CN115043839B - 一种苦参碱类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苦参碱类衍生物及其制备方法和应用。该苦参碱类衍生物具有如式(Ⅰ)或或式(Ⅱ)所示结构的化合物及其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、药学上可接受的盐及前药、水合物、溶剂化物或代谢产物：R₁为硝基、三氟甲基或氰基；R₂为硝基或三氟甲基。本发明提供的苦参碱类衍生物具有更高的杀虫活性，且制法简便、成本低廉，环境相容性好，可制备为环保型高效性、高环境相容性和经济性的杀虫剂。

Description

一种苦参碱类衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化学医药技术领域，特别涉及一种苦参碱类衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

苦参碱为针状或棱状结晶，分子式为C₁₅H₂₄N₂O，相对分子质量为248.36，英语名matrine，熔点为76℃，易溶于水、苯、氯仿、乙醚和二氧化碳，难溶于石油醚。苦参碱(Matrine)广泛存在于苦参(SophoraflavescennsAit)、苦豆子(SophoraalopecuroidesL)及广豆根(S.subprostrata Chan et T Chen)等豆科植物，具有多方面重要的药理活性，研究发现其有镇静、缓痛、清热、降温等中枢抑制性作用，对结核杆菌等有较好的抑制作用，同时在心血管系统、消化系统、抗肿瘤作用等方面也有较好的药用价值。

近年来许多研究人员通过细胞生物学、分子生物学方法等技术手段在苦参碱农用生物活性实验上做了许多尝试，发现其具有杀虫、抗菌和生长调节等生物活性。苦参碱作为传统生物农药具有低毒安全、低残留、绿色环保等优点，但也有其不容忽视的缺点，如生物利用度低，生物活性较差，使用量大，不易溶于水等，从而限制了其推广应用。目前，苦参碱的杀虫作用机理尚不完全明确，相关研究发现可能作用于神经系统，先麻痹中枢神经，然后使中枢神经产生兴奋，进而作用于横膈膜及呼吸肌神经，使昆虫窒息而死亡。通过化学方法对其结构进行修饰、转化和生物活性比较分析，确定其分子结构的关键活性键位及功能基团，再经过优化合成新的苦参碱衍生物，提高苦参碱的生物活性和生物利用度，最终成功设计和创制绿色、环保、高效的苦参碱类农药候选化合物成为研究者们的工作重点。

含氮杂环化合物由于其独特的作用机制及其高活性、高选择性、高环境相容性的特点，一直是新农药发展的主流。目前已有一批通过结构修饰的杀虫剂新品种得以成功开发并进入市场，其中具有噻唑环结构的新烟碱类杀虫剂具有高效广谱、选择性好、对环境相容性好等特点，已广泛用于刺吸式口器害虫、各类甲虫及某些鳞翅目害虫的防治。

专利201710412481.0公开了一类具有杀虫活性的化合物，但该类化合物只表现出了中等的活性，其对中枢神经也有一定毒性，在杀虫方面的效果仍然有限，限制了苦参碱的临床应用以及进一步推广。

专利202010119640.X公开了一类具有杀虫活性的卤代吡唑苦参碱衍生物，该类衍生物对翅鳞目害虫有较好的防治效果，但仍存在一定的提升空间，也限制了苦参碱的临床应用以及进一步推广。

因此，以苦参碱为基础，研发具有更佳的杀虫活性的新型衍生物具有重要的研究价值。

发明内容

本发明的目的在于现有苦参碱衍生物存在防治效果仍有一定的提升空间的缺陷或不足，提供一种苦参碱类衍生物。本发明提供的苦参碱类衍生物具有更高的杀虫活性，且制法简便、成本低廉，环境相容性好，可制备为环保型高效性、高环境相容性和经济性的杀虫剂。

本发明的另一目的在于提供上述苦参碱类衍生物的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述苦参碱类衍生物在制备预防和/或杀治害虫的杀虫剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种杀虫组合物。

本发明的另一目的在于提供一种预防和/或杀治害虫的方法。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种苦参碱类衍生物，具有如式(Ⅰ)或或式(Ⅱ)所示结构的化合物及其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、药学上可接受的盐及前药、水合物、溶剂化物或代谢产物：

R为硝基、三氟甲基或氰基。

本发明经研究发现，在苦参碱的特定位点引入特定的R基团，得到的苦参类碱衍生物具有更高的杀虫活性，且制法简便、成本低廉，环境相容性好，可制备为环保型高效性、高环境相容性和经济性的杀虫剂。

优选地，所述苦参类碱衍生物具有如下所示结构的化合物及其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、药学上可接受的盐及前药、水合物、溶剂化物或代谢产物：

上述苦参类碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：在催化剂和溶剂存在的条件下，式(Ⅲ)或式(Ⅳ)所示的吡唑衍生物与槐果碱反应，即得所述苦参类碱衍生物；

苦参碱的13、14位均为饱和键，引入基团的难度相对较大，本发明人经过广泛而深入的研究，将以13、14位带不饱和双键的苦参碱类似物槐果碱为原料，与特定的吡唑衍生物反应，可降低合成反应的复杂性和基团引入的难度，成功制备得到苦参类碱衍生物。

优选地，所述槐果碱和吡唑衍生物的摩尔比为1:(1～1.5)，优选为1:1.2。

本发明还通过探究发现，以槐果碱和吡唑衍生物作为反应原料时，可在水相或有机相和弱碱催化体系中反应，而不需在强碱性催化剂的条件下进行，从而大大简化了工艺路线，降低了化合物的制备成本，使得化合物的实际应用价值得到提高。

