CN115025228B - 具有协同治疗作用的抗肿瘤纳米颗粒、制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有协同治疗作用的抗肿瘤纳米颗粒、制备方法及应用，其中具纳米颗粒包括载体和负载于载体内的药物分子，药物分子包括糖酵解抑制剂和葡萄糖转运蛋白抑制剂中的至少一种，以及自噬抑制化合物，从而形成载药纳米颗粒，该载药纳米颗粒表面还修饰有肿瘤靶向分子，所述糖酵解抑制剂以竞争性反应的方式抑制细胞内葡萄糖的酵解代谢。本发明还公开了这种纳米颗粒的制备方法，在抗肿瘤药物中的应用，以及与免疫治疗生物制剂联合用药。体外体内实验表明本发明公开的纳米制剂具有优异的抗肿瘤效果，体现出药物的协同治疗作用，并且通过联合用药能够进一步增强抗肿瘤效果。

Description

具有协同治疗作用的抗肿瘤纳米颗粒、制备方法及用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及抗肿瘤药物，具体涉及一种具有协同治疗作用的抗肿瘤纳米颗粒、制备方法及用途。
背景技术
近些年中国的癌症发病率依旧呈现上升趋势。作为一种新兴的癌症治疗方法，饥饿治疗近年来引起了人们的极大兴趣。相关研究表明，癌细胞主要通过有氧糖酵解来产生三磷酸腺苷(ATP)，其产生ATP的速度大约是正常细胞中氧化磷酸化的100倍，这也意味着癌细胞将消耗更多的葡萄糖来满足自身的需要，而这一过程中也常常伴随着大量乳酸的分泌。因此，通过耗尽癌细胞内的葡萄糖并下调ATP的产生将能够有效的抑制肿瘤的生长和发展。其中，通过血管阻断剂直接阻断肿瘤内的营养供应和葡萄糖氧化酶(GOx)催化反应快速消耗癌细胞内葡萄糖这两种典型的治疗方案得到了广泛的关注。但由于肿瘤微环境的复杂性(如缺氧、蛋白酶水平高等)、非特异性、全身毒性等因素，严重限制了这两种方式的治疗效果。因此，迫切需要开发一种创新的饥饿治疗策略来有效地切断癌细胞的营养和能量供应。
另一方面，单一的肿瘤治疗方法在临床实验中的治疗效果欠佳，而近年来发展的肿瘤免疫疗法已受到了越来越多的关注。因此，将目前传统的肿瘤治疗方法(如化疗，放疗等)和免疫治疗相结合来治疗肿瘤已经被大量应用于临床实验中。然而，肿瘤组织是一个免疫抑制性的微环境，其中大量存在的免疫抑制性细胞如调节性T(Treg)细胞严重限制了免疫治疗的效果。因此有研究者开发出了一种单克隆抗体Ipilimumab(anti-CTLA-4)，希望这种抗体能够有效的去抑制细胞膜表面高表达CTLA-4的Treg细胞，从而解除Treg细胞的免疫抑制效应以实现增强免疫治疗的效果。然而，由于癌细胞活跃的糖酵解代谢使得肿瘤微环境中葡萄糖缺乏和乳酸大量富集，而这种特殊的肿瘤微环境使得anti-CTLA-4抗体对Treg细胞的抑制作用往往有限。
基于对肿瘤微环境和现有治疗方法的理解，本申请的发明人认识到降低肿瘤细胞的葡萄糖消耗和乳酸产生将有助于逆转肿瘤微环境中的葡萄糖和乳酸含量，从而提高anti-CTLA-4抗体对Treg细胞的抑制作用以增强免疫治疗。基于此，本申请旨在发展一种新兴的治疗手段，通过抑制癌细胞的糖酵解和阻断癌细胞的葡萄糖供应来实现肿瘤的饥饿治疗，同时逆转肿瘤微环境中的葡萄糖和乳酸含量，促进anti-CTLA-4的免疫治疗效果。本发明提出一种基于上述策略的抗肿瘤药剂。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种具有协同治疗作用的抗肿瘤纳米颗粒。
其技术方案如下：
一种具有协同治疗作用的抗肿瘤纳米颗粒，其关键在于，包括载体，所述载体内负载有药物分子，所述药物分子包括糖酵解抑制剂和葡萄糖转运蛋白抑制剂中的至少一种，以及自噬抑制化合物，从而形成载药纳米颗粒，该载药纳米颗粒表面还修饰有肿瘤靶向分子；
所述糖酵解抑制剂以竞争性反应的方式抑制细胞内葡萄糖的酵解代谢。
作为优选，上述功能分子以包载的方式负载于所述载体内。
作为优选，上述载体为沸石咪唑骨架-8(ZIF-8)。
作为优选，上述糖酵解抑制剂为2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)，所述葡萄糖转运蛋白(GLUT1)抑制剂为BAY-876，所述自噬抑制化合物为氯喹(CQ)。
作为优选，上述肿瘤靶向分子为硫酸软骨素(CS)。
