KR20200139368A - 소루쟁이­동충하초 고체 발효물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소루쟁이(Rumex coreanus) 식물에 동충하초(冬蟲夏草, vegetable worms) 종균을 접종하여 수득되는 고체 발효물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 멸균된 소루쟁이에 동충하초 군사체를 접종하여 고체 발효시켜 수득되는 고체 발효물 및 이를 포함하는 항산화, 항염증, 탈모 방지, 피부 노화 방지 및 피부 재생 촉진용 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 소루쟁이-동충하초 고체 발효물은 세포 독성이 없는 천연물 유래의 조성물로서 항산화, 항염증, 탈모 방지, 피부 노화 억제 및 피부 재생 촉진이 우수하여 항산화 작용, 항염증 작용, 탈모 예방 효과 및 항노화 작용, 특히, 피부 재생 및 주름 개선 용도의 기능성 화장료 조성물로서 적용가능하므로 화장품 산업상 매우 유용한 것이다.

Description

소루쟁이­동충하초 고체 발효물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물{SOLID FERMENTATION COMPOSITION MANUFACTURED BY RUMEX COREANUS AND VEGETABLE WORMS AND FUNCTIONAL COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 소루쟁이(Rumex coreanus) 식물에 동충하초(冬蟲夏草, vegetable worms) 종균을 접종하여 수득되는 고체 발효물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 멸균된 소루쟁이에 동충하초 군사체를 접종하여 고체 발효시켜 수득되는 고체 발효물 및 이를 포함하는 항산화, 항염증, 탈모 방지, 피부 노화 방지 및 피부 재생 촉진용 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 일상생활에서 햇빛 노출에 의한 자외선 조사, 황사나 자동차 매연 등에 의한 대기 오염 물질 및 각종 세균 등에 노출되어 피부 트러블 및 자극이 유발되며 이로 인해 정상적인 피부 노화를 가속화시키게 된다. 이러한 피부 노화는 피부 외관상으로 피부의 탄력을 저하시켜 주름을 형성하거나 기미 및 노인성 반점을 형성하여 피부의 색소 침착을 유발하게 된다.

일반적으로 피부 노화는 체세포 돌연변이, 자유 라디칼의 과도한 생성, 자가면역반응, 독성물질의 축적, 유전자 복제중 발생된 에러, 진피구성 단백질의 변형 등 여러 가지 학설이 제기되고 있으며, 이 중에서 노화(aging)와 성인병과 같은 각종 질환의 원인이 활성산소종(reactive oxygen species)에 기인된다는 학설이 인정받음에 따라 산소나 질소로부터 유래되는 활성 산소종을 조절할 수 있는 천연 항산화제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

보통 유해산소로 알려져 있는 활성 산소종은 가장 안정한 형태인 삼중항 산소가 환원되면서 과산화물 음이온 라디칼, 과산화수소, 히드록시 라디칼, 과산화지질이나 여기서 발생되는 자유 라디칼 등의 과산화지질로서, 체내에는 이러한 활성산소종이 정상적인 상태에서도 발생을 하지만 항산화 효소인 슈퍼옥사이드디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제(catalase), 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathion peroxidase, GPx) 등이 존재하여 과도한 활성 산소종의 생성을 억제하고 있다.

그러나, 이러한 활성산소종이 스트레스 및 외부 환경적인 요인에 의해 비정상적으로 과도하게 발생이 되어 소거되지 않고 체내에 존재하게 되면 자유 라디칼로 인한 산화적 스트레스(oxidative stress)가 생체에 가해져 DNA, RNA, 단백질, 세포막 및 세포구조 손상, 암, 조직 손상, 노화 등을 유발한다고 추측된다.

