CN115029273A - 发酵乳杆菌ty-g03及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种发酵乳杆菌TY‑G03及其应用。该发酵乳杆菌TY‑G03保藏编号为CGMCC No.23753，其可以将失调的肠道菌群的多样性和丰富度维持在(甚至优于)正常水平；还可以有效平衡失调的肠道菌群的肠道菌群结构；还可以显著降低失调的肠道菌群中的厚壁菌门菌群与拟杆菌门菌群的比值；还可以显著降低失调的肠道菌群中的变形菌门菌群相对丰度；还可以显著提高失调的肠道菌群中的毛螺菌科菌群相对丰度；还可以显著提高失调的肠道菌群中的有益菌种的菌群丰度；还可以显著降低失调的肠道菌群中的有害菌种的菌群丰度。

Description

发酵乳杆菌TY-G03及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种发酵乳杆菌TY-G03及其应用。

背景技术

人体肠道内寄居着数量庞大、种类繁多的微生物，以细菌为主，统称为肠道菌群。人类肠道菌群的细菌种类超过35000种，数量高达100万亿个，是人体体细胞数量的10倍。正常情况下，肠道菌群与宿主相互依存、相互制约，维持一种动态的生态平衡，参与机体的营养消化吸收、生物拮抗、免疫、抗肿瘤等一系列生命活动并维持机体健康。当肠道菌群受到宿主及外环境变化的不利影响时，平衡状态被打破，则会导致肠道菌群失调(菌群失调是指肠道正常菌群的种类、数量和比例发生异常变化，偏离正常的生理组合，转变为病理性组合状态)，进而引发和加重各种疾病。相关研究已经证实，肠道菌群与代谢疾病、免疫类疾病、胃肠道类疾病甚至精神类疾病相关联。

目前常采用抗生素来治疗不利外部环境引发的肠道菌群失调，但长期使用抗生素，特别是广谱抗生素，也可以杀灭一些正常的菌群，从而造成肠道菌群二度失调。因此，现有改善肠道菌群失调的技术仍然存在不足，因此，一种安全性高、毒副作用小以及可以有效调节肠道菌群失调的制剂是必要的。

发明内容

针对以上问题，本发明目的之一在于提供了一种有助于预防肠道菌群失调的发酵乳杆菌TY-G03(LactobacillusfermentumTY-G03)，该发酵乳杆菌TY-G03可以维持菌群多样性和丰富度、改变菌群结构、抑制有害菌生长以及促进有益菌生长，从而预防或治疗肠道菌群失调，维护肠道健康。

为了达到上述目的，可以采用以下技术方案：

本发明一方面提供了一种发酵乳杆菌TY-G03(LactobacillusfermentumTY-G03)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23753。

本发明另一方面提供了一种组合物，可以包括以下物质中的一种或多种混合：(a)上述的发酵乳杆菌TY-G03；(b)上述的发酵乳杆菌TY-G03的裂解物；(c)上述的发酵乳杆菌TY-G03的培养物；(d)上述的发酵乳杆菌TY-G03的发酵液。

本发明再一方面提供了一种制剂，包括上述的发酵乳杆菌TY-G03或上述的组合物，以及载体，其中，载体为可药用载体或可食用载体。

本发明再一方面提供了一种上述的发酵乳杆菌TY-G03或上述的组合物在制备用于预防或治疗机体肠道菌群失调的制剂中的应用。

本发明的发酵乳杆菌TY-G03保藏信息如下：保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2021年11月8日；保藏编号：CGMCCNo.23753；分类命名：发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)。

本发明的有益效果至少包括：

(1)本发明提供的发酵乳杆菌TY-G03可以将肠道菌群失调机体的肠道菌群的多样性和丰富度维持在(甚至优于)正常水平；

(2)本发明提供的发酵乳杆菌TY-G03可以有效平衡肠道菌群失调机体的肠道菌群结构；

(3)本发明提供的发酵乳杆菌TY-G03可以显著降低肠道菌群失调机体的肠道菌群中的Firmicutes/Bacteroidetes的比值；

(4)本发明提供的发酵乳杆菌TY-G03可以显著降低肠道菌群失调机体的肠道菌群中的Proteobacteria相对丰度；

(5)本发明提供的发酵乳杆菌TY-G03可以显著提高肠道菌群失调机体的肠道菌群中的Lachnospiraceae相对丰度；

(6)本发明提供的发酵乳杆菌TY-G03可以显著提高肠道菌群失调机体的肠道菌群中的norank-f-Muribaculaceae、Desulfovibrio、Enterorhabdus、unclassified-f-Oscillospiraceae、Alistipes和unclassified-f-Ruminococcaceae等菌群的丰度；

