用于运行系统。

下表2中示出了泻根醇酸的含量和干燥的根的重量。

表2：不同切段的泻根醇酸的量和干燥的根的重量

在刺激的情况下，与在没有刺激的情况下的气培培养系统中的相同植物的根相比，泻根醇酸的产生和根的产生(通过干燥根的重量评估)提高：

-刺激后根中泻根醇酸的产量增加(mg/g干燥根)：对于第二次切割为7倍

-刺激后根的产量增加(g/m²)：对于第二次切割为1.5倍

-总的泻根醇酸产量增加(mg泻根醇酸/m²)：为11倍

实施例3：通过根据本发明的方法制备丝瓜的根提取物和所获得的根提取物的表征

由从商业种子(例如：法国供应商，Graines Baumaux)获得的丝瓜的干燥根制备根提取物。根据以下方法获得丝瓜的根提取物：

a)用N/P/K组成分别对应于15/10/30和电导率为0.4至1.6mS/cm的确定营养介质气培栽培植物丝瓜1周至6周，

b)通过使用N/P/K组成的营养液在2至6周期间用氮胁迫刺激植物，所述营养液包含：少于6％的氮、15％的磷和40％的钾，并且电导率为0.4至1.2mS/cm，

b’)用清水漂洗在步骤b)中刺激的根，然后排水；

b”)在通风烘箱中在30℃至60℃的温度下切割并干燥根24至72小时；

c)在20℃至80℃的温度下，通过在二辛基醚溶液中浸渍干燥的丝瓜根1至4小时进行固/液提取；

d)回收步骤c)中获得的根提取物；

e)通过澄清过滤使步骤d)中回收的根提取物澄清。

由此获得的丝瓜根提取物具有840mg干提取物/千克提取物，并且含有300±10mg泻根醇酸/千克提取物，相当于按干提取物重量计约35％的泻根醇酸。

根据通过液相色谱与质谱联用的方法进行了丝瓜根提取物中泻根醇酸量的定量。

用于分析步骤的装置是UPLC Shimadzu Nexera X2(LC-30AD泵，SIL-30AC进样器，CTO-20A烘箱，SPD-M20A二极管阵列检测器；京都，日本)，使用尺寸为150mm×1.1mm，2.6μm的

联苯柱(

Torrancce，CA，USA)以反相运行。流动相由溶剂A(超纯Milli-Q水，Merck Millipore+0.1％甲酸，Carlo Erba，Val-de-Reuil，法国)和溶剂B(乙腈，Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Steinheim，德国)组成，其梯度以以下方式编程：相B(％)5-75％(0-3min)；75％(3-5.4min)；75-90％(5.4-5.6min)，90％(5.6-12min)，90-5％(12-12.1min)，5％(12.1-15min)。分析流速为0.5mL/min，烘箱温度为40℃。在柱出口处，二极管阵列检测器记录190至370nm之间的UV光谱。该装置与质谱仪(Shimadzu LCMS-2020)偶联，该质谱仪在100至1000的m/z范围内以负模式电喷雾电离(4.5kV)运行。软件LabSolutions用于运行系统。

通过测量在乙醇(100％)中以125mg/L的浓度制备的泻根醇酸标准品(泻根醇酸纯度≥98％；[CAS号：24480-25-3])的峰面积来进行泻根醇酸定量。

根据下式计算表示为mg泻根醇酸/升提取物的泻根醇酸含量：

实施例4：根提取物中的泻根醇酸含量相对于干提取物总重量的比较

将10g用由0/15/40(N/P/K)组成的具有0.4至1.2mS/cm电导率的营养介质刺激6至18周的丝瓜干燥根在搅拌下在110mL乳酸乙酯溶剂中在室温下提取5天。将混合物过滤并获得根提取物，其中测定了泻根醇酸含量和干提取物。相对于干提取物的总重量，泻根醇酸占5.9重量％。

将10g用由0/15/40(N/P/K)组成的具有0.4至1.2mS/cm电导率的营养介质刺激6至18周的丝瓜干燥根在110mL的1,3-丙二醇溶剂中在60℃下在搅拌下提取5天。在过滤步骤之后，相对于干提取物的总重量，所获得的过滤的丝瓜根提取物包含3重量％的泻根醇酸。