현대에 급증하는 다양한 질병 및 노화의 가속화를 억제하기 위하여 이러한 활성산소종을 조절하거나 제거할 수 있는 항산화제에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 대표적으로, 천연 항산화제인 토코페롤, 아스코르빈산, 카로테노이드, 플라보노이드, 글루타치온 등에 대한 효능 연구 및 이들의 안정화 기술에 대한 연구와 합성 항산화제인 부틸화된 히드록시 톨루엔(BHT), 부틸화된 히드록시 아니졸(BHA) 등 다양한 항산화제가 알려져 있고, 그 외 많은 항산화제에 관한 연구가 지속적으로 진행되고 있다.

이들 항산화제 중 토코페롤은 항산화 효과가 비교적 낮은 편이고, 효과가 우수한 BHA, BHT 등의 합성 항산화제가 의약품 및 식품분야 등에서 활용되고 있으나, 돌연변이원성 및 독성에 대한 지적이 있으며 아스코르빈산의 경우에는 안정성이 확보된 유도체 및 제형 개발이 진행되고 있어, 더욱 안정하고 효과가 우수한 천연 항산화 소재의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이러한 문제를 해결하기 위하여, 최근 각광받고 있는 식물화학물질(phytochemical) 중에서 상대적으로 독성이 낮고 안전하며 피부에 유효한 효능을 나타내는 추출물을 이용한 화장료 조성물에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으나 일반적인 추출 방법에 의해 수득된 성분은 그 효과가 미미한 한계점을 나타내어 효능을 극대화시킨 소재의 개발이 요구되고 있다.

예로서, 발효를 통한 천연 추출물의 경우에는 인체에 유해한 유기용매를 사용하지 않고 천연물 내에 존재하는 당 성분을 미생물의 대사과정에서 탄소원으로 사용되어 알코올로 전환시키게 되므로, 천연물 내의 유효성분, 특히, 플라보노이드, 폴리페놀, 카테킨 등은 당화되어 안정한 화합물로 존재하게 되어 있어 발효를 통해 유효성분 함량 추출율을 증가시키고 당이 배제되어 활성화된 유효성분에 의해 우수한 피부 효능이 기대되고 있다.

동충하초란 겨울에는 벌레(蟲) 상태로 있다가 여름이 되면 버섯(草)이 된다는 뜻에서 나온 말로써 곰팡이의 일종인 동충하초균의 포자나 균사가 살아있는 곤충의 몸 속에 침입하여 겨울 동안에는 그대로 잠복해 있다가 여름이 되면 그 곤충을 죽게하고 기주안에 있는 물질을 영양원으로 이용하여 내생균핵을 만든다음 곤충의 몸밖으로 자실체를 형성하는 기이한 버섯이다.

동충하초의 종류는 지금까지 세계적으로 750여 종류가 발견되고 있으며, 코디셉스 속(Cordyceps spp.), 패실로마이세스 속(Paecilomyces spp), 이사리아 속(Isaria spp.) 등 100여 가지 속으로 구분된다.

중국의 고서들에 의하면 동충하초는 암질환, 간질환, 폐질환, 뇌질환, 순환기 질환, 심장병, 당뇨병 등에 탁월한 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 현대실용중약전에는 폐결핵, 노인쇠약성 만성결핵 빈혈, 허약체질 등을 치료한다고 나타나 있다. 최근에는 종양 억제율이 83%로 높은 항암효과 및 마약중독의 해독제로서도 효과가 있는 것으로 보고되고 있으며, 자연치유력을 가지고 있어 심한 운동으로 체력소모가 클 때 회복효과가 있다고 보고하고 있다.

한편, 소루쟁이는 굵은 뿌리줄기를 가지고 있는 여러해살이풀로서, 보랏빛을 띤 굵은 줄기는 곧게 서고 60cm 안팎의 높이로 자라며, 길이 30cm가 넘는 잎은 마디마다 서로 어긋나게 자리하며 길쭉한 타원 꼴에 가까운 피침 꼴이고, 잎의 밑동은 둥그스름하고 끝은 무디며 잎 몸에 많은 주름이 잡혀 있다. 작은 꽃이 긴 원뿌리 꼴로 뭉쳐 피는데 층이 지면서 둥글게 배열되어 있으며, 꽃잎은 없고 6장의 꽃받침과 6개의 수술 그리고 세 갈래로 갈라진 암술로 꽃이 구성된다. 꽃의 지름은 4mm 안팎이고 빛깔은 초록빛으로 꽃이 핀 뒤 4개의 날개가 달린 씨를 맺는 산야초로 알려져 있다.