优选地，所述催化剂的用量为槐果碱摩尔量的1～1.5倍。

优选地，所述催化剂为碳酸氟、碳酸铯、氟化铯或固体碱中的一种或多种。

溶剂既可选用水，也可选用有机溶剂。

优选地，所述溶剂为1,4-二氧六环、乙腈、水、DMSO、甲醇、乙醇或石油醚中的一种或多种

优选地，所述槐果碱与溶剂的质量体积比为1:(30～70)。

反应的温度和时间可根据实际情况调整，得到苦参类碱衍生物即可。

优选地，所述反应的温度为80～120℃，反应的时间为2.5～8h。在此条件下，制备得到的苦参类碱衍生物产率和纯度较高，可以减少副产物的生成。

优选地，所述反应后还包括柱层析分析、旋蒸浓缩，结晶步骤。

更为优选地，所述柱层析分析中，固定相为硅胶；流动相为乙腈和乙醇的混合物，混合物中乙腈和乙醇的体积比为(6～12):1。

优选地，重结晶选用的溶剂为乙醇、甲醇或乙酸乙酯中的一种或几种。

具体地，所述反应后还包括如下步骤：(1)采用硅胶柱层析法：用硅胶作为固定相，加入400mm*30mm i.d.层析柱，流动相为乙腈和乙醇的混合物，湿法装柱完成后，反复用流动相过柱活化；用灯照层析柱确认无气泡或断层，硅胶沉积面上方保持5cm以上液面，封口，流动相浸泡静置过夜；

(2)进样与洗脱：使用少量洗脱剂溶解试样后上样，样品渗入硅胶柱后再用少量洗脱剂冲洗柱内壁，使液面降至硅胶沉积面即加入大量洗脱剂开始洗脱。每流出10mL馏分收集一次，蒸去大部分溶剂后用于检测；

(3)检测：TLC薄层色谱跟踪检测分析分离液中目标产物的开始流出时间和洗脱剂体积，目标物洗脱完毕时间和洗脱溶剂体积，合并目标产物开始流出和洗脱完毕时间点之间的所有洗脱样品，浓缩；

(4)重结晶：将浓缩的产品用重结晶溶剂溶解，挥发至晶体析出，重复2～3次，即得所述苦参类碱衍生物。

上述苦参碱类衍生物在制备预防和/或杀治害虫的杀虫剂中的应用也在本发明的保护范围内。

优选地，所述害虫为公共卫生害虫、农业害虫或禽畜病源虫中的一种或几种。

优选地，所述害虫为昆虫、蚜虫、线虫或螨虫中的一种或几种。

更为优选地，所述昆虫为草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda 9)、双翅目迟眼蕈蚊(Bradysiaodoriphage)、鳞翅目稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)、茶尺蠖(Ectropis oblique hypulinaWehrli)、杨扇舟蛾[Closteraanachoreta(Denis etSchiffermüller，1775)]、直翅目蝗虫、同翅目苹果棉蚜[Eriosomalanigerum(Hausmann)]、梨木虱、膜翅目樟叶蜂(MesonurarufonotaRohwer)、以及桑园害虫如桑尺蠖(PhthonandriaatrilineataButler)、棉大造桥虫(AscotisselenariaSchiffermuller etDenis)、桑毛虫(Porthesiaxanthocampa Dyer)、红腹白灯蛾[Spilarctiasubcarnea(Walker)]、白毛虫(Pilargidae)、桑蓟马(Pseudcdendrothrips mori Niwa)或朱砂叶螨(Tetranychuscinnabarinus)等。

更为优选地，所述蚜虫为菜蚜、桃蚜、棉蚜、麦长管蚜、麦二岔蚜、玉米蚜或萝卜蚜中一种或几种。

更为优选地，所述线虫为植物寄生线虫，例如根结线虫。

进一步优选地，所述根结线虫选自桑根结线虫、红薯根结线虫、胡萝卜根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫或番茄根结线虫中的一种或多种。

更为优选地，所述粘虫为寄主于农作物上的农业害虫。

本发明还请求保护一种杀虫组合物，包括上述苦参类碱衍生物，所述苦参类碱衍生物的质量分数为0.0001wt％～30wt.％；进一步优选为0.1wt％～25wt％；更进一步优选为0.5wt％～20wt％。

所述组合物的剂型可为各种常规农药剂型。例如溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、颗粒剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂，特别是环境相容性好的可溶性固体和液体制剂，如水分散粒剂、水溶剂、水乳剂、超低容量制剂等，用活性物质浸渍的天然的和合成的材料，在多聚物中的微胶囊，用于种子的包衣复方，和与燃烧装置-块使用的制剂，例如烟熏药筒、烟熏罐和烟熏盘，以及ULV冷雾(Cold mist)和热雾(Warm mist)制剂。这些制剂可用已知的方法生产，例如，将活性化合物与扩充剂混合，这些扩充剂就是液体的或液化气的或固体的稀释剂或载体，并可任意选用表面活性剂即乳化剂和/或分散剂和/或泡沫形成剂。例如在用水作扩充剂时，有机溶剂也可用作助剂。

用液体溶剂作稀释剂或载体时，基本上是合适的，如：芳香烃类，例如二甲苯、甲苯或烷基萘；氯化的芳香或氯化的脂肪烃类，例如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷；脂肪烃类，例如环己烷或石蜡，例如矿物油馏分；醇类，例如乙醇或乙二醇以及它们的醚和脂类；酮类，例如丙酮、甲乙酮、甲基异丁基酮或环己酮；或不常用的极性溶剂，例如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、水。