将10g用由0/15/40(N/P/K)组成的具有0.4至1.2mS/cm电导率的营养介质刺激3至6周的丝瓜干燥根在250mL的100％乙醇中在室温下在搅拌下提取10min至5h。在10min、15min、30min、1h、2h、3h和5h收集不同的样品。过滤不同的样品以获得根提取物，测定其泻根醇酸和干提取物的含量。相对于干提取物的总重量，获得的泻根醇酸的最大比例为8.1重量％。相对于干提取物的总重量，所获得的泻根醇酸的最小比例为5.7重量％。

将1.2g、1.5g、2.0g或3.0g用由0/15/40(N/P/K)组成的具有0.4至1.2mS/cm电导率的营养介质刺激3至6周的丝瓜干燥根在30mL的100％乙醇中在室温下在搅拌下提取30min，以产生每升100％乙醇具有40g、50g、66g和100g干燥根比例的四种提取物。

过滤不同的混合物以获得根提取物，测定其的泻根醇酸和干提取物的含量。在每升乙醇100g干燥根时，相对于干提取物的总重量，所获得的泻根醇酸的最大比例为8.3重量％。在每升乙醇40g干燥根时，相对于干提取物的总重量，所获得的泻根醇酸的最小比例为7.2重量％。

对于以下实施例，富含泻根醇酸的丝瓜根提取物(下文称为LCRE)对应于根据实施例3获得的产物，其已被调整为145mg泻根醇酸/千克提取物。

实施例5：LCRE刺激参与生物能量代谢途径和抗氧化代谢的蛋白质的基因表达(RHE模型)

将如表4所述配制为0.125％和0.5％的LCRE局部施用于重建的人表皮(RHE)。

表4：在以下实验研究中使用的包含LCRE的制剂

然后，在含有补充剂和抗生素(庆大霉素，Fisher Scientific，15710-049)的Epilife介质(Fisher Scientific，M-EPI-500-A)中在空气-液体界面处培养RHE组织。将它们保持在37℃下具有5％CO₂的潮湿气氛中。在24小时的局部处理(2mg/cm²)后，使用来自Qiagen的RNeasy Mini试剂盒提取总RNA。用分光光度法和毛细管电泳法分析了浓度和完整性。根据Affymetrix用户手册，在Affymetrix Human Clariom S阵列上进行了转录组学分析。被LCRE在统计学上显著调节的基因呈现于表5和6中。与用安慰剂凝胶霜处理的组相比，进行了分析。

如表5所示，通过参与这些途径的酶的过表达，证明了LCRE上调三种主要的能量途径：糖酵解、戊糖磷酸途径(PPP)和三羧酸循环(TCA循环，也称为Krebs循环)。LCRE在这个RHE模型中证实了其刺激皮肤能量代谢的能力。同时，LCRE作用于线粒体转运蛋白SLC25，其使各种溶质穿梭穿过线粒体膜(表5)。表5显示了在0.125％LRCE下基因表达的调节，而表6显示了在0.5％LCRE下基因表达的调节。

表5：

在用0.125％的LCRE处理的RHE模型上通过Affymetrix技术分析了基因表达的调节。缩写：PPP：戊糖磷酸途径，TCA循环：三羧酸循环或Krebs循环，SLC25：线粒体转运蛋白。所有分析一式三份进行。进行统计学分析，与安慰剂凝胶霜进行比较。统计检验基于RLimma 3.26.8(Smyth，2004)中实施的适度t”方法，p-值<0.05。

表6：

在用0.5％的LCRE处理的RHE模型上通过Affymetrix技术分析了基因表达的调节。缩写：PPP：戊糖磷酸途径，TCA循环：三羧酸循环或Krebs循环，SLC25：线粒体转运蛋白。所有分析一式三份进行。与安慰剂凝胶霜比较进行统计学分析。统计检验基于R Limma 3.26.8中实施的适度t”方法(Smyth，2004)。***：p<0.005，**：p<0.01，*：p<0.05，#：p<0.1