소루쟁이는 전국 각지에 분포하며 들판의 약간 습한 땅에서 자라며, 초가을에 굴취하여 잎, 줄기, 잔뿌리 등을 제거한 후 건조시켜 주로 뿌리를 약용으로 사용한다.

뿌리줄기에는 안트라퀴논(Anthraquinon) 유도체인 크리소파놀(Chrysophanol)과 에모딘(Emodin)이 함유되어 있으며, 이뇨, 지혈, 변통 등의 효능이 있고, 적용질환은 변비, 소화불량, 황달, 혈변, 자궁출혈 등과 옴이나 종기, 류머티스, 기계충, 음부습진 등의 치료에도 널리 쓰이는 약제이다.

KR 10-0638053 B KR 10-1124968 B KR 10-0858628 B

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 세포 독성이 없는 천연물 유래로서 항산화, 항염증, 탈모 방지, 피부 노화 억제 및 피부 재생 촉진이 우수한 소루쟁이-동충하초 고체 발효물 및 이를 이용한 기능성 화장료 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 동충하초 균사체를 멸균된 소루쟁이(Rumex coreanus)에 접종 및 배양하여 제조되는 소루쟁이-동충하초 고체 발효물을 제공한다.

상기 동충하초는 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis), 코디셉스 밀라타리스(Cordyceps militaris), 코디셉스 스카라베콜라(Cordyceps scarabaecola), 코디셉스 누탄스(Cordyceps nutans), 코디셉스 스페코세팔라(Cordyceps sphecocephala), 코디셉스 트리센트리(Cordyceps tricentri), 패실로마이세스 테누이페스(Paecilomyceps tenuipes) 및 패실로마이세스 자포니카(Paecilomyces japonica)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 배양은 20~35℃, pH 4~7.5, 상대습도 40~80%의 조건에서 10~30일 동안 진행되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 소루쟁이-동충하초 고체 발효물을 포함하는 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

상기 기능성은 항산화, 항염증, 탈모 방지, 피부 노화 방지 및 피부 재생 촉진으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 소루쟁이-동충하초 고체 발효물은 세포 독성이 없는 천연물 유래의 조성물로서 항산화, 항염증, 탈모 방지, 피부 노화 억제 및 피부 재생 촉진이 우수하여 항산화 작용, 항염증 작용, 탈모 예방 효과 및 항노화 작용, 특히, 피부 재생 및 주름 개선 용도의 기능성 화장료 조성물로서 적용가능하므로 화장품 산업상 매우 유용한 것이다.

도 1은 본 발명의 소루쟁이-동충하초 고체 발효 추출물 처리에 의한 염증인자 관련 유전자의 발현 양상의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 소루쟁이-동충하초 고체 발효 추출물 처리에 의한 5α-reductase 저해 활성을 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 천연물을 이용한 기능성 화장료 조성물의 소재를 개발하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 소루쟁이에 동충하초 균사체를 접종하고, 이를 고체 배양법에 따라 배양하여 수득되는 소루쟁이-동충하초 고체 발효물이 우수한 항산화능, 항염증 활성, 탈모 방지, 피부 노화 방지 및 피부 재생 활성을 가짐을 확인하고, 본 발명의 소루쟁이-동충하초 고체 발효물을 기능성 화장료 조성물로서 이용할 수 있음을 제안한다.

따라서, 본 발명은 동충하초 균사체를 멸균된 소루쟁이(Rumex coreanus)에 접종 및 배양하여 제조되는 소루쟁이-동충하초 고체 발효물을 제공한다.