固体载体可用地面天然的矿物质，例如高岭土，粘土，滑石，石英，活性白土，蒙脱土，或硅藻土，和地面合成的矿物质，例如高度分散的硅酸，氧化铝和硅酸盐。供颗粒用的固体载体是碾碎的和分级的天然锆石，例如方解石、大理石、浮石、海泡石和白云石，以及无机和有机粗粉合成的颗粒，和有机材料例如锯木屑、椰子壳、玉米棒子和烟草梗的颗粒等。

非离子的和阴离子的乳化剂可用作乳化剂和/或泡沫形成剂。例如聚氧乙烯-脂肪酸酯类、聚氧乙烯-脂肪醇醚类，例如烷芳基聚乙二醇醚类、烷基磺酸酯类、芳基磺酸酯类以及白蛋白水解产物。分散剂包括，例如木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。

在制剂中可以用粘合剂，例如羧甲基纤维素和以粉末、颗粒或乳液形式的天然和合成的多聚物，例如阿拉伯胶、聚乙烯基醇和聚乙烯醋酸酯。

可以用着色剂例如无机染料，如氧化铁、氧化钻；有机染料，如有机染料，如偶氯染料或金属钛菁染料；和用痕量营养剂，如铁、猛、硼、铜、钴、铝和锌的盐等。

本发明的这些苦参类碱衍生物可与其他活性化合物制成一种混合物存在于它们的商品制剂中或从这些制剂制备的使用剂型中，这些其他的活性化合物为杀虫剂、饵剂、杀菌剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀真菌剂、生长控制剂等。例如磷酸酯类、氨基甲酸酯类、除虫菊酯类、氯化烃类、苯甲酰脲类、沙蚕毒素类以及由微生物产生的物质，如阿维菌素。

此外，本发明的苦参类碱衍生物也可与增效剂制成一种混合物存在于它们的商品制剂中成从这些制剂制备的使用剂型中。增效剂是提高活性化合物作用的化合物，由于苦参类碱衍生物本身有活性，也可不必加增效剂。从商品制剂制成使用剂型中的活性化合物的浓度可在广阔的范围内变动。使用剂型中的活性化合物的浓度可从0.0000001％到100％(按苦参类碱衍生物重量计)，最好在0.0001％与1％之间。

本发明还请求保护一种预防和/或杀治害虫的方法，包括如下步骤：向土壤、植物种子、植物叶子和/或植物果实施用上述苦参类碱衍生物，或上述杀虫组合物，即可。

施用时苦参类碱衍生物的浓度为0.1～100mg/mL；优选为0.2～10mg/mL；进一步优选为0.3～5mg/mL；更进一步优选为0.5～1.5mg/mL。

相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的苦参碱类衍生物具有更高的杀虫活性，能够更好地杀灭害虫。

(2)本发明提供的苦参碱类衍生物毒副作用小，相比于常用的毒死蜱具有更好的环境相容性，更环保。

(3)本发明提供的苦参碱类衍生物的制备方法简单便捷，条件温和，适合大规模生产。

附图说明

图1为3-CF₃-Pyr-Mat的红外光谱图。

图2为3-CF₃-Pyr-Mat的MS谱图。

图3为3-CF₃-Pyr-Mat的¹H NMR谱图。

图4为3-CF₃-Pyr-Mat的¹³C NMR谱图。

图5为3-CF₃-Pyr-Mat的结构图(左)与晶胞图(右)。

图6为3-NO₂-Pyr-Mat的红外光谱图。

图7为3-NO₂-Pyr-Mat的结构图(左)与晶胞图(右)。

图8为4-CF₃-Pyr-Mat的红外光谱图。

图9为4-CF₃-Pyr-Mat的结构图(左)与晶胞图(右)。

图10为4-NO₂-Pyr-Mat的红外光谱图。

图11为4-NO₂-Pyr-Mat的结构图(左)与晶胞图(右)。

图12为4-CN-Pyr-Mat的红外光谱图。

图13为4-CN-Pyr-Mat的结构图(左)与晶胞图(右)。

图14为不同浓度和作用时间3-CF₃-Pyr-Mat对Sf9的抑制率。

图15为3-CF₃-Pyr-Mat作用后Sf9细胞的形态变化。

图16为不同浓度和作用时间3-NO₂-Pyr-Mat对Sf9的抑制率。

图17为3-NO₂-Pyr-Mat作用后Sf9细胞的形态变化。

图18为不同浓度和作用时间4-CF₃-Pyr-Mat对Sf9的抑制率。

图19为4-CF₃-Pyr-Mat作用后Sf9细胞的形态变化。

图20为不同浓度和作用时间4-NO₂-Pyr-Mat对Sf9的抑制率。

图21为4-NO₂-Pyr-Mat作用后Sf9细胞的形态变化。

图22为不同浓度和作用时间4-CN-Pyr-Mat对Sf9的抑制率。

图23为4-CN-Pyr-Mat作用后Sf9细胞的形态变化。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1制备13-(3-(三氟甲基)吡唑)-苦参碱(3-CF₃-Pyr-Mat)

1、制备方法

S1.制备粗产品：

槐果碱(0.2667g，1.082mmol)，3-(三氟甲基)吡唑(0.1477g,1.063mmol)，CsF(0.1317g,0.867mmol)溶解于12.5mL MeCN中，在90℃下冷凝回流反应6h。反应结束，加入10mL DCM并过滤，旋蒸得到粗产品。

合成路线如下：

S2.柱层析分离与TLC检测：

将步骤S1所得粗产品采用硅胶柱层析法分离纯化：

(1)装柱：采用湿法装柱。量取150mL硅胶放入250mL烧杯中，加入适量乙酸乙酯，充分搅拌使气泡逸出，静置0.5h后，打开层析柱阀门通过漏斗边搅拌边加入400mm*30mm i.d.层析柱。装柱完成后，反复用当前流动相冲洗硅胶柱；用灯照层析柱确认无气泡或断层，硅胶沉积面上方保持5cm以上液面，封口，静置过夜。

