CN115058472A - 槐米提取槲皮素产生的废弃液回收生产多杀菌素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种槐米提取槲皮素产生的废弃液回收生产多杀菌素的方法，所述方法包括：将所述槐米提取槲皮素产生的废弃液配置得到液体培养基；在所述液体培养基中接种刺糖多孢菌进行发酵，发酵结束后得到多杀菌素。根据本发明提供的方法，不仅能够充分利用槐米提取槲皮素产生的废弃液，节约资源的同时减少了废水排放，而且还能生产得到多杀菌素，降低多杀菌素的生产成本。

Description

槐米提取槲皮素产生的废弃液回收生产多杀菌素的方法

技术领域

本发明涉及一种槐米提取槲皮素产生的废弃液回收生产多杀菌素的方法，涉及微生物发酵技术领域。

背景技术

槐米为豆科植物槐的未开放花蕾，槐米的主要成分为芦丁，其含量可达到12-16％，其次为槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素等，其中，槲皮素作为黄酮醇的一种代表性化合物，具有很高的药用价值，槲皮素作为药效成分的中药制剂能对缺血再灌性心律失常有保护作用，降低血脂，增强毛细血管脂性，扩张冠状动脉，增加冠脉血流量作用，增强心肌收缩力，舒张肠平滑肌，降低血压，降低胆固醇，降低血小板膜脂质流动性，免疫抑制和抗过敏作用，抗癌防癌作用，祛痰、止咳、平喘作用，因此，以槐米为原料进行槲皮素的提取得到了广泛的应用。

以槐米为原料进行槲皮素的提取通常需要提取得到芦丁，然后在芦丁中加入稀酸溶液进行酸解，酸解结束后得到的沉淀即为槲皮素，滤液以及对沉淀进行水洗过程中产生的酸性溶液均为废弃液，这部分废弃液经pH调节至中性后直接排出，这不仅造成了环境污染，还浪费了资源，因此，如何对槐米提取槲皮素产生的废弃液进行回收利用，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明提供一种槐米提取槲皮素产生的废弃液回收生产多杀菌素的方法，用于对对槐米提取槲皮素产生的废弃液进行回收利用，解决环境污染和资源浪费的问题，并生产得到多杀菌素。

本发明提供一种槐米提取槲皮素产生的废弃液回收生产多杀菌素的方法，所述方法包括：

将所述槐米提取槲皮素产生的废弃液配置得到液体培养基；

在所述液体培养基中接种刺糖多孢菌进行发酵，发酵结束后得到多杀菌素。

槐米中富含芦丁、槲皮素等物质，其中，槲皮素具有较高的药用价值。槲皮素的提取通常是利用芦丁分子在酸液中易沉淀析出的性质，首先从槐米中分离提取得到芦丁粗品，随后利用芦丁易溶热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行芦丁精制，然后在芦丁中加入稀酸溶液酸解生成槲皮素。具体提取步骤可根据本领域常规技术手段进行，例如，将槐米置于烧杯中，加入饱和石灰水没过槐米，加热进行反应，趁热收集滤液，在60-70℃下用浓盐酸调节滤液的pH至4-5，静置一段时间后过滤并收集沉淀即为芦丁粗品，随后将芦丁粗品溶于热水中，趁热过滤并降温进行芦丁精制；接着，在芦丁中加入稀硫酸、稀盐酸等稀酸溶液，加热酸解一定时间后，收集沉淀后即可得到槲皮素，从芦丁酸解得到槲皮素过程中，酸解结束后剩余的稀酸溶液以及沉淀槲皮素清洗过程中产生的废弃液通常调整pH为中性后排出，不仅造成资源浪费，还容易污染环境；经研究发现，该废弃液中含有葡萄糖、鼠李糖以及多种氨基酸和无机盐，刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)可以利用废弃液中的有机物质进行生长代谢，并发酵得到多杀菌素。多杀菌素(Spinosad)是一类大环内酯类生物活性物质，对大部分鳞翅目、双翅目农业害虫都具有高效杀灭效果，对其它农业害虫也有一定防治效果，关键是多杀菌素对人和环境都非常安全，并且可生物降解，是一种非常理想的“绿色农药”。因此，根据本发明提供的方法，不仅能够使槐米提取槲皮素后产生的废弃液得到了充分利用，节约资源的同时减少了废水排放，而且还能生产得到多杀菌素，降低多杀菌素的生产成本。