본 발명의 동충하초는 자낭균류 맥각균목 동충하초과에 속하는 균류로서, 구체적으로는, 코디셉스 속(Cordyceps spp.), 패실로마이세스 속(Paecilomyces spp.), 이사리아 속(Isaria spp.), 파이토코디셉스 속(Phytocordyceps spp.) 등 100여 속으로 분류되고, 종류는 전 세계적으로 약 750여 종이 알려져 있다.

본 발명에서는, 이러한 모든 동충하초가 사용될 수 있으며, 바람직하게는, 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis), 코디셉스 밀라타리스(Cordyceps militaris), 코디셉스 스카라베콜라(Cordyceps scarabaecola), 코디셉스 누탄스(Cordyceps nutans), 코디셉스 스페코세팔라(Cordyceps sphecocephala), 코디셉스 트리센트리(Cordyceps tricentri), 패실로마이세스 테누이페스(Paecilomyceps tenuipes) 및 패실로마이세스 자포니카(Paecilomyces japonica)로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는, 눈꽃동충하초로도 명명되는 패실로마이세스 자포니카(Paecilomyces japonica)이다.

본 발명의 동충하초 균사체는 동충하초 종균을 종배양시켜 제조될 수 있다.

상기 동충하초 종균은 사용시까지 주기적으로 계대 배양하여 유지할 수 있는데, 바람직한 구체예로서, PDA(Potato Dextrose Agar) 배지에 동충하초 균사체를 접종한 후 약 25℃ 정도의 온도에서 약 4주 간격으로 계대 배양하여 유지할 수 있다.

상기 종배양은 보관 중인 동충하초 균사체 종균을 본 배양에 앞서 배양하는 과정이다. 바람직한 구체예로서, 상기 종배양은 버섯 균사체용 배지에 종균, 즉 균사체를 접종한 후, 이를 회전 진탕 배양하여 액상의 배양물로서 수득할 수 있다.

본 발명의 소루쟁이는 채취된 소루쟁이 식물을 건조시켜 사용할 수 있다. 소루쟁이 식물의 전체를 이용할 수 있으나, 바람직하게는, 뿌리를 사용하는 것이다.

상기 소루쟁이의 멸균은 준비된 소루쟁이를 수세한 후, 이를 탈수 및 건조시키고, 공지된 다양한 멸균 방법을 적용할 수 있다. 바람직한 구체예로서, 상기 멸균은 121℃에서 30분 동안 고압멸균할 수 있다.

본 발명의 동충하초 균사체를 멸균된 소루쟁이에 접종하는 방법은 상기 설명된 동충하초 종배양에 의하여 수득된 액상의 배양물의 일정량을 멸균된 소루쟁이에 무균적으로 접종하는 것이다.

동충하초 균사체를 접종 한 후, 배양 과정을 거치는데, 상기 배양의 조건은 온도 20~35℃, pH 4~7.5, 상대습도 40~80%, 배양 기간 10~30일인 것이 바람직하며, 바람직한 구체예로서, 25℃의 온도에서 상대습도 80%의 배양기에서 30일 동안 배양시킬 수 있다.

발효가 완성된 소루쟁이-동충하초 고체 발효물은 소루쟁이의 표면에 동충하초 균사체가 전체적으로 덮여 있는 형상이며, 이로부터 소루쟁이-동충하초 고체 발효물의 추출물을 제조할 수 있다.

추출에 사용되는 용매로는 물 및/또는 저급 알코올일 수 있으며, 바람직하게는 물과 에탄올의 혼합 용매이다. 바람직한 구체예로서, 수득된 소루쟁이-동충하초 고체 발효물에 약 5~20배 부피의 에탄올(10~60%(v/v))을 가하고, 1~5시간 동안 진탕시키고, 원심분리하여 상등액을 취하거나, 24~96시간 동안 침지시킨 후 감압 여과하여 사용할 수 있다. 상기 과정은 1~5회 수행될 수 있으며, 바람직하게는 3회 반복 추출할 수 있다.