(2)上样与洗脱：粗产品溶于尽可能少的洗脱剂中。打开柱下活塞，使柱内液体流出，小心使液面降至硅胶沉积面，然后关闭活塞，将样品沿柱内壁缓缓加入层析柱，打开活塞，样品渗入硅胶柱后再用少量洗脱剂冲洗柱内壁，小心使液面降至硅胶沉积面即加入大量洗脱剂开始洗脱。准备10mL收集瓶并编号，每个收集瓶收集10mL流出液，旋蒸除去大部分溶剂后留下约1mL保存于2mL样品瓶内用于TLC检测。(洗脱剂是体积比为MeCN：EtOH＝12：1的混合液)。

(3)TLC检测：取出GF-254硅胶板，用玻璃刀裁出所需大小，画20mm起点线，10mm溶剂前沿线与间隔5mm样品点。用0.3mm毛细管点样，样品点控制直径大小为1.5～2mm。将层析缸清洗干净、烘干，倒入约1cm高的展开剂，放入点样完成的硅胶板展开；待溶剂前沿到达前沿线，取出硅胶板，置于通风橱内挥干溶剂，然后用N₂将碘液喷洒均匀(碘液：质量比5％碘溶于质量比95％的三氯甲烷)，待碘液挥发干后检查硅胶板分离情况。

S3.浓缩结晶：

收集含有目标产物的流分段，旋蒸浓缩。加入5～10mL乙酸乙酯，摇匀，溶液转入样品瓶，样品瓶用铝箔包裹，瓶口用封口膜封住，膜上留5个小孔，于通风橱内静置挥发(瓶内需留有一定量液体，不可挥干)。每隔8小时查看一次，直到晶体析出。取出部分晶体，在50℃下烘干3h用于红外光谱检测，分析光谱图初步确认槐果碱与所需基团以链接，然后另取部分晶体进行单晶衍射。

2、结构表征

(1)红外IR

Selected IR data(KBr disk,cm-1):ν(C-C,Methylene)2918m；ν(C＝O,Carbonyl)1625s；ν(C-N,pyrazole to matrine skeleton)1240m；ν(C-F,Trifluoromethylpyrazole)1211s；

图1为3-CF3-Pyr-Mat的红外光谱图。其中1121cm-1处有一强吸收，为三氟甲基上C-F伸缩振动。1622cm-1为苦参碱母核内酰胺C＝O伸缩振动。2918cm-1为苦参碱母核亚甲基伸缩振动，1240cm-1为吡唑基团与苦参碱母核之间C-N伸缩振动。综上所述，初步表明3-三氟甲基吡唑接入苦参碱C-13位。

(2)质谱MS

LRMS calcd for C19H25F3N4O:382.43,found 383.7[M+H]+

3-CF3-Pyr-Mat分子式为C19H25F3N4O。理论上其相对分子质量为382.43。图2中分子离子峰m/z＝383.7，为[M+H]+峰，与理论值一致。图中还出现了m/z＝247.5和m/z＝765.1的峰。m/z＝247.5的峰推测其为苦参碱母核失去一个氢的碎片峰(C15H23N2O+,M＝246.35)。m/z＝765.1的峰推测其为进样浓度过高所造成的二倍体峰[2M+H]+，进一步推测3-三氟甲基吡唑成功接入苦参碱母核。

(3)核磁NMR

核磁NMR分析结果如图3和图4所示：

¹H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.47(d,J＝2.8Hz,1H),6.56(d,J＝2.5Hz,1H),4.81–4.73(m,1H),4.39(dd,J＝12.7,4.5Hz,1H),3.84(dt,J＝11.0,6.3,4.8Hz,1H),3.09(d,J＝12.7Hz,1H),2.96(d,J＝5.8Hz,2H),2.81(d,J＝11.7Hz,2H),2.67(dt,J＝13.8,8.1Hz,1H),2.18(s,1H),2.13(ddd,J＝14.1,10.1,5.6Hz,1H),2.02–1.89(m,3H),1.80–1.74(m,1H),1.73–1.65(m,2H),1.63–1.59(m,1H),1.57–1.41(m,5H).13C NMR(Chloroform-d,126MHz):δ(ppm)20.79,21.21,26.35,27.77,30.91,35.02,35.84,39.35,47.20,48.84,50.82,51.97,57.23,63.48,101.28,107.97,119.75,122.60,123.88,126.53,127.45,136.37,166.88。

¹³C NMR(126MHz,CDCl3)δ165.45,142.60,128.51,122.28,104.69,65.63,63.63,57.16,53.83,50.25,42.38,42.00,37.29,35.64,31.30,27.68,26.60,21.10,20.54.

(4)单晶衍射XRD

单晶衍射分析结果如图5和表1所示。

表1 13-(3-(三氟甲基)吡唑)-苦参碱的单晶衍射结果

实施例2制备13-(3-硝基吡唑)-苦参碱(3-NO₂-Pyr-Mat)

1、制备方法

合成路线如下：

50mL三口烧瓶，槐果碱(0.2671g，1.084mmol)，3-硝基吡唑(0.1238g，1.095mmol)，Cs2CO3(0.1453g，0.4495mmol)溶解于12mL THF中，在100℃下冷凝回流反应5h。冷却，加入10mL THF并过滤、旋蒸，得到粗产品。将所得粗产品采用硅胶柱层析法分离纯化，洗脱剂是体积比为ACN：EtOH＝6：1的混合液，进行TLC检测后，将纯物质溶于无水甲醇中重结晶，得到目标衍生物如下所示：