(7)本发明提供的发酵乳杆菌TY-G03可以显著降低肠道菌群失调机体的肠道菌群中的Escherichia-Shigella、Clostridium-sensu-stricto-1、Parasutterella、Enterococcus和Clostridioides等菌群的丰度；

(8)本发明提供的发酵乳杆菌TY-G03属于益生菌，安全性高，毒副作用小。

附图说明

图1为分离菌株菌落形态图；

图2为革兰氏染结果图；

图3为发酵乳杆菌TY-G03的API 50CH反应结果图；

图4为各组Ace指数对比图；

图5为各组Shannon指数对比图；

图6为各组Simpson指数对比图；

图7为各组β多样性分析结果图；

图8为各组Firmicutes/Bacteroidota对比图；

图9为各组Proteobacteria丰度对比图；

图10为各组Lachnospiraceae丰度对比图；

图11为药物组和治疗组在属水平的物种差异图；

图4至图6中，标有相同小写英文字母(a、b、c)的组之间不存在显著差异(p＞0.05)；标有不同小写英文字母(a、b、c)的组之间存在显著差异(p<0.05)；图8至图10中，标有相同小写英文字母(a、b、c)的组之间不存在显著差异(p＞0.05)；标有不同小写英文字母(a、b、c)的组之间存在显著差异(p<0.05)；图11中，横坐标表示属水平下的物种名，纵坐标表示该样本的某一物种丰度的百分数数值，最右边为P值，*0.01<p≤0.05，**0.001<p≤0.01，***p≤0.001。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明一方面提供了一种发酵乳杆菌TY-G03(LactobacillusfermentumTY-G03)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23753。其具有安全性高、副作用低的特点，而且可以有效促进肠道有益菌的生长，抑制肠道有害菌的生长，维持肠道菌群的多样性和丰富度，改善肠道失调的状况。

具体地，该发酵乳杆菌TY-G03是将四川省阿坝藏族羌族自治州红原县牧民家自然发酵牦牛酸乳，经过无菌生理盐水稀释，再涂布于MRS平板上进行培养；培养结束后挑选菌落，采用平板划线法得到纯化的菌株；该菌株培养形成的单菌落形态一致，表面湿润光滑，中等大小，凸起，边缘整齐，呈半球形，菌落为不透明状，颜色呈乳白色；经革兰氏染色后，在显微镜下细胞均呈紫色，为革兰氏阳性菌(G+)，形态呈杆状，与乳酸杆菌特征相符，判定为革兰氏阳性菌(G⁺)。

进一步地，对纯化的菌株进行PCR扩增，序列扩增后，进行测序，其16SrDNA序列包含如SEQIDNO.1所示序列；获得序列后，使用BLAST在GenBank中进行搜索和相似性比对；结果显示菌株为发酵乳杆菌；进一步采用API50CH试剂盒分析TY-G03对49种不同碳水化合物的利用情况，利用APIlabplus系统进行鉴定，结果显示菌株为发酵乳杆菌。

需要说明的是，发酵乳杆菌TY-G03属于发酵乳杆菌，属于一种益生菌，具有益生菌安全性高和副作用小的特点。除此之外，还需要说明的是，发酵乳杆菌TY-G03可能是通过以下机制预防肠道菌群失调：(1)通过优势菌群竞争抑制有害菌的生长；(2)通过消耗肠道内的大部分氧气形成厌氧环境抑制需氧有害菌的繁殖；(3)通过与肠道黏膜形成一层致密的菌膜，有效抵抗有害细菌对机体的侵袭；(4)通过在肠道中产生大量抗菌活性肽、低分子酸等物质或是通过定植、竞争、排斥等作用构成生物学屏障，通过促进机体免疫调节抑制肠道内病原菌生长，对肠道微生态产生有利影响；(5)与机体肠上皮细胞存在相互作用的分子机制，例如菌体表面分子与宿主粘附性相关的蛋白分子结合通过占位效应抑制有害菌群在肠道内的定植，促进肠道细胞分泌细菌素、有机酸等可抑制或杀死有害菌群。