这些溶质主要参与TCA循环进程(Palmieri等，2014和2016)。在表6中，结果表明LCRE强烈参与线粒体代谢。另外，LCRE有利于糖酵解、PPP和TCA循环必不可少的溶质的交换。有趣的是，SLC25A12被显著调节(p值<0.05，倍数变化1.27)。但是，作为结果，加强线粒体代谢可产生氧化应激。LCRE上调内在抗氧化系统。特别地，LCRE刺激三种酶：谷胱甘肽S-转移酶θ2、谷胱甘肽过氧化物酶2和3，它们负责通过将还原的谷胱甘肽与待中和的有害化合物偶联来保护细胞免受氧化损伤。LCRE还增强过氧化物氧化还原蛋白-2，其分别催化过氧化氢和有机氢过氧化物还原成水和醇，通过去除过氧化物的毒性在对抗氧化应激的细胞保护起作用。

实施例6：LCRE刺激参与生物能量代谢途径和抗氧化代谢的蛋白质表达(皮肤外植体模型)

将如表4中所述的配制为0.125％、0.5％和1％的LCRE局部施用于人皮肤外植体上。在女性供体(42岁，白种人，光型III)的腹部手术后收集皮肤外植体。将皮肤样品在37℃、5％CO₂下在

介质中稳定24小时，然后用2mg/cm²的不同制剂处理(用LCRE-制剂处理的组和安慰剂组)。加入第三对照组。局部施用每24小时更新6次。除了每24小时更新介质外，对照组不接受任何处理。最后一次施用后8小时，对皮肤外植体进行取样。每种外植体的一半用于蛋白质分析。使用裂解缓冲液提取蛋白质。使用Bradford方法测定蛋白质浓度，并通过高分辨SDS-PAGE验证提取的质量控制。在与Orbitrap Fusion质谱仪(Thermo Fisher Scientific)偶联的Dionex U3000 RSLC nano-LC系统上进行质谱(MS)分析。

观察到LCRE上调三种主要的能量途径(表7和8)：糖酵解、戊糖磷酸途径(PPP)和三羧酸循环(TCA循环，也称为Krebs循环)，如参与这些途径的酶的过表达所示的。LCRE在该皮肤外植体模型中证实了已经在实施例5和实施例7中证明的刺激皮肤能量代谢的能力。另外，如下文中在实施例7中所观察和证实的，LCRE发挥抗氧化特性。实际上，观察到几种抗氧化酶的过表达。

此外，在该皮肤外植体模型中，通过质谱(表7和8)以及通过免疫荧光(数据未显示)证实了转录组学结果，突出了包含0.125％的LCRE的制剂对SLC25A12的刺激。后者在通过线粒体膜的苹果酸-天冬氨酸穿梭中起重要作用，并转移还原当量的NADPH加H⁺，对糖酵解起到不可或缺的作用(Palmieri，Eur J Physiol，2004)。SLC25A12还参与谷胱甘肽的抗氧化能力的再生。

表7：

在用含有0.5％LCRE的配方处理7天的皮肤外植体模型上通过质谱法分析蛋白质表达。缩写：PPP：戊糖磷酸途径。所有分析一式三份进行。通过t检验统计分析，基于相对于安慰剂对照组的二元比较的统计检验。**：P<0.01，*：P<0.05。

表8：

在用含有1％LCRE的配方处理7天的皮肤外植体模型上通过质谱法分析蛋白质表达。缩写：PPP：戊糖磷酸途径，TCA循环：三羧酸循环或Krebs循环，SLC25：线粒体转运蛋白。所有分析一式三份进行。通过t检验统计分析，基于相对于安慰剂对照组的二元比较的统计检验。**：P<0.01，*：P<0.05

通过福尔马林固定的石蜡包埋的皮肤切片上的免疫荧光研究了局部施用LCRE制剂后SLC25A12的表达和定位的可视化(数据未显示)。使用pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液进行HIER(热诱导的表位修复)，然后以1/500使用抗SLC24A12兔多克隆抗体(AtlasAntibodies)，然后使用Alexa 568偶联的二抗。用Hoechst 33342标记细胞核。