2、结构表征

(1)红外IR

Selected IR data(KBr disk,cm-1):ν(C-C,Methylene)2926s；ν(C＝O,Carbonyl)1637m；νas(NO2)1505w；νs(NO2)1376w；

图6为3-NO2-Pyr-Mat的红外光谱图。其中1505cm-1和1376cm-1处有一中等强度吸收，为硝基上N-O伸缩振动。1637cm-1为苦参碱母核内酰胺C＝O伸缩振动。2926cm-1为苦参碱母核亚甲基伸缩振动。综上所述，初步表明3-硝基吡唑接入苦参碱C-13位。

(2)单晶衍射XRD

单晶衍射分析结果如图7和表2所示。

表2 13-(3-硝基吡唑)-苦参碱的单晶衍射结果

实施例3制备13-(4-(三氟甲基)吡唑-苦参碱(4-CF₃-Pyr-Mat)

合成路线如下：

50mL三口烧瓶，加入槐果碱0.2000g，4-三氟甲基吡唑0.1380g，氟化铯0.1000g，乙腈8mL，在80℃下冷凝回流反应5h。反应结束，加入10mL二氯甲烷并过滤，旋蒸得到粗产品。将所得粗产品采用硅胶柱层析法分离纯化，洗脱剂是体积比乙腈：乙醇＝10：1的混合液，进行TLC检测后，以乙醇为溶剂进行重结晶2～3次，得到目标衍生物如下所示：

(1)红外IR

图8为4-CF3-Pyr-Mat的红外光谱图。其中1121cm-1处有一强吸收，为三氟甲基上C-F伸缩振动。1622cm-1为苦参碱母核内酰胺C＝O伸缩振动。2918cm-1为苦参碱母核亚甲基伸缩振动，1410cm-1为苦参碱上叔碳的伸缩振动，864cm-1为吡唑基团与苦参碱母核之间C-N伸缩振动，。综上所述，初步表明4-三氟甲基吡唑接入苦参碱C-13位。

(2)单晶衍射XRD

单晶衍射分析结果如图9和表3所示。

表3 4-CF3-Pyr-Mat的单晶衍射结果

实施例4制备13-(4-硝基吡唑)-苦参碱(4-NO₂-Pyr-Mat)

合成路线如下：

50mL三口烧瓶，加入槐果碱0.2671g，4-硝基吡唑0.1471g，碳酸铯0.1300g，1,4-二氧六环8mL，在100℃下回流反应8h。反应结束，加入10mL二氯甲烷并过滤，旋蒸得到粗产品。将所得粗产品采用硅胶柱层析法分离纯化，洗脱剂是体积比为乙腈：乙醇＝6：1的混合液，进行TLC检测后，以无水乙醇为溶剂进行重结晶2～3次，得到目标衍生物如下所示：

(1)红外IR

Selected IR data(KBr disk,cm-1):ν(C-C,Methylene)2932m；ν(C＝O,Carbonyl)1637s；νas(NO2)1511m；νs(NO2)1303m；

图10为4-NO₂-Pyr-Mat的红外光谱图。其中1511cm^-1，1303cm^-1处有一中等强度吸收，分别为硝基的对称伸缩振动和不对称伸缩振动。1637cm^-1为苦参碱母核内酰胺C＝O伸缩振动。2932cm^-1为苦参碱母核亚甲基伸缩振动。综上所述，初步表明4-硝基吡唑接入苦参碱C-13位上。

(2)单晶衍射XRD

单晶衍射分析结果如图11和表4所示。

表4 4-NO₂-Pyr-Mat的的单晶衍射结果

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实施例5制备13-(4-氰基吡唑)-苦参碱(4-CN-Pyr-Mat)

50mL三口烧瓶，加入槐果碱0.2000g，4-氰基吡唑0.1380g，碳酸铯0.1200g，1,4-二氧六环8mL，在120℃下回流反应2.5h。反应结束，加入10mL二氯甲烷并过滤，旋蒸得到粗产品。将所得粗产品采用硅胶柱层析法分离纯化，洗脱剂是体积比为乙腈：乙醇＝6：1的混合液，进行TLC检测后，以乙醇为溶剂进行重结晶2～3次，得到相应的化合物。

(1)红外IR

Selected IR data(KBr disk,cm^-1):ν(C-C,Methylene)2932m；ν(C≡N)1637m；ν(C＝O,Carbonyl)1634s；ν(C＝C,Pyrazole)1544m；ν(C-N,Pyrzole to matrine)1282m；

图12为4-CN-Pyr-Mat的红外光谱图。其中2234cm^-1处有一中等强度吸收，为氰基C≡N伸缩振动，是含氰基化合物的特征吸收。1634cm^-1为苦参碱母核内酰胺C＝O伸缩振动。2934cm^-1为苦参碱母核亚甲基伸缩振动，1544cm^-1为吡唑环C＝C伸缩振动，1282cm^-1为吡唑基团与苦参碱母核之间C-N伸缩振动。综上所述，初步表明4-氰基吡唑接入苦参碱C-13位。

(2)单晶衍射XRD

单晶衍射分析结果如图13和表5所示。

表5 4-CN-Pyr-Mat的的单晶衍射结果

这些化合物被制成合适的可用的剂型，用常规的方法来使用。

实施例6药物生物活性实验

(1)苦参碱类衍生物对Sf9细胞的增殖和形态影响

1)苦参碱类衍生物对Sf9细胞抑制活性测定

采用MTT法测定衍生物对Sf9细胞抑制活性。方法简述如下：细胞常规传代，调整细胞悬液密度，96孔板每孔加入1-1.2×10⁵个细胞，24h后加入不同浓度的供试药物，分别培养24、48、72h。到达对应时间点时，每孔加入10μL MTT，27℃避光孵育4h。孵育结束后弃液，每孔加入150μL DMSO。测定492nm处的OD值并计算抑制率。以不超过1％的DMSO作为空白对照，以PBS为背景。每个浓度设4组重复。