本发明另一方面提供了一种组合物，在一些实施例中，可以包括以下物质中的一种或多种混合：(a)上述的发酵乳杆菌TY-G03；(b)上述的发酵乳杆菌TY-G03的裂解物；(c)上述的发酵乳杆菌TY-G03的培养物；(d)上述的发酵乳杆菌TY-G03的发酵液。

具体地，发酵乳杆菌TY-G03在发挥作用的时候，可以是通过各种形式发挥作用，比如可以将发酵乳杆菌TY-G03直接引入到产品中发挥作用，比如还可以将发酵乳杆菌TY-G03进行裂解后混合到产品中发挥作用；比如还可以是发酵乳杆菌培养得到的蛋白质、肽、分泌物或代谢产物发挥作用；比如还可以是发酵乳杆菌TY-G03发酵后的发酵液发挥作用。应当理解的是，发酵乳杆菌TY-G03发挥作用可以是活菌的形式，也可以是灭活菌的形式。

进一步，在一些实施例中，上述组合物还可以包括益生素、膳食纤维和活性化合物中一种或多种组合。具体地，上述组合物还可以与其他组分联合使用增强调节肠道失调的效果，比如可以与其他益生素联用，益生素为本领域所已知的，如酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、双歧杆菌或放线菌等；比如还可以是与膳食纤维联用，膳食纤维为本领域所已知的，比如菊粉或聚葡萄糖等；比如还可以与活性化合物进行联用，比如大黄酸，大黄酸能够显著升高肠道内乳酸杆菌(Lactobacillus)的数量。

本发明再一方面提供了一种制剂，在一些实施例中，可以包括上述的发酵乳杆菌TY-G03或上述的组合物，以及载体，其中，载体为可药用载体或可食用载体。具体地，为了方便服用，可以将上述的发酵乳杆菌TY-G03或上述的组合物添加载体制备成各种药用或者食用的制剂，载体为本领域所已知的用于制备制剂的辅料。

进一步地，上述制剂可以为片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、糊剂、凝胶剂、颗粒剂或液体剂的形式。应当理解的是，根据不同制剂的剂型，选用的载体便会存在区别，比如制备片剂主要会使用到稀释剂(如淀粉、糊精、蔗糖或甘糖等)、吸收剂(硫酸钙、磷酸氢钙或轻质氧化镁等)、粘合剂(聚维酮、糖浆或羟丙甲纤维素)等、润湿剂(水等)或崩解剂(干淀粉、羟甲基淀粉钠或交联聚维酮等)等；比如制备液体剂主要会使用到增容剂、助悬剂、乳化剂或着色剂等。在某些具体实施例中，上述制剂可以是饼干、粉末或奶片等；在另外的具体实施例中，制剂可以是搅拌型酸奶或益生菌饮料等；在其他的具体实施例中，制剂可以是果冻、奶盖或凝固型酸奶等；在其他的具体实施例中，制剂可以是药片或胶囊等。

本发明再一方面提供了一种上述的发酵乳杆菌TY-G03或上述的组合物在制备用于预防或治疗肠道菌群失调的制剂中的应用。需要说明的是，肠道菌群失调是由于肠道正常菌群的种类、数量和比例发生异常变化，偏离正常的生理组合，转变为病理性组合状态，含有上述发酵乳杆菌TY-G03的制剂可以有效的让失调的肠道菌群恢复正常。另外，应当理解的是，肠道菌群失调会致使机体发生一些疾病，比如慢性腹泻、肝病或癌症等疾病，通过上述发酵乳杆菌TY-G03或上述的组合物制备成的制剂可以用过对肠道菌群的调节，预防或治疗因为肠道失调带来的各种疾病。