作为优选，上述纳米颗粒由2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)、BAY-876和氯喹(CQ)封装于ZIF-8内，并且在表面通过静电作用修饰硫酸软骨素(CS)后形成。
作为优选，以重量分数计，三种药物分子的比例为BAY-876:CQ:2-DG＝1:5:25。
本发明的目的之二在于提供一种抗肿瘤纳米颗粒的制备方法。其技术方案如下：
如上所述抗肿瘤纳米颗粒的制备方法，其关键在于制备过程为：配置溶解有无机锌盐、2-DG的第一溶液或溶解有无机锌盐、2-DG和CQ的第一溶液，同时配置溶解有2-甲基咪唑或溶解有BAY-876和2-甲基咪唑的第二溶液，再将其中一种溶液逐滴滴加到另一种溶液中，充分反应得到含有颗粒物的悬浮液，经第一后处理收集所述颗粒物；
将所述颗粒物分散于含有CS的水溶液中，黑暗条件下搅拌反应，经第二后处理得到所述纳米颗粒。
本发明的目的之三在于提供一种抗肿瘤纳米颗粒的用途。其技术方案如下：
如上所述的纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的之四在于提供一种抗肿瘤联合用药物。其技术方案如下：
一种联合用药物，其关键在于，含有同时或者分别给药的如上所述的纳米颗粒，以及anti-CTLA-4单克隆抗体(Ipilimumab)。
附图说明
图1为实施例9制备的纳米颗粒扫描电子显微镜(SEM)图片；
图2(a)为ZIF-8、D/B/CQ@ZIF-8和D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒的zeta电位测试结果；图2(b)为D/B/CQ@ZIF-8和D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒以及CS的傅立叶红外(FTIR)吸收图谱；
图3为流式细胞仪检测D/B/RhmB@ZIF-8、D/B/RhmB@ZIF-8@CS和D/B/RhmB@ZIF-8@CS+CS对4T1细胞的靶向性结果，其中：3(a)靶向内吞效果比较；(b)平均荧光强度值；
图4为不同纳米颗粒对4T1癌细胞的糖酵解抑制性能比较，其中：4(a)细胞外培养液乳酸含量；4(b)细胞外培养液葡萄糖含量；4(c)4T1细胞胞内ATP含量；
图5为不同细胞经各种纳米颗粒处理48h后的相对细胞存活率，其中：5(a)内皮细胞EC，5(b)癌细胞4T1；
图6为4T1小鼠模型经不同纳米颗粒治疗效果比较，其中：6(a)治疗16天内小鼠肿瘤体积变化情况，6(b)各组小鼠16天后肿瘤抑制率；各个组进行干预治疗给予的药物分别为：(1)PBS，(2)ZIF-8@CS，(3)B@ZIF-8@CS，(4)D@ZIF-8@CS，(5)D/B@ZIF-8@CS，(6)D/B/CQ@ZIF-8@CS；
图7为单独给药与联合给药对4T1小鼠模型的肿瘤治疗效果比较，其中：7(a)治疗16天内小鼠肿瘤体积变化情况，7(b)各组小鼠16天后肿瘤抑制率；7(c)各组小鼠肿瘤内Foxp3+Treg细胞数量；各个组进行干预治疗给予的药物分别为：(1)PBS,(2)anti-CTLA-4,(3)D/B/CQ@ZIF-8@CS,(4)D/B/CQ@ZIF-8@CS+anti-CTLA-4。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
(一)纳米颗粒及其制备
一种具有协同治疗作用的抗肿瘤纳米颗粒，包括载体，所述载体内负载有药物分子，所述药物分子包括糖酵解抑制剂和/或葡萄糖转运蛋白抑制剂，从而形成载药纳米颗粒，该载药纳米颗粒表面还修饰有肿瘤靶向分子；其中，所述糖酵解抑制剂以竞争性反应的方式抑制细胞内葡萄糖的酵解代谢。
在一种实施方式中，所述载体内还负载有自噬抑制化合物。
为保持药物分子在载体上的携载稳定性，并能够有效释放，在一种方式中，所述糖酵解抑制剂或葡萄糖转运蛋白抑制剂或自噬抑制化合物以包载的方式负载于所述载体内。