2)倒置相差显微镜(IPCM)形态特征检测

细胞常规传代，调整细胞悬液密度至1×10⁶个/mL，于12孔板中每孔加入.0.5mL细胞悬液，24h后加入不同浓度的供试药物，培养24、48、72h用IPCM观察，记录细胞形态变化。(2)苦参碱类衍生物对草地贪夜蛾2龄幼虫的毒杀活性测定

杀虫活性测定采用浸叶饲喂法(赵胜园等,2019),方法简述如下：取新鲜玉米叶或上海青叶，用前水浸泡4h以去除可能的农残。切成2cm×2cm的叶片。浸入药液中10s，取出，自然风干。试虫提前4h饥饿处理。将浸药叶片放置于圆盖瓶中，瓶口戳数个小洞，上垫一层餐巾纸，下垫一层滤纸。每个瓶放10只同龄幼虫。每个化合物、各个浓度重复3组，以含0.1％Tween80和1％DMSO的超纯水为空白对照，按照以下公式计算死亡率和校正死亡率(当对照组死亡率>20％时，视为无效对照)。

3、实验结果

(1)苦参碱衍生物对Sf9细胞增殖的影响

1)3-CF₃-Pyr-Mat对Sf9细胞增殖的影响

由图14和表6可知，低浓度3-CF₃-Pyr-Mat处理细胞后，抑制作用较低；在1.5mM处理细胞48h后甚至一定程度促进了细胞生长。中高浓度(2、2.5、3mM)的3-CF₃-Pyr-Mat处理细胞24h后表现出一定的抑制活性。当3-CF₃-Pyr-Mat处理细胞48h后其对细胞的抑制活性继续上升。处理72h后，其对细胞的抑制活性继续上升。说明3-CF₃-Pyr-Mat对细胞的增殖抑制存在时间-浓度依赖性。在3mM 3-CF₃-Pyr-Mat处理72h后，抑制率达到49.43％。其24、48、72h半抑制浓度(IC₅₀)分别为3.83、3.52、2.94mM。上述结果说明引入3-三氟甲基吡唑增强了苦参碱对Sf9细胞增殖抑制的能力。

由图15可知，Sf9细胞经1mM和2mM的3-CF₃-Pyr-Mat处理24h后，细胞形态无明显变化；3mM的3-CF₃-Pyr-Mat处理24h使少部分细胞出现空泡化。48h后，1mM处理组的细胞形态出现少量空泡化变化，而2mM，3mM则有更多细胞出现空泡化现象，胞内出现小颗粒或小泡，少部分细胞皱缩。处理72h后，3个浓度处理组均出现了细胞皱缩。在3mM的3-CF₃-Pyr-Mat处理细胞72h后，大量细胞皱缩或解体。因此可以看出3-CF₃-Pyr-Mat对于细胞有较强的抑制作用，且引起了细胞形态的改变。

表6不同浓度和作用时间下3-CF₃-Pyr-Mat对Sf9的抑制率及IC50值

*表格中“a”、“b”、“c”、“d”等标记是多组数据之间显著性差异的指标，如两组数据标记相同，表明该两组数据之间的差异不显著；下同。

2)3-NO₂-Pyr-Mat对Sf9细胞增殖的影响

由图16和表7可知，低浓度3-NO₂-Pyr-Mat处理细胞后，抑制作用较低，但相对于3-CF₃-Pyr-Mat高；在1.5mM处理细胞24h后与3-NO₂-Pyr-Mat同样出现了促进了细胞生长的状况。中高浓度(2、2.5、3mM)的3-NO₂-Pyr-Mat处理细胞24h后表现出较高的抑制活性，说明3-NO₂-Pyr-Mat对细胞的增殖抑制存在浓度依赖性。当3-NO₂-Pyr-Mat处理细胞48h后其细胞抑制活性上升，2.5mM的3-NO₂-Pyr-Mat处理48h后，抑制率可达46.43％。处理72h后，其对细胞的抑制活性继续上升。说明3-NO₂-Pyr-Mat对细胞的增殖抑制存在时间依赖性。在3mM 3-NO₂-Pyr-Mat处理72h后，抑制率达到52.80％。其48、72h半抑制浓度(IC₅₀)分别为3.52、2.81mM。上述结果说明引入3-硝基吡唑增强了苦参碱对Sf9细胞增殖抑制的能力。

由图17可知，Sf9细胞经3-NO₂-Pyr-Mat处理24h后，细胞形态发生改变，随着3-NO₂-Pyr-Mat浓度的增加，视野中空泡化细胞逐渐增多，细胞表面不光滑，胞质出现小颗粒或小泡，48h后，1mM处理组的细胞拉伸变长出现空泡化，细胞贴壁能力下降，而2mM，3mM则有更多细胞出现空泡化现象，胞内出现小颗粒或小泡。处理72h后，3个浓度处理组的细胞形态明显异常。在3mM的3-NO₂-Pyr-Mat处理细胞72h后，大量细胞皱缩或解体。因此可以看出3-NO₂-Pyr-Mat对于细胞有较强的抑制作用，且引起了细胞形态的改变。