상기와 같은 구체적인 제조 공정에 의하여 본 발명의 소루쟁이-동충하초 고체 발효물 또는 이의 추출물을 제조할 수 있으며, 이를 아래에 설명되는 기능성 화장료 조성물의 소재로서 적용 가능하다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 소루쟁이-동충하초 고체 발효물을 포함하는 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

상기 기능성이라 함은 항산화, 항염증, 탈모 방지, 피부 노화 방지 및 피부 재생 촉진으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 활성을 의미한다.

본 발명의 화장료 조성물의 주성분인 소루쟁이-동충하초 고체 발효물은 조성물 총 중량에 대해 0.01 내지 50중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 20중량%, 더욱 바람직하게는 1 내지 10중량%이다. 이러한 함량 범위에서 적절한 제형 안정성을 확보할 수 있으며, 목적하는 항산화, 항염증, 탈모 방지, 피부 노화 방지 및 피부 재생 촉진의 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 소루쟁이-동충하초 고체 발효물 외에도 본 발명의 유효 활성을 저해하지 않는 범위에서 항산화, 항염증, 탈모 방지, 피부 노화 방지 및 피부 재생 촉진의 효과를 위한 공지의 천연물 추출물이나 기타 성분을 추가로 포함시켜 이용할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분들, 예를 들면, 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제와 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제나 담체를 포함하여 특정 제형으로 성형될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 팩, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 팩트, 립글로즈, 립스틱, 섀도우, 샴푸 및 린스 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하에서는, 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예를 기재한 것이며, 하기 실시예에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되어 해석되는 것은 아니다.

[실시예]

1. 소루쟁이-동충하초 고체 발효 추출물의 제조

눈꽃동충하초(Paecilomyces Japonica)는 ㈜팜바이오스에서 계대중인 균주를 사용하여 25℃에서 PDA(Potato Dextrose Agar, Difco, Co., USA) 배지를 사용하여 배양하여, 4주 간격으로 계대배양하면서, 4℃에 보관하면서 사용하였다. 500ml 플라스크에 100ml 용량의 버섯 균사체 고체 배지(1 cm × 1 cm, 3개)에 계대 중인 눈꽃동충하초 균사체를 접종한 후, 회전 진탕 배양기(Daihan Labtech Co.Korea, 25±1℃, 130rpm)에서 7일간 배양하여 액체 종균으로 사용하였다.

소루쟁이는 대구 한약재 시장에서 구입하여, 사용 전 수세하여 불순물을 제거한 후 탈수하였으며, 소루쟁이 뿌리 100g을 3L 배양 용기에 넣고, 121℃에서 30분간 고압 멸균 후 상온에서 냉각하고, 상기 제조된 액체 종균 60ml을 멸균된 소루쟁이 뿌리 100g에 무균적으로 접종하였다. 발효는 25℃, 상대습도 80%의 배양기에서 30일간 진행하였다. 발효 후 10배 부피의 60% 에탄올을 첨가하여 2시간 동안 진탕 시킨 후, 72시간 침지하고, 10,000rpm으로 10분간 원심분리 후 상등액을 취하였으며, 이를 3회 반복 후 추출액을 감압 하에서 농축하여 분말로 조제하여 사용하였다.

2. 활성 평가

2.1. 항산화 활성

상기 제조된 소루쟁이-동충하초 고체 발효 추출물의 항산화 활성을 평가하였다. 제조된 소루쟁이-동충하초 고체 발효 추출물(100μg/ml)을 대상으로 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) radical 소거능 및 FRAP 활성 측정에 의해 평가하였다.

DPPH 소거능의 경우, 다양한 농도로 희석한 시료 20μl에 99.5% 에탄올에 용해시킨 2x10^-4M DPPH 용액 380μl를 넣고 혼합하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 516nm에서 microplate reader(Asys Hitech, Expert96, Asys Co., Austria)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. DPPH free radical 소거능은 아래 표 1에 나타낸 바와 같이 백분율로 표시하였다.