实施例7：LCRE恢复失调的生物能量功能。

用Seahorse XF 24通量分析仪测定人皮肤成纤维细胞的生物能量曲线。SeahorseXF 24允许通过测量耗氧率(OCR)来确定几个生物能量参数：

-基础呼吸定义为用于满足由线粒体质子泄漏引起的细胞ATP需求的耗氧量。这个参数显示细胞在基线条件下的能量需求，其是初始速率与在加入鱼藤酮和抗霉素A的情况下获得的最低呼吸之间的差值。

-ATP产生参数显示线粒体产生的ATP有助于满足细胞的能量需求。通过注射ATP合酶抑制剂寡霉素后耗氧率的降低获实验性地获得该参数，ATP合酶抑制剂寡霉素阻断ATP合酶的F₀亚基并因此降低反映ATP产生的呼吸速率。

-最大呼吸参数显示细胞可以达到的最大呼吸速率。这个参数通过将解偶联剂羰基氰化物-4(三氟甲氧基)苯腙(称为FCCP，其使质子塌缩)加入实验中来获得。FCCP通过刺激呼吸链以最大容量运行来模拟生理能量需求，这导致底物(糖、脂肪和氨基酸)的快速氧化以应对这种代谢挑战。

-备用呼吸能力反映了细胞对增加的能量需求或应激下的反应能力。该参数可以是细胞适应性和灵活性的指标。该参数被定义为最大呼吸和基础呼吸之间的差值(图1)。

将从供体腹部皮肤分离的正常人真皮成纤维细胞(NHDF)在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM介质中培养。将细胞以每孔15,000个细胞的密度铺板，并使其附着6小时，然后直接在培养基中加入或不加入(对照条件)9％的化学应激物2-甲基四氢呋喃(下文称为应激物)。在该实验中，所述应激物用于模拟外源性应激，因为已经证明了环境损害和应激积累导致能量代谢耗尽，影响整体代谢(Reprogramming of energy metabolism as adriver of aging,Oncotarget(2016))。

对于处理，还将LCRE以0.5％和1％的浓度直接加入培养基中。然后将细胞再培养18小时，然后根据制造商的说明书用Agilent Seahorse XF Cell Mito应力测试试剂盒测量。对所有实验条件进行蛋白质定量以将OCR数据标准化。OCR蛋白标准化确保了结果的准确性和解释。实际上，在实验条件下，将细胞暴露于所述应激物从而轻微影响细胞活力。整个呼吸曲线(标准化至蛋白质含量)示于图2中，并且计算的生物能量参数列于表9中。在所有实验模型中，应激物消除细胞呼吸。在应激物存在下，观察到四个主要生物能量参数的强烈下降或完全抑制：基础呼吸、最大呼吸、ATP产生和备用呼吸能力。这是预期的，并且它验证了应力模型。

表9：

在基础(未处理的细胞)、应激(通过9％的2-甲基四氢呋喃)和处理条件(0.5和1％的LCRE)下计算正常人成纤维细胞的生物能量参数。

0.5和1％的LCRE可以有效地恢复由应激物改变的细胞生物能量曲线。这些结果意味着用LCRE处理的细胞将能够有效地反应并满足应激条件下的紧急能量需求(由于最大呼吸参数的增加和备用呼吸能力的增加)，导致ATP产生的恢复。0.5％的LCRE允许类似于对照条件的呼吸功能恢复，并在所有测试条件下恢复到相同的呼吸水平。另外，1％的LCRE改善呼吸功能，其变得优于对照条件(图2)。