在一种具体实施方式中，槐米提取槲皮素产生的废弃液回收生产多杀菌素的方法具体包括如下步骤：

步骤1、将所述槐米提取槲皮素产生的废弃液配置得到液体培养基；

废弃液中主要为稀酸溶液，pH较低，大约为1，因此，首先需要在废弃液中加入碱性物质调节其pH至偏碱性，具体为7-8，达到刺糖多孢菌适宜的生长代谢pH范围，所使用的碱性物质可以为氢氧化钠、氢氧化钾等。

随后，为了进一步提高多杀菌素的发酵量，需要在废弃液中加入所述刺糖多孢菌生长所需的碳源、氮源和无机盐，经过研究发现，不同物质对多杀菌素的发酵量有较大的影响。例如，相比葡萄糖，麦芽糖有助于提高多杀菌素的发酵量，相比花生饼粉、鱼粉，黄豆饼粉和棉籽饼粉有助于提高多杀菌素的发酵量。因此，本实施方式对发酵培养基中的碳源、氮源和无机盐进行优化，具体地：

所述碳源包括麦芽糖和豆油，豆油不仅有助于提高多杀菌素的发酵量，还能起到消泡剂的作用，减少发酵过程中气泡的产生。进一步地，基于每升所述槐米提取槲皮素产生的废弃液，所加入的麦芽糖的质量为8g/L，豆油的质量为2g/L。

所述氮源包括酵母粉、黄豆饼粉和棉籽饼粉，且基于每升所述槐米提取槲皮素产生的废弃液，所加入的酵母粉的质量为2g/L，黄豆饼粉的质量为1g/L，棉籽饼粉的质量为3g/L。

所述无机盐包括磷酸氢二钾、硫酸镁和碳酸钙，且基于每升所述槐米提取槲皮素产生的废弃液，所加入的磷酸氢二钾的质量为0.1g/L，硫酸镁的质量为0.1g/L，碳酸钙的质量为0.4g/L。

最后，将废弃液与碳源、氮源和无机盐的混合溶液搅拌均匀，并进行高温灭菌，具体地，灭菌温度为121-123℃，时间为20-30min，灭菌结束后，得到液体培养基，冷却至室温备用。

步骤2、在所述液体培养基中接种刺糖多孢菌进行发酵，发酵结束后得到多杀菌素。

将刺糖多孢菌接种在种子培养基中，本发明所使用的刺糖多孢菌为可以生产得到多杀菌素的菌株，具体可以为公开号CN111849807A的中国发明专利公开的刺糖多孢菌，其于2019年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101)，分类命名为刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa，保藏编号为CGMCC NO.18681；种子培养基包括葡萄糖10g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨15g/L、黄豆饼粉10g/L、磷酸氢二钾5g/L和硫酸镁2g/L，随后，在摇床上进行培养，摇床转速为220-230rpm，温度为28-30℃，时间为3-4天，培养结束后，得到刺糖多孢菌的种子液。

接着，将所述种子液按照体积分数10％-12％接种于所述液体培养基中进行发酵，发酵可根据本领域常规技术手段进行，具体地，所述发酵在摇床上进行，所述摇床的转速为220-230rpm，所述发酵温度为28-30℃，发酵时间为10-12天，发酵结束后即可从发酵液中提取得到多杀菌素。

综上，根据本发明提供的方法，不仅能够使槐米提取槲皮素后产生的废弃液得到了充分利用，节约资源的同时减少了废水排放，而且还能生产得到多杀菌素，降低多杀菌素的生产成本。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

下述实施例所使用的刺糖多孢菌于2019年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18681，可通过该保藏中心购买得到。

实施例1

本实施例提供一种利用槐米提取槲皮素产生的废弃液发酵方法，具体包括如下步骤：

步骤1、在废弃液中加入氢氧化钠，调节其pH至7-8；

步骤2、在废弃液中加入葡萄糖8g/L、菜籽油2g/L、黄豆饼粉1g/L、蛋白胨2g/L、棉籽饼粉3g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙0.4g/L，搅拌均匀后在121℃灭菌30min得到液体培养基，冷却至室温后备用；

步骤3、将培养成熟的刺糖多孢菌接种在种子培养基中，种子培养基包括葡萄糖10g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨15g/L、黄豆饼粉10g/L、磷酸氢二钾5g/L和硫酸镁2g/L，在摇床(转速220rpm)上进行培养，培养温度为28-30℃，培养3天后得到种子液；