DPPH radical scavenging activity (% of control)
소루쟁이 원물		소루쟁이-동충하초 고체 발효
평균	편차	평균	편차
0.08	0.02	0.16	0.02

상기 표 1에 나타난 바와 같이, DPPH 라디칼 소거능은 본 발명의 소루쟁이-동충하초 고체 발효에서 소루쟁이 원물을 사용한 경우보다 증가하였음을 확인하였다.

FRAP 활성은 제조된 소루쟁이-동충하초 고체 발효물(100μg/ml)을 대상으로 공지된 방법에 따라 수행되었다. 이를 구체적으로 설명하면, FRAP assay는 화합물의 환원력(ferric reducing ability)을 측정하는 대표적인 항산화측정 방법이다. pH 3.6에서 ferric tripyridyltriazine(FeⅢ-TPTZ) 복합체가 환원제(antioxidant)에 의해서 파란색의 ferrous tripyridyltriazine(FeⅡ-TPTZ) 복합체로 될 때 흡광도를 측정하여 검색하고자 하는 화합물에 대한 환원력(ferric reducing ability)을 확인하였다. 실험을 위한 반응액으로는 acetate buffer (pH 3.6, 300mM) : 10 mM의 TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) : 20 mM의 FeCl₃·6H₂O를 10 : 1 : 1의 비율로 섞어 실험 직전에 만들어 사용을 한다. 반응액(190μL)과 추출물(10μL)을 혼합한 후 150초 간격으로 약 10분간 590nm에서 흡광도를 측정하였다.

FRAP (% of control)
소루쟁이 원물		소루쟁이-동충하초 고체 발효
평균	편차	평균	편차
0.93	0.04	1.34	0.02

상기 표 2에 나타난 바와 같이, FRAP는 본 발명의 소루쟁이-동충하초 고체 발효에서 소루쟁이 원물을 사용한 경우보다 증가하였음을 확인하였다.

2.2. 항염증 활성

염증(inflammation)은 체내에서 물리적 손상이나 신진대사의 이상과 같은 다양한 자극에 대한 방어 기작이다. 적절한 염증반응은 생체를 보호하는 필수 불가결한 반응이나, 과도하고 부적절한 염증반응은 세포 및 조직의 괴사 및 각종 만성질환의 원인이 된다. 또한, 염증은 체내 다양한 기관에서 발생할 수 있으며, 만성 염증 질환의 경우 암화(carcinogenesis)와 밀접한 관련이 있기 때문에 암으로 발전할 가능성이 있다고 알려져 있다.

염증 유도 물질인 lipopolysaccharide(LPS)는 대식세포 표면의 Toll-like receptor 4를 자극하여 하부 세포신호전달경로인 mitogen-activated protein kinase (MAPK)의 활성화를 유도한다. MAPK 중 extracellular signal-regulated kinase(ERK)와 p38은 LPS로 자극된 iNOS 유도와 대식세포의 NO생성에 관련이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 염증 조절인자 중 하나인 nitric oxide (NO)는 과량이 존재하면 인체에 유해한 영향을 미치게 되어 염증반응 및 세포손상 뿐만 아니라 뇌막염, 알츠하이머병과 파킨슨병 같은 퇴행성 질환의 중요한 발생 요인으로 작용하는 것으로 알려져 있다.

본 실험에서는 항염증 활성 측정으로 Griess reagent assay를 수행하였다. NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess reagent를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 5×10⁴ cells/ml로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, 5% CO₂ incubator에서 24시간 전 배양하였다. 세포에 1 μg/ml의 LPS를 처리하고 1시간 뒤에 100 μg/ml의 추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후 griess 시약과 반응 시킨 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성율을 백분율로 표시하였다.