在一组药物具体制备过程中，选择沸石咪唑骨架-8(ZIF-8)为载体，以2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)为糖酵解抑制剂，以GLUT1抑制剂BAY-876为葡萄糖转运蛋白抑制剂，以氯喹(CQ)为自噬抑制化合物。肿瘤靶向分子选择硫酸软骨素(CS)。首先通过一锅法将药物分子(记为MOL)有效地封装于ZIF-8中制备了MOL@ZIF-8纳米颗粒。随后通过静电相互作用，在MOL@ZIF-8表面修饰了能对癌细胞具有靶向作用的硫酸软骨素(CS)，得到MOL@ZIF-8@CS纳米颗粒。几种具体药物的制备过程如实施例1～9所示。
试剂：2-甲基咪唑购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，Zn(NO3)2·6H2O和CQ购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，2-DG购自上海泰坦科技股份有限公司，BAY-876购自美国MedChemexpress生物科技公司，CS购自生工生物工程(上海)。
实施例1
制备D@ZIF-8@CS纳米颗粒，步骤为：
①将0.15g Zn(NO3)2·6H2O溶解于7.0mL甲醇得到Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液，再将25mg 2-DG溶解于0.5mL去离子水，然后与上述Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液混合，得到第一溶液；同时，将0.33g 2-甲基咪唑溶解在7.5mL甲醇中，得到第二溶液；
②将第二溶液逐滴添加到上述第一溶液中，将所得混合物溶液在室温下搅拌30分钟，反应得到含有颗粒物的悬浮液；
③通过离心收集纳米颗粒，用去离子水和乙醇洗涤三次，然后再真空干燥，得到D@ZIF-8纳米颗粒；
④将上述制备好的D@ZIF-8分散于10mg·mL-1CS的水溶液中超声分散10分钟，室温下在黑暗中搅拌48小时后，离心悬浮液，用去离子水彻底清洗以去除游离的CS，最终得到D@ZIF-8@CS纳米颗粒。
实施例2
制备B@ZIF-8@CS纳米颗粒，参照实施例1的方法制备，不同之处在于，步骤①中，将0.15g Zn(NO3)2·6H2O溶解于7.5mL甲醇得到Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液，即为第一溶液；同时，将1mg BAY-876和0.33g 2-甲基咪唑溶解在7.5mL甲醇中，得到第二溶液。再进行步骤②～④，得到B@ZIF-8@CS纳米颗粒。
实施例3～5
制备B/D@ZIF-8@CS纳米颗粒，参照实施例1的方法制备，不同之处在于，实施例3的步骤①中，将0.15g Zn(NO3)2·6H2O溶解于7.0mL甲醇得到Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液，再将10mg 2-DG溶解于0.5mL去离子水，然后与上述Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液混合，得到第一溶液；同时，将1mg BAY-876和0.33g 2-甲基咪唑溶解在7.5mL甲醇中，得到第二溶液。再进行步骤②～④，得到B/D@ZIF-8@CS纳米颗粒。
实施例4与实施例3的不同之处在于，步骤①中，2-DG用量为25mg。
实施例5与实施例3的不同之处在于，步骤①中，2-DG用量为50mg。
实施例3、实施例4和实施例5最终得到的B/D@ZIF-8@CS纳米颗粒中BAY-876与2-DG的比例依次减小。
实施例6～8
制备B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒，参照实施例1的方法制备，不同之处在于，实施例6的步骤①中，将0.15g Zn(NO3)2·6H2O溶解于7.0mL甲醇得到Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液，再将1mg CQ溶解于0.5mL去离子水，然后与上述Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液混合，得到第一溶液；同时，将1mg BAY-876和0.33g 2-甲基咪唑溶解在7.5mL甲醇中，得到第二溶液。再进行步骤②～④，得到B/D@ZIF-8@CS纳米颗粒。
实施例7与实施例6的不同之处在于，步骤①中，CQ用量为5mg。