实施例8：LCRE的抗衰老性质

在实施例6中描述的皮肤外植体模型中，由于蛋白质组学分析，已经发现了LCRE具有抗衰老性质，如通过刺激I型胶原蛋白表达所证明的(倍数变化×2.21，p值<0.05)。对这些皮肤外植体进行补充的组织学和免疫组织学分析以突出抗衰老特性。在福尔马林固定石蜡包埋的皮肤切片上进行HES(苏木精-伊红-藏红花)染色、改良Verhoeff染色和免疫荧光染色。HES染色允许皮肤的形态学观察(图3)，而改良的Verhoeff染色(图4)允许皮肤中弹性纤维含量的可视化。在图3中，以剂量依赖性方式证明了根据表4的LCRE与安慰剂凝胶霜相比的抗衰老作用。实际上，在局部施用LCRE后观察到真皮致密化。已知弹性纤维负责皮肤弹性。不幸的是，随着衰老，皮肤弹性降低，这是由于弹性纤维产生减慢和弹性蛋白酶活性增加(Imokawa等，2008)。已经证明了LCRE促进弹性纤维的产生。实际上，在图4中，与根据表4的安慰剂凝胶霜相比，随着LCRE浓度的增加，深色染色以剂量依赖性方式增加。深色染色代表弹性纤维。此外，还分析了IV型胶原蛋白。实际上，已知IV型胶原蛋白(真皮表皮连接的主要成分)也随着衰老而强烈降解。获得的结果再次证实了LCRE的抗衰老作用，因为在连续7天局部施用LCRE后，证明了IV型胶原蛋白表达的剂量依赖性增加。

在实施例5中描述的RHE模型中，已经发现了包含0.5％的LCRE的制剂刺激SLC35基因家族的表达(表10)。SLC35也是NST核苷酸糖转运蛋白。NST是反向转运蛋白，负责将核苷酸糖和PAPS转运到高尔基体中，但也负责将反应产物转运回细胞溶质。它们参与蛋白质成熟过程(Song，Z.2013，Ishida N.等，2004)。这表明提取物有利于蛋白质合成和成熟。有趣的是，在衰老过程中，这两个过程都减慢了。

表10：

在用0.5％的LCRE处理的RHE模型上通过Affymetrix技术分析基因表达的调节。缩写：SLC35：内质网和高尔基体转运蛋白。统计测试基于R limma 3.26.8(Smyth，2004)中实施的适度t”方法。*：p<0.05和#：p<0.1。所有分析一式三份进行。

在双盲和载体对照临床研究期间，最终在人类志愿者上评估了LCRE的抗衰老性质。遵守赫尔辛基宣言的建议和国际协调良好临床实践会议的指南，其适用于非药物研究。所有志愿者都提供了书面和知情同意书。

在皮肤科医生控制下对20名白人女性(年龄45至55岁，平均年龄51.8)进行了临床评估，显示出具有鱼尾纹皱纹的衰老临床迹象(根据皮肤衰老图谱第1卷，R.Bazin和E.Doublet的白种人类型，≥2级)和缺乏紧致度和弹性。此外，通过问卷调查，证实了该研究中纳入的志愿者认为自己有压力和疲倦。此外，基于自信问题的问卷调查允许我们选择9名不自信的志愿者。这种亚选择将允许以可靠的方式确定如表4中所述的包含LCRE的美容组合物是否有助于这9名志愿者获得自信。要求志愿者在其半侧脸上施用包含1％的LCRE和安慰剂凝胶霜的美容制剂，每天两次，持续两个月(表3)。在第0、28和62天，用皮肤弹性测定仪进行生物计量学测量。皮肤弹性测定仪允许通过计算特定参数来确定皮肤生物力学性质：皮肤紧致度(R0参数)、皮肤张力(Ur参数)和皮肤弹性(Ue和R6参数)。然后，利用Visia

拍摄说明性面部图片。

参考图5，LCRE改善皮肤紧致度、皮肤张力和皮肤弹性。实际上，在局部施用LCRE28天和62天后，所有参数在统计学上显著增加。相比之下，安慰剂配方没有带来改善。

在这个研究中纳入的9名不自信的志愿者中，78％的志愿者描述了在局部施用包含LCRE的组合物28天后皮肤更美丽、再生、得到休息(安慰剂配方分别为56％、67％和67％)。