进一步地，在一些实施例中，上述应用可以包括以下一种或多种：(a)在制备用于维持或提高机体肠道菌群多样性和丰富度的制剂中的应用；(b)在制备用于平衡机体肠道菌群结构的制剂中的应用；(c)在制备用于保持或降低机体肠道菌群中厚壁菌门(Firmicutes)菌群与拟杆菌门(Bacteroidetes)菌群比值的制剂中的应用；(d)在制备用于促进机体肠道菌群中肠道有益菌种生长的制剂中的应用；(e)在制备用于抑制机体肠道菌群中肠道有害菌种生长的制剂中的应用；(f)在制备用于维持或降低机体肠道菌群中变形菌门(Proteobacteria)菌群相对丰度的制剂中的应用；(g)在制备用于维持或提高机体肠道菌群中毛螺菌科(Lachnospiraceae)菌群相对丰度的制剂中的应用。

具体地，机体肠道菌群失调，肠道菌群多样性和丰富度会降低，上述制剂可以将失调的肠道菌群多样性和丰富度提高恢复至正常水平甚至优于正常水平；对于处于未失调的机体的肠道菌群，上述制剂可以起到预防作用，防止肠道菌群多样性和丰富度降低；

另外，肠道菌群的结构失调也是引起机体肠道菌群失调的原因，上述的制剂可以通过自发形成一种新的肠道菌群来平衡结构失调的肠道菌群，逆转了肠道菌群结构的不良发展，平衡了肠道菌群结构；

再者，厚壁菌门(Firmicutes)/拟杆菌门(Bacteroidetes)的比值增加常被认为是肠道菌群不健康的表现之一，上述的制剂可以将机体肠道菌群中的厚壁菌门(Firmicutes)/拟杆菌门(Bacteroidetes)的比值降低到机体的正常水平；同样地，对于处于未失调的机体的肠道菌群，上述制剂可以起到预防作用，防止厚壁菌门(Firmicutes)/拟杆菌门(Bacteroidetes)的比值升高；

再者，机体肠道中的菌群分为肠道有益菌和肠道有害菌，当肠道有益菌菌减少时，肠道有害菌就会增多，使肠道菌群失调，上述制剂可以促进肠道有益菌的生长，比如norank-f-Muribaculaceae、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、肠杆菌属(Enterorhabdus)、颤螺科(unclassified-f-Oscillospiraceae)、另枝菌属(Alistipes)和瘤胃球菌科(unclassified-f-Ruminococcaceae)等有益菌；上述制剂可以抑制肠道有害菌的生长，比如埃希杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)、狭义梭菌属(Clostridium-sensu-stricto-1)、毛螺旋菌属(Parasutterella)、肠球菌属(Enterococcus)和艰难梭菌属(Clostridioides)。

再者，变形菌门(Proteobacteria)是重要的促炎菌门，与肠道炎症的发生与发展紧密相关，即变形菌门(Proteobacteria)的增加也是导致肠道菌群失调的原因之一，上述的制剂可以降低变形菌门(Proteobacteria)菌群的相对丰度，调解肠道菌群失调；同样地，对于处于未失调的机体的肠道菌群，上述制剂可以起到预防作用，防止变形菌门(Proteobacteria)菌群相对丰度增加；

再者，在科水平上，毛螺菌科(Lachnospiraceae)有助于维持肠道正常功能的实现，毛螺菌科菌群丰度降低也是肠道菌群失调的信号之一，上述的制剂可以提高毛螺菌科菌群的相对丰度；同样地，对于处于未失调的机体的肠道菌群，上述制剂可以起到预防作用，防止毛螺菌科(Lachnospiraceae)菌群相对丰度降低。

进一步地，上述(d)中，肠道有益菌种包括norank-f-Muribaculaceae、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、肠杆菌属(Enterorhabdus)、颤螺科(unclassified-f-Oscillospiraceae)、另枝菌属(Alistipes)和瘤胃球菌科(unclassified-f-Ruminococcaceae)中一种或多种；(e)中，肠道有害菌种包括埃希杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)、狭义梭菌属(Clostridium-sensu-stricto-1)、毛螺旋菌属(Parasutterella)、肠球菌属(Enterococcus)和艰难梭菌属(Clostridioides)中一种或多种。