表7不同浓度和作用时间下3-NO₂-Pyr-Mat对Sf9的抑制率及IC50值

3)4-CF₃-Pyr-Mat对Sf9细胞增殖的影响

由图18和表8可知，低浓度4-CF₃-Pyr-Mat处理细胞后即表现出一定的抑制作用，且相对其他苦参碱衍生物高；3个时段低浓度(1、1.5mM)的抑制率在20％左右。中高浓度(2、2.5、3mM)的4-CF₃-Pyr-Mat处理细胞48h后表现出较高的抑制活性，且随着浓度的增加不断递增，说明4-CF₃-Pyr-Mat对细胞的增殖抑制存在浓度依赖性。3mM的4-CF₃-Pyr-Mat处理48h后，抑制率可达49.70％。处理72h后，其对细胞的抑制活性继续上升。说明4-CF₃-Pyr-Mat对细胞的增殖抑制存在时间依赖性。在3mM 4-CF₃-Pyr-Mat处理72h后，抑制率达到58.41％。其24、48、72h半抑制浓度(IC₅₀)分别为4.38、2.93、2.49mM。上述结果说明引入4-三氟甲基吡唑显著增强了苦参碱对Sf9细胞增殖抑制的能力。

由图19可知，Sf9细胞经1mM的4-CF₃-Pyr-Mat处理24h后，细胞形态内小颗粒增多；2mM的3-CF₃-Pyr-Mat处理24h后，部分细胞内小颗粒不仅增多，而且出现空泡化。48h后，1mM处理组的细胞形态出现空泡化，部分细胞形态变长，表面不光滑，而2mM则有更多细胞出现空泡化现象。当3mM 4-CF₃-Pyr-Mat处理48h时，部分细胞成空泡状，细胞核消失。处理72h后，1mM处理组出现细胞膨胀和空泡化，细胞边缘变模糊，贴壁能力下降。在2mM的4-CF₃-Pyr-Mat处理细胞72h后，细胞严重皱缩，细胞核几乎不可见。在3mM的4-CF₃-Pyr-Mat处理细胞72h后，视野中细胞大量解体，。因此可以看出4-CF₃-Pyr-Mat对于细胞有较强的抑制作用，且引起了细胞形态的改变。

表8不同浓度和作用时间下4-CF₃-Pyr-Mat对Sf9的抑制率及IC50值

4)4-NO₂-Pyr-Mat对Sf9细胞增殖的影响

由图20和表9可知，低浓度4-NO₂-Pyr-Mat处理细胞后，抑制作用较低，但相对于3-NO₂-Pyr-Mat高；在1.5mM处理细胞24h后与3-NO₂-Pyr-Mat同样出现了促进了细胞生长的状况。中高浓度(2、2.5、3mM)的4-NO₂-Pyr-Mat处理细胞24h后表现出较一定的抑制活性，但其抑制率最高只有27％。当4-NO₂-Pyr-Mat处理细胞48h后其细胞抑制活性上升，2.5mM的4-NO₂-Pyr-Mat处理48h后，抑制率可达38.54％。处理72h后，其对细胞的抑制活性继续上升。说明3-NO₂-Pyr-Mat对细胞的增殖抑制存在时间依赖性。在3mM 3-NO₂-Pyr-Mat处理72h后，抑制率达到43.21％。其24、48、72h半抑制浓度(IC₅₀)分别为3.52、2.81mM。上述结果说明引入4-硝基吡唑增强了苦参碱对Sf9细胞增殖抑制的能力，但其能力弱于3-硝基吡唑苦参碱。

由图21可知，Sf9细胞经4-NO₂-Pyr-Mat处理24h后，细胞形态发生改变，出现小颗粒，尤其是2mM处理组，一些细胞的体积明显增大且充满小颗粒。处理48h后，1mM处理组的细胞与24h时无显著差别，而2mM，3mM则有细胞出现空泡化现象。处理72h后，1mM处理组细胞出现大量空泡化，形态明显异常，呈现长条状或梭形。在3mM的4-NO₂-Pyr-Mat处理细胞72h后，视野中大量细胞皱缩或解体。因此可以看出4-NO₂-Pyr-Mat对于细胞有一定的抑制作用，且引起了细胞形态的改变。

表9不同浓度和作用时间下4-NO₂-Pyr-Mat对Sf9的抑制率及IC50值

5)4-CN-Pyr-Mat对Sf9的增殖的影响

由图22和表10可知，4-CN-Pyr-Mat处理细胞24h后，抑制作用不佳，其抑制效果甚至低于苦参碱和槐果碱。在所有供试浓度处理细胞24h后均促进了细胞生长。当4-CN-Pyr-Mat处理细胞48h后开始出现细胞抑制活性，但其抑制活性依然低于苦参碱和槐果碱。4-CN-Pyr-Mat处理72h后，抑制率有所上升，但与48h时相差不大。其24、48、72h半抑制浓度(IC₅₀)均>3mM。上述结果说明引入4-氰基吡唑减弱了苦参碱对Sf9细胞增殖抑制的能力。

由图23可知，Sf9细胞经4-CN-Pyr-Mat处理24h后，部分细胞形态出现小颗粒，但与0h相差不大，随着浓度增加，异常形态细胞数目逐渐增加。处理48h后，1mM处理组的细胞与24h时无显著差别，而2mM，3mM则有细胞出现空泡化现象，但是与同浓度同时间的其他苦参碱衍生物相比，其出现空泡化的细胞数目较少。处理72h后，所有浓度处理组细胞均出现空泡化，形态明显异常。但视野中并没有出现如4-CF3-Pyr-Mat和3-CF3-Pyr-Mat处理后出现的细胞皱缩或解体。因此可以看出4-CN-Pyr-Mat对于细胞有一定的抑制作用，但其抑制活性不高。