实施例8与实施例7的不同之处在于，步骤①中，CQ用量为10mg。
实施例6、实施例7和实施例8最终得到的B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒中BAY-876与CQ的比例依次减小。
实施例9
制备D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒，参照实施例1的方法制备，不同之处在于，步骤①中，将0.15g Zn(NO3)2·6H2O溶解于7.0mL甲醇得到Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液，再将25mg 2-DG和5mg CQ溶解于0.5mL去离子水，然后与上述Zn(NO3)2·6H2O甲醇溶液混合，得到第一溶液；同时，将1mg BAY-876和0.33g 2-甲基咪唑溶解在7.5mL甲醇中，得到第二溶液。再进行步骤②～④，得到D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒。
由于药物分子的携载是伴随ZIF-8颗粒的生成过程同步进行的，各种药物的实际载药比例(BAY-876约1.63％，CQ约4.13％，2-DG约21.25％)与投料比例接近。
(二)纳米颗粒的表征
形貌表征
由于实施例1～9的纳米颗粒均采用相近的方法制备，因此其形貌主要取决于沸石咪唑骨架-8的形貌。取实施例9制备的D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒，参照文献方法(Yuan M,Liang S,Zhou,Y,et al.A Robust Oxygen-Carrying Hemoglobin-Based NaturalSonosensitizer for Sonodynamic Cancer Therapy.Nano Lett.2021,21(14),6042-6050.)，制备扫描电子显微镜(SEM)试样并进行观测。如图1所示，SEM照片显示D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒的粒径约为100nm，且为正十二面体结构。
纳米颗粒电位和傅立叶红外吸收光谱(FTIR)表征
按照上述实施例1的方法制备空白ZIF-8纳米颗粒，同时取实施例9步骤③制备的D/B/CQ@ZIF-8纳米颗粒和步骤④制得的D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒，按现有方法进行zeta电位测试。
如图2a所示，测得D/B/CQ@ZIF-8纳米颗粒的zeta电位是正电位(+26.1mV)，当修饰CS后D/B/CQ@ZIF-8@CS的电位变为负电位(-39.9mV)，这表明CS成功的修饰在了D/B/CQ@ZIF-8纳米颗粒上(An J,HuY G,Li C,et al.A pH/Ultrasound dual-responsebiomimetic nanoplatform for nitric oxide gas-sonodynamic combined therapy andrepeated ultrasound for relieving hypoxia[J].Biomaterials,2020,230,119636.)。
取实施例9步骤③制备的D/B/CQ@ZIF-8纳米颗粒和步骤④制得的D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒，以及CS，分别按照现有方法进行FTIR测试。如图2b所示，D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒较D/B/CQ@ZIF-8纳米颗粒在CS的特征吸收峰(～1060cm-1附近)处吸收增强，也证明了CS成功的修饰在了D/B/CQ@ZIF-8纳米颗粒上。
(三)纳米颗粒的抗肿瘤治疗作用
实施例10
纳米颗粒对癌细胞的靶向性能验证