为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。

实施例1 TY-G03的分离纯化及鉴定

(1)实验材料

采集四川省阿坝藏族羌族自治州红原县牧民家自然发酵牦牛酸乳：用无菌小勺取牧民家中自制的牦牛酸乳，将其装入含有适量无菌碳酸钙和可溶性淀粉的15mL无菌旋盖离心管中(碳酸钙∶可溶性淀粉质量比例为1∶1)，搅拌均匀后旋紧旋盖，然后放入冷藏箱，运回实验室立即进行乳酸菌的纯化分离。

(2)TY-G03的分离纯化

在无菌条件下，吸取1mL(1)中样品于9mL无菌生理盐水中，涡旋使其混匀，即为10^-1的样品稀释液，再依次进行10倍梯度稀释至10^-7，选取10^-5、10^-6和10^-7稀释度下的稀释液100μL，均匀涂布于MRS平板上，37℃倒置培养48h；培养结束后，观察MRS平板上菌落形态，挑取中等大小、凸起、微白色或微黄色、湿润、边缘整齐和呈圆形的菌落进行平板划线法纯化菌株，重复此划线操作，直至得到纯化的菌株。

(3)形态结构观察

将(2)中已经纯化的菌株接种于5mL无菌MRS肉汤(由北京陆桥技术股份有限公司提供)中，37℃培养18h；取1mL菌液以转速为12000r/min离心1min，再用无菌生理盐水洗涤两次后，然后加入等体积无菌生理盐水重悬菌体，最后用接种环取少量均匀涂布于载玻片上，固定后，进行革兰氏染色，镜检，拍照；革兰氏阳性菌(G+)染色后细胞呈蓝紫色，革兰氏阴性菌(G-)细胞呈红色；观察并记录菌株菌落形态和革兰氏染色结果；

菌株菌落形态如图1所示，菌株纯化后在固体培养基中形成单菌落，菌落形态一致，呈半球形、白色、表面光滑湿润，且边缘平整；

革兰氏染色结果如图2所示，革兰氏染色后在显微镜下观察到紫色细胞形态(图2做了灰度处理，原图为紫色)，形状呈杆状，判定为革兰氏阳性菌(G⁺)。

(4)API 50CH试剂盒生化特性鉴定

乳酸杆菌种水平的表型鉴定主要依据碳水化合物发酵试验，即将已经纯化的菌株接种于5mL无菌MRS肉汤中，37℃培养18h。于3000r/min、15min的条件下离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体后重悬为菌悬液，通过API50CH试剂盒(参考API50CH试剂盒说明书进行操作。)鉴定TY-G03菌悬液对49种不同碳水化合物的利用情况，发酵乳杆菌TY-G03对49种碳水化合物的API50CH反应情况如图3所示，其中管号5、10、11、12、28、29、30、31、35和47发生了反应，呈阳性，具体统计情况如下表1所示；发酵乳杆菌TY-G03的API50CH鉴定结果如下表2所示；结果显示，在供试的49种碳源中，该菌株可以利用其中10种碳水化合物。经APIlabplus系统最终鉴定，实验菌株为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，其ID值为99.60％，T值为1，达到鉴定要求(ID值≥99.0％且T值≥0.5)。

表1 LactobacillusfermentumTY-G03对49种碳水化合物发酵试验结果

注：“+”代表反应阳性；“－”代表反应阴性。

表2发酵乳杆菌TY-G03的API 50CH鉴定结果

(5)PCR扩增16S rDNA序列

采用25μL反应体系和以下PCR扩增程序进行16SrDNA基因扩增，25μL反应体系：模板1μL、上游引物(序列如SEQIDNO.2所示)(10μM)1μL、下游引物(序列如SEQIDNO.3所示)(10μM)1μL、2×TaqPCRMasterMix12.5μL，用无菌超纯水补足至25μL；PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃末端延伸10min；序列扩增后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司对检测合格的PCR扩增产物进行测序，测得序列如SEQIDNo.1所示；使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在GenBank中进行搜索和同源性分析，同源性分析结果显示，TY-G03为发酵乳杆菌。

实施例2 TY-G03对肠道菌群失调的预防作用验证

(1)实验材料

有助于预防肠道菌群失调的发酵乳杆菌TY-G03：分离自四川红原牧民家自然发酵牦牛酸乳，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCCNo.23753。