表10不同浓度和作用时间下4-NO₂-Pyr-Mat对Sf9的抑制率及IC50值

(2)苦参碱及其衍生物对草地贪夜蛾幼虫的毒杀活性

苦参碱及其衍生物对草地贪夜蛾2龄幼虫72h的作用效果如表11和表12所示。结果表明在引入吡唑基团后，苦参碱衍生物的杀虫活性相比苦参碱显著提升。其中，3-NO₂-Pyr-Mat的毒杀活性最高，其LC₅₀值为22.76mg/L，毒力为苦参碱的5.4倍。10mg/L浓度3-NO₂-Pyr-Mat下校正死亡率可达59.26％，较苦参碱高15％。3-CF₃-Pyr-Mat在50mg浓度下校正死亡率可达62.96％，较苦参碱高11％，LC₅₀值为32.90mg/L。说明引入3位取代吡唑基团可以显著提高衍生物对草地贪夜蛾2龄幼虫的毒杀活性。相比在苦参碱C-13位引入3位取代吡唑基团，引入4位取代吡唑基团可以提高苦参碱在400mg/L下的毒杀活性。4-CF₃-Pyr-Mat和4-CN-Pyr-Mat在此的浓度下校正死亡率高达85.19％和88.89％，相较同浓度下苦参碱校正死亡率提高15％和18％。二者的LC₅₀值分别为34.03和39.81mg/L，毒力分别为苦参碱的3.6和3.1倍。4-NO₂-Pyr-Mat在此浓度下校正死亡率可达81.48％，较苦参碱高11％。

同等校正死亡率下，衍生物的作用浓度相比苦参碱降低2-4倍。苦参碱及其衍生物杀虫活性排序为：

3-NO₂-Pyr-Mat>3-CF₃-Pyr-Mat>4-CF₃-Pyr-Mat>4-CN-Pyr-Mat>4-NO₂-Pyr-Mat>4-Cl-Pyr-Mat>Mat。并且发现大部分供试化合物的细胞抑制活性和杀虫活性有相关性。以上结果说明引入取代吡唑基团提高了苦参碱的杀虫活性。此外，通过实验数据表明，本发明引入硝基、三氟甲基或氰基的衍生物对草地贪夜蛾表现出的毒杀活性明显要高于引入其他基团的苦参碱衍生物的毒杀活性(如表中的4-Cl-Pyr-Mat，按照CN202010119640.X制备得到)。

表11苦参碱及其衍生物对2龄草地贪夜蛾幼虫的校正死亡率(72h)

表12苦参碱及其衍生物对2龄草地贪夜蛾幼虫的毒力回归方程和LC50值

实施例7组合物

(1)油状悬浮液

13-(4-氰基吡唑)-苦参碱25wt％；

聚氧乙烯山梨醇六油酸酯5wt％；

高级脂肪族烃油70wt％。

将各组分在沙磨中一起研磨，直到固体颗粒降至约5μm以下为止。所得的粘稠悬浮液可直接使用，但也在水中乳化后使用。

(2)水悬浮液

13-(4-氰基吡唑)-苦参碱25wt％；

水合硅镁土(hydrate attapulagit)3wt％；；

木质素磺酸钙10wt％；

磷酸二氢钠0.5wt％；

水61.5wt％。

将各组分在球磨机中一起研磨，直到固体颗粒降至约10μm以下为止。该水悬浮液可直接使用。

(3)饵剂

按以下组成制备可食用的饵：

13-(4-氰基吡唑)-苦参碱0.1～10wt％；

小麦面粉80wt％；

糖蜜19.9～10wt％。

将这些组分完全混合，按需要形成饵形状。可食用饵可以分散到卫生害虫所侵染的场所，例如家居或工业场所，诸如厨房、医院或商店或户外区域，以通过口服摄入来防治害虫。

(4)可润湿性粉剂

按以下组成制备可润湿性粉剂：

13-(4-氰基吡唑)-苦参碱30wt％；

十二烷基苯磺酸钠2wt％；

木质磺酸钠5wt％；

合成的硅酸镁载体63wt％。

将这些组分混合，并在锤磨机中研磨成粒径小于50μm的粉末。通过浸渍或在饮用水中口服给药的方式施用需要施用的植物种子或植物叶子和/或植物果实或植物正在生长或预期要生长的地方，以防治害虫。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种苦参碱类衍生物，其特征在于，具有如式(Ⅰ)所示结构的化合物：

R₁为硝基、三氟甲基或氰基。

2.权利要求1所述苦参碱类衍生物，其特征在于，具有如下所示结构的化合物：

3.权利要求1～2任一所述苦参碱类衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在催化剂和溶剂存在的条件下，式(Ⅱ)所示的吡唑衍生物与槐果碱反应，即得所述苦参碱类衍生物；

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述槐果碱和吡唑衍生物的摩尔比为1:(1～1.5)；

所述催化剂为碳酸铯、氟化铯中的一种或多种；所述催化剂的用量为槐果碱摩尔量的1～1.5倍；

所述溶剂为1,4-二氧六环、乙腈、水、DMSO、甲醇、乙醇或石油醚中的一种或多种；所述槐果碱与溶剂的质量体积比为1:(30～70)g/mL。

5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述反应的温度为80～120℃，反应的时间为2.5～8h。

6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述反应后还包括柱层析分离、旋蒸浓缩，结晶步骤。

7.权利要求1～2任一所述苦参碱类衍生物在制备预防和/或杀治害虫的杀虫剂中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述害虫为公共卫生害虫、农业害虫或禽畜病源虫中的一种或几种。

9.一种杀虫组合物，其特征在于，包括权利要求1～2任一所述苦参碱类衍生物，所述苦参碱类衍生物的质量分数为0.0001wt％～30wt％。

10.一种预防和/或杀治害虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：向土壤、植物种子、植物叶子和/或植物果实施用权利要求1～2任一所述苦参碱类衍生物或权利要求9所述杀虫组合物，即可。