为了观察D/B/CQ@ZIF-8@CS的细胞靶向摄取行为，选用具有荧光发光性能的罗丹明B(Rhm B)作为CQ替代物，参照实施例9的方法制备了D/B/RhmB@ZIF-8纳米颗粒和D/B/RhmB@ZIF-8@CS纳米颗粒。为了研究细胞靶向摄取，首先将4T1细胞接种在6孔板中。细胞正常生长后，将细胞分为三组，将等量的D/B/RhmB@ZIF-8纳米颗粒，D/B/RhmB@ZIF-8@CS纳米颗粒，以及D/B/RhmB@ZIF-8@CS纳米颗粒和CS分别分散于等量PBS溶液中，再混入培养基分别加入到各个培养组，各组中纳米颗粒添加量相同，共培养2小时后，用PBS洗涤细胞三次，随后用流式细胞仪检测细胞荧光强度，检测数据用Flowjo软件分析。
如图3所示，通过细胞流式半定量分析发现，与D/B/RhmB@ZIF-8纳米颗粒孵育处理相比，经D/B/RhmB@ZIF-8@CS纳米颗粒处理的4T1细胞显示出更多的吞噬量。
通过向添加D/B/RhmB@ZIF-8@CS纳米颗粒的培养基中加入过量CS以阻断4T1细胞的CD-44受体，进行竞争抑制实验。与单独添加D/B/RhmB@ZIF-8@CS纳米颗粒处理组比较，添加游离CS后，细胞对纳米颗粒的吞噬量明显下降。上述实验证实CS修饰赋予了D/B/RhmB@ZIF-8纳米颗粒对4T1细胞的靶向能力。
实施例11
纳米颗粒对癌细胞糖酵解抑制实验
将4T1细胞分别接种于6孔板中，细胞正常生长后，将细胞分为三组，各组DMEM培养基中分别添加等量的分散于PBS溶液中的D@ZIF-8@CS纳米颗粒、B@ZIF-8@CS纳米颗粒、实施例4制得的B/D@ZIF-8@CS纳米颗粒以及实施例9制得的D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒，各组培养基中纳米颗粒浓度(80μg·mL-1)相同。对照组培养基中添加等量PBS溶液。与不同的纳米颗粒共培养48小时后，收集细胞外培养液进行乳酸(乳酸分析试剂盒，购自南京建成生物工程研究所)和葡萄糖(葡萄糖分析试剂盒，碧云天，S0201S)测定，收集细胞进行ATP检测(ATP检测试剂盒，碧云天，S0026)。
由图4a可以看出，与PBS组相比，经D/B@ZIF-8@CS和D/B/CQ@ZIF-8@CS处理后4T1细胞外的乳酸水平均出现了明显下降，48小时乳酸产生量分别下降38.9％和41.7％。
通过测定细胞外培养基的葡萄糖水平，来验证BAY-876对GLUT1的抑制作用。如图4b所示，D/B@ZIF-8@CS和D/B/CQ@ZIF-8@CS组细胞外葡萄糖水平较高，说明通过抑制糖酵解和GLUT1，癌细胞的葡萄糖消耗大大降低。
为了进一步验证糖酵解抑制作用，研究不同纳米颗粒处理后4T1细胞内的ATP水平，结果如图4c所示，与B@ZIF-8@CS和D@ZIF-8@CS组相比，D/B@ZIF-8@CS组ATP产量显著下降，48小时培养后下降了70.5％。这一结果表明BAY-876的协同作用大大提高了2-DG对糖酵解的抑制作用。ATP水平最低的是D/B/CQ@ZIF-8@CS组，推测其原因是CQ可以通过抑制自噬，进一步地有效增强纳米颗粒对癌细胞的饥饿治疗作用。
实施例12
纳米颗粒对癌细胞饥饿治疗体外实验
首先通过预实验研究了药物BAY-876、2-DG分别与CQ之间是否存在协同作用。将肿瘤细胞(4T1)接种于96孔板，每孔细胞数量为5×103个，将细胞分为B/2-DG组和B/CQ组两个实验组，以及一个对照组，其中每个实验组又分为三种不同的药物比例组。孵育24小时细胞贴壁后，将分散于PBS溶液中的药物比例组添加到细胞培养基中。对于B/2-DG组，每个药物比例组(质量比B/2-DG＝1:10，1:25，1:50)设置一系列梯度浓度。对于B/CQ组，每个药物比例组(质量比B/CQ＝1:1，1:5，1:10)设置一系列梯度浓度。对照组培养基中添加等量PBS溶液。再孵育48小时后，用阿尔玛蓝(Almar Blue)试剂盒检测细胞活力，评价每个药物比例组对癌细胞的饥饿治疗杀伤作用，根据细胞活力计算各个药物的IC50，再计算出协同指数。实验发现，对于B/2-DG组，当其比例为1:25时，B/2-DG的协同指数CI50＝0.93；对于B/CQ组，当其比例为1:5时，B/CQ的协同指数CI50＝0.872。考虑到这种比例能达到最佳的协同效果，因此在研究负载三种药物的纳米颗粒抗肿瘤效果时，按照B/CQ/2-DG＝1:5:25质量比即实施例9的方法进行纳米颗粒制备。
在预实验基础上，进一步比较负载不同药物的纳米颗粒体外抗肿瘤效果。