(2)实验动物分组及处理

选取7周龄的BALB/c雄性小鼠(20g-25g)，饲养于室温25℃±2℃、相对湿度50％±5％、12h光照/12h黑暗的标准化实验室中，适应性喂养一周后开始实验；适应期结束后，小鼠随机分为正常组、药物组、TY-G03治疗组，每组10只。

实验周期为18d，1d-14d为TY-G03干预期，正常组和药物组灌胃10mL/kg.BW的生理盐水，治疗组灌胃10⁹CFU/kg.BW的TY-G03菌液，灌胃容积同正常组和药物组；第15d开始进行小鼠肠道菌群失调造模实验，除正常组外的各组均灌胃10mg/kg·BW盐酸洛哌丁胺溶液，正常组小鼠灌胃10mL/kg.BW的生理盐水；间隔1h后，正常组和药物组灌胃10mL/kg.BW的生理盐水，治疗组灌胃10⁹CFU/kg.BW的TY-G03菌液，持续3d；直到实验的第17d天，灌胃结束后，所有小鼠开始禁食，禁食16h后，处死解剖小鼠，收集每只小鼠的盲肠组织(带内容物)并装于无菌离心管中。

(3)肠道菌群测序及测序结果处理

1)样本收集

在无菌条件下收集各组小鼠的盲肠内容物，用于微生物多样性测序。

2)DNA抽提和PCR扩增

根据

soil DNA试剂盒的说明书进行盲肠内容物微生物群落总DNA抽提，使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，NanoDrop2000用于测定DNA浓度和纯度；

使用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3’)对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增程序如下：95℃预变性3min，25个循环(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s)，然后72℃稳定延伸10min，最后在4℃进行保存(PCR仪：ABI

9700型)；PCR反应体系为：5×TransStart FastPfu缓冲液4μL，2.5mM dNTPs 2μL，上游引物(5uM)0.8μL，下游引物(5uM)0.8μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4μL，模板DNA 10ng，ddH₂O补足至20μL。

3)Illumina Miseq测序

将同一样本的PCR产物混合后使用2％琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNAGel Extraction Kit进行回收产物纯化，2％琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus^TMFluorometer对回收产物进行检测定量；使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit进行建库：(1)接头链接；(2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；(3)利用PCR扩增进行文库模板的富集；(4)磁珠回收PCR产物得到最终的文库。利用Illumina公司的NovaSeq PE250平台进行测序，测序委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。

4)测序数据处理

使用FASTP(https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0)软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version1.2.7)软件进行拼接；基于默认参数，使用Qiime2流程中的DADA2插件对质控拼接之后的优化序列进行降噪处理；DADA2降噪处理之后的序列通常被称为ASVs(即扩增子序列变体)；基于Sliva 16S rRNA数据库(v 138)，使用Qiime2中的Naive bayes分类器对ASVs进行物种分类学分析；通过上海美吉生物医药科技有限公司的多样性云分析平台(Qiime2流程)(cloud.majorbio.com)进行后续的数据分析。

(4)数据分析

1)肠道菌群的α-多样性分析

肠道菌群的多样性分析主要包括α-多样性和β-多样性两个部分，其中α-多样性主要用于研究某一样本的菌群多样性，可通过对一系列α-多样性指数进行评估，获得菌群中物种的丰富度、多样性等信息，反映菌群丰富度常用多样性指数有Ace指数等，反映菌群多样性常用多样性指数有Shannon指数和Simpson指数等；一般来说，Ace指数和Shannon指数越高分别表示菌群的丰富度和多样性越高；Simpson指数越高则表示菌群的多样性越低；

各组小鼠的α-多样性指数变化情况如图4、图5和图6所示，结果显示，在Ace、Simpson指数上药物组与正常组均存在显著性差异，表明盐酸洛哌丁胺使小鼠肠道菌群的多样性和丰富度发生了变化，治疗组的Ace指数和Shannon指数显著高于药物组，Simpson指数显著低于药物组(p<0.05)；以上结果表明，盐酸洛哌丁胺降低了肠道菌群的多样性和丰富度，而TY-G03的干预则可将肠道菌群多样性和丰富度维持在(或优于)正常水平。