步骤4、按体积分数10％将种子液接种至步骤2得到的液体培养基中，在28-30℃，220rpm振摇培养10天，得到含多杀菌素的发酵液，经HPLC检测，发酵液中多杀菌素含量为2316μg/mL。

实施例2

本实施例提供的废弃液发酵方法可参考实施例1，区别在于碳源不同，具体地，在废弃液中加入葡萄糖8g/L、豆油2g/L、黄豆饼粉1g/L、蛋白胨2g/L、棉籽饼粉3g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙0.4g/L，搅拌均匀后在121℃灭菌30min得到液体培养基。

实施例3

本实施例提供的废弃液发酵方法可参考实施例1，区别在于碳源不同，具体地，在废弃液中加入麦芽糖8g/L、菜籽油2g/L、黄豆饼粉1g/L、蛋白胨2g/L、棉籽饼粉3g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙0.4g/L，搅拌均匀后在121℃灭菌30min得到液体培养基。

实施例4

本实施例提供的废弃液发酵方法可参考实施例1，区别在于碳源不同，具体地，在废弃液中加入麦芽糖8g/L、豆油2g/L、黄豆饼粉1g/L、蛋白胨2g/L、棉籽饼粉3g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙0.4g/L，搅拌均匀后在121℃灭菌30min得到液体培养基。

表1实施例1-4提供的发酵培养基以及多杀菌素含量

根据表1可知，当碳源使用麦芽糖8g/L和豆油2g/L的组合进行发酵时，即实施例4，发酵得到的多杀菌素的含量最高，因此，确定碳源为麦芽糖8g/L和豆油2g/L。

实施例5

本实施例提供的废弃液发酵方法可参考实施例4，区别在于氮源不同，具体地，在废弃液中加入麦芽糖8g/L、豆油2g/L、花生饼粉1g/L、蛋白胨2g/L、棉籽饼粉3g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙0.4g/L，搅拌均匀后在121℃灭菌30min得到液体培养基。

实施例6

本实施例提供的废弃液发酵方法可参考实施例5，区别在于氮源不同，具体地，在废弃液中加入麦芽糖8g/L、豆油2g/L、黄豆饼粉1g/L、酵母粉2g/L、棉籽饼粉3g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙0.4g/L，搅拌均匀后在121℃灭菌30min得到液体培养基。

实施例7

本实施例提供的废弃液发酵方法可参考实施例5，区别在于氮源不同，具体地，在废弃液中加入麦芽糖8g/L、豆油2g/L、黄豆饼粉1g/L、蛋白胨2g/L、鱼粉3g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙0.4g/L，搅拌均匀后在121℃灭菌30min得到液体培养基。

表2实施例5-7提供的发酵培养基以及多杀菌素含量

根据表2可知，当氮源采用黄豆饼粉1g/L、酵母粉2g/L、棉籽饼粉3g/L的组合进行发酵时，即实施例6，发酵得到的多杀菌素含量最高，因此，确定氮源为黄豆饼粉1g/L、酵母粉2g/L、棉籽饼粉3g/L。

实施例8

本实施例提供的废弃液发酵方法可参考实施例6，区别在于无机盐不同，具体的，在废弃液中加入麦芽糖8g/L、豆油2g/L、黄豆饼粉1g/L、酵母粉2g/L、棉籽饼粉3g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙0.4g/L，搅拌均匀后在121℃灭菌30min得到液体培养基。

实施例9

本实施例提供的废弃液发酵方法可参考实施例8，区别在于无机盐不同，具体的，在废弃液中加入麦芽糖8g/L、豆油2g/L、黄豆饼粉1g/L、酵母粉2g/L、棉籽饼粉3g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙0.2g/L，搅拌均匀后在121℃灭菌30min得到液体培养基。

实施例10

本实施例提供的废弃液发酵方法可参考实施例8，区别在于无机盐不同，具体的，在废弃液中加入麦芽糖8g/L、豆油2g/L、黄豆饼粉1g/L、酵母粉2g/L、棉籽饼粉3g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硫酸镁0.1g/L、碳酸钙0.4g/L，搅拌均匀后在121℃灭菌30min得到液体培养基。