此外，用包含LCRE的组合物观察到皮肤皱纹深度的改善。皮肤微形貌也得到改善，皮肤看起来更光滑和更紧致。

Claims

1.一种植物丝瓜的根提取物，其中所述根提取物包含泻根醇酸，其中相对于干提取物的总重量，所述泻根醇酸占至少10重量％。

2.根据权利要求1所述的根提取物，其中相对于干提取物的总重量，所述泻根醇酸占至少15重量％，优选至少20重量％，至少25重量％，至少30重量％，至少35重量％，至少40重量％，至少45重量％，至少50重量％，至少55重量％或至少60重量％。

3.根据权利要求1或2所述的根提取物，其为液体形式并且包含：

a)浸渍溶剂，其选自肉豆蔻酸异丙酯、甘油三酯、柠檬酸三乙酯、二辛基醚、异硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、乙酸乙酯、植物油或其混合物；或

b)稀释溶剂，其选自醇、二醇、乙酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、甘油三酯、柠檬酸三乙酯、二辛基醚、异硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、乙酸乙酯、植物油或其混合物。

4.一种制备根据权利要求1所述的植物丝瓜的根提取物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在无土条件下，特别是通过气培，栽培丝瓜的步骤，

b)刺激所述植物的根的步骤，

c)通过在步骤b)中刺激的根的根浸渍进行固/液提取的步骤，所述浸渍包括将根与选自肉豆蔻酸异丙酯、甘油三酯、柠檬酸三乙酯、二辛基醚、异硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、乙酸乙酯、植物油或其混合物的溶剂接触，

d)回收步骤c)中获得的提取物，和

5.根据权利要求4所述的方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过气培栽培丝瓜的步骤，

b)刺激所述植物的根的步骤，

c)通过在步骤b)中刺激的根在溶剂中的根浸渍进行固/液提取的步骤，所述浸渍包括将根与选自肉豆蔻酸异丙酯、甘油三酯、柠檬酸三乙酯、二辛基醚、异硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、乙酸乙酯、植物油或其混合物的溶剂接触，

d)回收步骤c)中获得的提取物，

6.根据权利要求4或5中任一项所述的方法，其中所述植物的根刺激的步骤b)包括将根与缺氮刺激营养液接触的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述缺氮刺激营养液是包含少于15％的氮，优选少于10％的氮、少于8％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％或0％的氮的溶液。

8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中所述方法包括在浸渍步骤前切割根并干燥切割的根的步骤。

9.一种通过根据权利要求4至8中任一项所述的方法获得的植物丝瓜的根提取物。

10.一种美容或皮肤病学或营养食品组合物，其包含如权利要求1至3或9中任一项所定义的植物丝瓜的根提取物，和任选的一种或多种赋形剂，所述赋形剂优选为美容学或皮肤病学或营养食品学上可接受的。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中相对于组合物的总重量，所述植物丝瓜的根提取物占0.0001至15重量％，优选0.001至10重量％，更优选0.01至5重量％。

12.根据权利要求1至3或9中任一项所定义的植物丝瓜的根提取物或包含根据权利要求1至3或9中任一项所定义的植物丝瓜的根提取物的组合物(优选美容组合物)用于刺激和/或恢复皮肤能量代谢，恢复细胞活力(甚至在疲劳细胞中)，诱导皮肤对抗外部因素的保护性反应，防止氧化应激，防止和/或延迟衰老迹象和/或改善皮肤的紧致度、张力和/或弹性的用途。

13.一种用于预防或延迟皮肤衰老效应的出现的美容护肤方法，其中所述方法包括在身体或面部皮肤的至少一部分上施用如权利要求10或11所定义的美容组合物。

14.根据权利要求1至3或9中任一项所定义的植物丝瓜的根提取物或包含根据权利要求1至3或9中任一项所定义的植物丝瓜的根提取物的组合物(优选美容组合物)用于调节选自OR1、OR2、OR4、OR5、OR8、OR9、OR10、OR11、OR51、OR52和OR56家族的皮肤异位嗅觉受体(OR)表达的用途。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述用途用于：

b)调节由外部因素引发的皮肤炎症，其中涉及OR2AG2、OR1D2和OR10G7，

d)代谢细胞调节，其中涉及OR8J1和OR4D2，