2)肠道菌群的β-多样性分析

与α-多样性不同，β-多样性侧重于比较不同样品间的微生物多样性，NMDS分析(Non-metric multidimensional scaling analysis)，即非度量多维尺度分析，是一种将多维空间的研究对象(样本或变量)简化到低维空间进行定位、分析和归类，同时又保留对象间原始关系的数据分析方法，一般使用NMDS分析来比较样本间的相似性；基于β-多样性分析方法，可对TY-G03干预后的肠道菌群变化进行整体认知；

图7为各组NMDS分析结果图，图中不同形状和颜色的数据点代表着各组小鼠的肠道菌群样本，数据点越靠近代表两个样本的肠道菌群越相似；由图7可知，药物组数据点(三角形)形成的椭圆较正常组数据点(圆形)形成的椭圆向下移动，说明盐酸洛哌丁胺造成了小鼠肠道菌群的结构失调；治疗组数据点(菱形)形成的椭圆则向上移动，与药物组完全分开，表明TY-G03显著逆转了由盐酸洛哌丁胺诱导的肠道菌群结构的不良发展；虽然治疗组数据点(菱形)形成的椭圆未与正常组数据点(圆形)形成的椭圆完全重合，但这说明在TY-G03的治疗下，小鼠自发形成一种新的肠道菌群平衡来避免盐酸洛哌丁胺造成困扰。

3)TY-G03对肠道菌群组成的影响

通过比较正常组、药物组和治疗组在门水平、科水平及属水平上的物种差异可以得知不同分组样本在不同分类水平上的物种组成情况，以便于更清晰的了解盐酸洛哌丁胺和TY-G03具体使哪些物种的丰度发生了变化；

在门水平上，各组小鼠的肠道菌群主要以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主，并辅以放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和疣微菌(Verrucomicrobia)等；Firmicutes/Bacteroidetes的比值增加常被认为是肠道菌群不健康的表现之一，研究已经发现Proteobacteria是重要的促炎菌门，与肠道炎症的发生与发展紧密相关；在科水平上，Lachnospiraceae有助于维持肠道正常功能的实现；在属水平上，norank-f-Muribaculaceae，Desulfovibrio，Enterorhabdus，unclassified-f-Oscillospiraceae，Alistipes，unclassified-f-Ruminococcaceae通常被认为是有益的种属，而Escherichia-Shigella，Clostridium-sensu-stricto-1，Parasutterella，Enterococcus，Clostridioides通常被认为是有害的种属；

各组小鼠的在不同分类水平上的特定物种丰度变化情况如图8至图11所示：

由图8可知，药物组Firmicutes/Bacteroidetes的比值相比于正常组显著增加，而治疗组的Firmicutes/Bacteroidetes的比值却显著下降(p<0.05)；

由图9至图10可知，盐酸洛哌丁胺使小鼠肠道菌群门水平上Proteobacteria相对丰度显著增加，并使科水平上Lachnospiraceae相对丰度显著下降，而TY-G03干预显著降低了Proteobacteria相对丰度并提高了Lachnospiraceae相对丰度(p<0.05)；

由图11可知，TY-G03显著增加了属水平上norank-f-Muribaculaceae，Desulfovibrio，Enterorhabdus，unclassified-f-Oscillospiraceae，Alistipes，unclassified-f-Ruminococcaceae等物种的丰度，显著降低了Escherichia-Shigella，Clostridium-sensu-stricto-1，Parasutterella，Enterococcus，Clostridioides等物种的丰度(*0.01<p≤0.05，**0.001<p≤0.01，***p≤0.001)。

以上，说明TY-G03促进了肠道有益菌的生长，抑制了肠道有害菌的生长。

由本发明的动物实验结果可见，盐酸洛哌丁胺诱导小鼠发生了肠道菌群失调，发酵乳杆菌TY-G03通过维持肠道菌群的多样性和丰富度、改变菌群结构、抑制有害菌生长、促进有益菌生长预防了盐酸洛哌丁胺诱导的菌群失调；发酵乳杆菌TY-G03进入肠道后，可能通过占位竞争调节小鼠肠道内紊乱的菌群结构，与肠道原生菌形成新的稳态，恢复肠道内菌群的平衡。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

序列表

<110> 重庆市天友乳业股份有限公司

<120> 发酵乳杆菌TY-G03及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1110

<212> DNA

<213> 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)