NO 생성량 (% of control)
소루쟁이 원물		소루쟁이-동충하초 고체 발효
평균	편차	평균	편차
17.68	0.03	9.37	0.02

상기 표 3에 나타난 바와 같이, NO 생성량은 본 발명의 소루쟁이-동충하초 고체 발효에서 소루쟁이 원물을 사용한 경우보다 크게 감소하였음을 확인하였다.

2.3. 면역 관련 유전자 발현 양상

염증 반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상 부위를 수복 재생하려는 기전이다. 일단 자극이 가해지면 국소적으로 염증성 성분과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발하지만 지속적인 염증반응은 도리어 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 여러 질환을 발생시키는 원인이 된다.

한편, 대식세포는 선천성면역 뿐만 아니라 획득면역 등 다양한 숙주반응에 관여하여 항상성 유지에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 염증반응 시에는 nitric oxide (NO)와 cytokine을 생산하여 감염 초기에 생체방어에 중요한 역할을 한다.

포유동물 세포의 nitric oxide synthase (NOS)의 경우, 유사형태가 3가지 존재하는데 neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS), 그리고 inducinle NOS (iNOS)이다. 그 중에서 특히 iNOS가 염증반응에 관여한다.

nNOS와 eNOS는 항상 발현되어 있으며, iNOS의 경우 interferon-γ, lipopolysaccharide (LPS), 그리고 여러 가지 염증 사이토카인의 자극이 있을 때 발현된다. 또한, NO는 급성, 만성 염증반응을 조절하기도 한다.

PGE2는 cyclooxygenase(COX)에 의해서 arachidonic acid로부터 생산된다. COX에 대해서는 1990년대 초반에 주로 연구되었는데, 이 또한 유사형태가 2가지 존재한다. COX-1은 거의 모든 조직에 발현되어 있고, prostagrandin을 생산하여 신장의 혈액흐름을 조절하거나 위장의 세포를 보호하는 등의 생리적인 기능을 조절한다.

반대로 COX-2의 경우는 미생물에 의한 감염이나 손상 혹은 여러 요인의 스트레스에 반응한 대식세포(macrophage)에서 발현된다. 즉, iNOS와 COX-2의 발현과 NO, prostaglandin E2 (PGE2)는 면역세포의 대표적인 염증인자이다.

또한, 염증인자로 염증성 사이토카인 (proinflammatory cytokines)인 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) 등이 포함된다.

본 실험에서, RAW 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 5×10⁴ cells/ml로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 세포에 1 μg/ml의 LPS를 처리 한 뒤 1시간 후에 10 μg/ml의 추출물/시료을 처리하여 24시간 배양하였다. 항염증관련 인자의 발현을 확인하기 위하여 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)으로 분석을 실시하였다.

TRIzol reagent(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 4 ℃에서 1시간 동안 처리하여 RNA를 분리/정량한 후, 각각의 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1X TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 50 V에서 전기영동을 행하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide (EtBr)을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 발현의 차이를 확인하였으며, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, RAW264.7 세포에서의 LPS 처리 결과 염증 관련 factor인 TNF-α, COX-2, IL-1β, IL-6가 증가하는 양상을 확인하였다. 한편, 소루쟁이 원물을 처리한 경우와 본 발명의 소루쟁이-동충하초 고체 발효 추출물을 각각 처리한 경우를 비교하면, 본 발명의 고체 발효 추출물에서 상기 유전자들의 발현량이 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었다.

2.4. 5α-reductase assay

탈모는 머리백선증, 외상탈모증, 유전성 대머리, 약물 부작용, 안드로겐성 탈모, 원형탈모증 등의 다양한 원인에 의해 발생한다. 특히 안드로겐성 탈모(androgenic hair loss)는 일반적인 원형 탈모형태로 나타나며, 탈모의 가장 전형적인 형태이다.