表3实施例8-10提供的发酵培养基以及多杀菌素含量

根据表3可知，当无机盐采用磷酸氢二钾0.1g/L、硫酸镁0.1g/L、碳酸钙0.4g/L的组合时，即实施例10，发酵得到的多杀菌素含量最高，因此，确定无机盐为磷酸氢二钾0.1g/L、硫酸镁0.1g/L、碳酸钙0.4g/L。

通过实施例1-10的培养基优化，确定最优发酵培养基，具体包括碳源、氮源和无机盐，其中，碳源包括麦芽糖和豆油，且麦芽糖的质量为8g/L，豆油的质量为2g/L；氮源包括酵母粉、黄豆饼粉和棉籽饼粉，且酵母粉的质量为2g/L，黄豆饼粉的质量为1g/L，棉籽饼粉的质量为3g/L；无机盐包括磷酸氢二钾、硫酸镁和碳酸钙，且磷酸氢二钾的质量为0.1g/L，硫酸镁的质量为0.1g/L，碳酸钙的质量为0.4g/L。

对比例1

本对比例提供的废弃液发酵方法可参考实施例1，区别在于，将废弃液调节pH并灭菌后直接作为液体培养基，按体积分数10％将种子液接种至废弃液中，在28-30℃，220rpm振摇培养10天，得到含多杀菌素的发酵液。

采用与实施例1相同的HPLC检测方法，经检测，对比例1得到的发酵液中多杀菌素含量为452μg/mL，表明在废弃液中还需添加碳源、氮源和无机盐作为刺糖多孢菌生长代谢的营养物质，以提高多杀菌素的发酵量。

对比例2

本对比例提供一种刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，具体包括如下步骤：

步骤1、按照葡萄糖8g/L、菜籽油2g/L、黄豆饼粉1g/L、蛋白胨2g/L、棉籽饼粉3g/L、硫酸镁0.2g/L、碳酸钙0.4g/L与水混合均匀，在121℃下灭菌30min得到液体培养基，冷却至常温后备用；

步骤2、将培养成熟的刺糖多孢菌接种在种子培养基中，种子培养基以及培养方法与实施例1相同，培养结束后得到种子液，并按体积分数10％将种子液接种至液体培养基中，在28-30℃，220rpm振摇培养10天，得到含多杀菌素的发酵液。

采用与实施例1相同的HPLC检测方法，经检测，对比例2得到的发酵液中多杀菌素含量为2061μg/mL，明显低于实施例1，表明使用槐米提取槲皮素后产生的废弃液搭配其他营养物质进行刺糖多孢菌发酵，能够有效提高多杀菌素的发酵量，降低多杀菌素的生产成本。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种槐米提取槲皮素产生的废弃液回收生产多杀菌素的方法，其特征在于，所述方法包括：

将所述槐米提取槲皮素产生的废弃液配置得到液体培养基；

在所述液体培养基中接种刺糖多孢菌进行发酵，发酵结束后得到多杀菌素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述刺糖多孢菌的保藏编号为CGMCCNO.18681。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将所述槐米提取槲皮素产生的废弃液配置得到液体培养基，具体包括如下步骤：

将所述槐米提取槲皮素产生的废弃液的pH调节至7-8；

加入所述刺糖多孢菌生长所需的碳源、氮源和无机盐，得到所述液体培养基。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述碳源包括麦芽糖和豆油，且基于每升所述槐米提取槲皮素产生的废弃液，所加入的麦芽糖的质量为8g/L，豆油的质量为2g/L。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氮源包括酵母粉、黄豆饼粉和棉籽饼粉，且基于每升所述槐米提取槲皮素产生的废弃液，所加入的酵母粉的质量为2g/L，黄豆饼粉的质量为1g/L，棉籽饼粉的质量为3g/L。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述无机盐包括磷酸氢二钾、硫酸镁和碳酸钙，且基于每升所述槐米提取槲皮素产生的废弃液，所加入的磷酸氢二钾的质量为0.1g/L，硫酸镁的质量为0.1g/L，碳酸钙的质量为0.4g/L。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，对所述液体培养基进行灭菌，灭菌温度为121-123℃，时间为20-30min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述刺糖多孢菌接种在种子培养基中进行培养，得到种子液，将所述种子液按照体积分数10％-12％接种于所述液体培养基中进行发酵。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括葡萄糖10g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨15g/L、黄豆饼粉10g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁2g/L。

10.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为28-30℃，时间为10-12天。