<400> 1

ggaaagggcg agtgctataa tgcaagtcga acgcgttggc ccaattgatt gatggtgctt 60

gcacctgatt gattttggtc gccaacgagt ggcggacggg tgagtaacac gtaggtaacc 120

tgcccagaag cgggggacaa catttggaaa cagatgctaa taccgcataa caacgttgtt 180

cgcatgaaca acgcttaaaa gatggcttct cgctatcact tctggatgga cctgcggtgc 240

attagcttgt tggtggggta acggcctacc aaggcgatga tgcatagccg agttgagaga 300

ctgatcggcc acaatgggac tgagacacgg cccatactcc tacgggaggc agcagtaggg 360

aatcttccac aatgggcgca agcctgatgg agcaacaccg cgtgagtgaa gaagggtttc 420

ggctcgtaaa gctctgttgt taaagaagaa cacgtatgag agtaactgtt catacgttga 480

cggtatttaa ccagaaagtc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 540

ggcaagcgtt atccggattt attgggcgta aagagagtgc aggcggtttt ctaagtctga 600

tgtgaaagcc ttcggcttaa ccggagaagt gcatcggaaa ctggataact tgagtgcaga 660

agagggtagt ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga agaacaccag 720

tggcgaaggc ggctacctgg tctgcaactg acgctgagac tcgaaagcat gggtagcgaa 780

caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga gtgctatgtg ttggagggtt 840

tccgcccttc agtgccggag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa 900

agttgaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 960

cgaagctacg cgaagaaccc ttaccagtct tgacatcttg cgccaaccct agagataggc 1020

gtttccttcg gacgcaatga cagtgtgcat ggtcgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1080

gggttaagtc cccgcaacga gcgccaaccc 1110

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacgacttaa ccccaatcgc 20

Claims (9)

1.发酵乳杆菌TY-G03(LactobacillusfermentumTY-G03)，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23753。

2.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌TY-G03，其特征在于，其16SrDNA序列包含如SEQID NO.1所示序列。

3.组合物，其特征在于，包括以下物质中的一种或多种混合：(a)权利要求1或2所述的发酵乳杆菌TY-G03；(b)权利要求1或2所述的发酵乳杆菌TY-G03的裂解物；(c)权利要求1或2所述的发酵乳杆菌TY-G03的培养物；(d)权利要求1或2所述的发酵乳杆菌TY-G03的发酵液。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，还包括益生菌、膳食纤维和药学活性化合物中一种或多种组合。

5.制剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的发酵乳杆菌TY-G03或权利要求3或4所述的组合物，以及载体，其中，载体为可药用载体或可食用载体。

6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或液体剂。

7.权利要求1或2所述的发酵乳杆菌TY-G03或权利要求3或4所述的组合物在制备用于预防或治疗机体肠道菌群失调的制剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，应用包括以下一种或多种：(a)在制备用于维持或提高机体肠道菌群多样性和丰富度的制剂中的应用；(b)在制备用于平衡机体肠道菌群结构的制剂中的应用；(c)在制备用于保持或降低机体肠道菌群中厚壁菌门(Firmicutes)菌群与拟杆菌门(Bacteroidetes)菌群比值的制剂中的应用；(d)在制备用于促进机体肠道菌群中肠道有益菌种生长的制剂中的应用；(e)在制备用于抑制机体肠道菌群中肠道有害菌种生长的制剂中的应用；(f)在制备用于维持或降低机体肠道菌群中变形菌门(Proteobacteria)菌群相对丰度的制剂中的应用；(g)在制备用于维持或提高机体肠道菌群中毛螺菌科(Lachnospiraceae)菌群相对丰度的制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，(d)中，肠道有益菌种包括norank-f-Muribaculaceae、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、肠杆菌属(Enterorhabdus)、颤螺科(unclassified-f-Oscillospiraceae)、另枝菌属(Alistipes)和瘤胃球菌科(unclassified-f-Ruminococcaceae)中一种或多种；(e)中，肠道有害菌种包括埃希杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)、狭义梭菌属(Clostridium-sensu-stricto-1)、毛螺旋菌属(Parasutterella)、肠球菌属(Enterococcus)和艰难梭菌属(Clostridioides)中一种或多种。

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