포유류의 androgen 호르몬으로는 대표적으로 testosterone과 dihydrotestosterone이 있는데, 탈모 환자의 경우에 dihydrotestosterone이 더 많이 나타남이 보고되었다. Testosterone은 5α-reductase에 의해서 dihydrotestosterone으로 전환되는데, 본 연구에서는 이의 억제 정도를 판별하고자 하였다.

5α-Reductase 활성 저해 효과는 rat prostate에서 5α-reductase를 직접 분리하여 평가하였다. 구체적인 방법으로는, 7주령 SD rat 수컷을 sacrifice하여 전립선을 취하고, 이를 액체질소를 이용하여 균질화하였다. 균질화된 조직은 cold lysis buffer (20 mM potassium phosphate (pH 6.6), 0.32 M sucrose, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.2 mM phenylmethyl-sulfonylfluoride (PMSF))로 단백질을 lysis시키고, 균질화된 조직은 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0)를 3배 비율로 넣고, 원심분리를 이용하여 상등액은 수확한 다음에 다시 원심분리 해서 중간 증은 5α-Reductase로 사용하였다.

Working solution는 10 mM Tris-HCl buffer (pH 6.0) 90 μL, 20 μM testosterone 50 μL, 2 mM NADPH, 10 μL, 100 mg/mL enzyme 50 μL로 제조하였다. 시료의 첨가량은 총 반응액의 1% 농도로 처리하여 저해 정도를 측정하였다. 효소반응은 37℃에 1 h incubation하고, 이의 흡광도 변화량을 UV-spectrophotometric 340 nm 조건에서 측정하였다.

실험 결과는 도 2에 나타내었으며, 양성대조군으로는 finasteride를 10, 100 μM 농도로 사용하였고, 100 μM에서 약 20% 정도의 저해활성이 확인되었다. 한편, 소루쟁이 원물의 경우 100 μg/ml의 농도에서 대조군보다 효소 활성을 증가시켰으나, 본 발명의 고체 발효 추출물의 경우 대조군 대비 약 40%의 효소 활성 감소를 확인하였다.

2.5. 세포독성시험(MTT assay)

소루쟁이-동충하초 고체 발효물의 세포 독성을 평가하기 위하여, BJ cell을 이용하여 MTT assay를 측정한 후, cell viability(%)를 측정하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

시료 농도(μg/ml)	소루쟁이 원물	소루쟁이-동충하초 고체 발효
25	77.93	87.57
50	58.44	70.23
100	36.59	50.67

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 소루쟁이 원물의 경우 시료의 농도가 100μg/ml인 경우 cell viability가 50% 미만으로 감소하는 모습을 보였다. 또한, 소루쟁이 원물은 농도 증가에 따라 세포 생존율이 감소하는 경향이 뚜렸하였지만, 소루쟁이-동충하초 고체 발효물의 경우, 100μg/ml의 고농도에서도 50% 이상의 세포생존율을 나타내었다.

Claims (5)

1. 동충하초 균사체를 멸균된 소루쟁이(Rumex coreanus)에 접종 및 배양하여 제조되는 소루쟁이-동충하초 고체 발효물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 동충하초는 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis), 코디셉스 밀라타리스(Cordyceps militaris), 코디셉스 스카라베콜라(Cordyceps scarabaecola), 코디셉스 누탄스(Cordyceps nutans), 코디셉스 스페코세팔라(Cordyceps sphecocephala), 코디셉스 트리센트리(Cordyceps tricentri), 패실로마이세스 테누이페스(Paecilomyceps tenuipes) 및 패실로마이세스 자포니카(Paecilomyces japonica)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 소루쟁이-동충하초 고체 발효물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 배양은 20~35℃, pH 4~7.5, 상대습도 40~80%의 조건에서 10~30일 동안 진행되는 것을 특징으로 하는 소루쟁이-동충하초 고체 발효물.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 기재된 소루쟁이-동충하초 고체 발효물을 포함하는 기능성 화장료 조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 기능성은 항산화, 항염증, 탈모 방지, 피부 노화 방지 및 피부 재생 촉진으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기능성 화장료 조성물.

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