将内皮细胞(EC)和肿瘤细胞(4T1)分别接种于96孔板，每孔细胞数量为5×103个，两种细胞都分为五个实验组和一个对照组。孵育24小时细胞贴壁后，将分散于PBS溶液中的ZIF-8@CS纳米颗粒、B@ZIF-8@CS纳米颗粒、D@ZIF-8@CS纳米颗粒、实施例4制得的B/D@ZIF-8@CS纳米颗粒和实施例9制得的D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒添加到细胞培养基中，每个实验组设置一系列梯度浓度，使得培养体系中纳米颗粒的浓度分别为10～80μg·mL-1。对照组培养基中添加等量PBS溶液。再孵育48小时后，用阿尔玛蓝(AlmarBlue)试剂盒检测细胞活力，评价纳米颗粒对细胞的饥饿治疗杀伤作用。
结果表明，这些纳米颗粒处理48小时都表现出对4T1细胞的毒性，然而对内皮(EC)细胞的毒性较弱(如图5所示)。纳米颗粒对4T1细胞的杀伤作用随纳米颗粒的浓度增大而增强。与单独携载一种药物分子相比，携载两种药物分子的纳米颗粒D/B@ZIF-8@CS处理48小时后，细胞活力下降更为显著。携载三种药物分子的纳米颗粒D/B/CQ@ZIF-8@CS处理48小时使细胞活力下降最多。这些对比反映了药物分子之间的协同作用。当使用80μg·mL-1的D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒处理48小时后，细胞活力下降了67.3％，即这种处理能杀死大部分4T1细胞，表明2-DG、BAY-876和CQ之间的协同作用对癌细胞有更好的饥饿治疗效果。
实施例13
纳米颗粒抗肿瘤体内实验
将含4T1细胞(2×106)的无血清DEME培养液100μL注入Balb/c雌性小鼠乳腺脂肪垫，建立4T1肿瘤模型。当肿瘤大小达到约50mm3时(第8天)，将4T1荷瘤小鼠随机分为6组进行不同的治疗，6组分别为：(1)PBS组，注射PBS溶液；(2)ZIF-8@CS组、(3)B@ZIF-8@CS组、(4)D@ZIF-8@CS组、(5)D/B@ZIF-8@CS组、(6)D/B/CQ@ZIF-8@CS组，分别将纳米颗粒分散于PBS溶液中进行注射。采用静脉注射给药(第8，10，12天给药，总计3次)，给药剂量为10mg·kg-1，注射量为100μL，监测16天治疗内的肿瘤体积变化。
如图6所示，B@ZIF-8@CS、D@ZIF-8@CS和D/B@ZIF-8@CS纳米颗粒在治疗早期对肿瘤生长有明显的抑制作用，但随后肿瘤又重新生长。与体外实验结果情况相同，负载有三种药物的D/B@ZIF-8@CS纳米颗粒较负载一种药物的纳米颗粒对肿瘤生长的抑制作用更强。值得注意的是，D/B/CQ@ZIF-8@CS对肿瘤生长的抑制作用最强，即使在治疗后期也没有复发，说明2-DG、BAY-876和CQ的协同作用发挥了最佳的饥饿治疗效果。以上结果证实了D/B/CQ@ZIF-8@CS具有最强的抗肿瘤作用，进一步验证了2-DG、BAY-876和CQ的协同作用发挥出了最大的抗肿瘤效果。
实施例14
饥饿治疗-免疫治疗抗肿瘤体内实验
理论上，D/B/CQ@ZIF-8@CS治疗后肿瘤微环境中乳酸含量会降低，葡萄糖水平会升高，可促进anti-CTLA-4单抗抑制Treg细胞功能，促进anti-CTLA-4的免疫治疗。为了验证这一假设，通过体内实验评估D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒和anti-CTLA-4单抗(Ipilimumab购自MedChemExpress公司)的体内联合治疗效果。采用如实施例13的方法建立4T1荷瘤小鼠，将4T1荷瘤小鼠随机分为4组进行不同的治疗：(1)PBS组，注射PBS溶液；(2)anti-CTLA-4组，注射Ipilimumab；(3)D/B/CQ@ZIF-8@CS组，注射D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒；(4)D/B/CQ@ZIF-8@CS+anti-CTLA-4组，联合注射D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒和Ipilimumab。采用静脉给药3次，并监测16天治疗内的肿瘤体积变化，其中Ipilimumab给药剂量为3mg·kg-1，给药量100μL，D/B/CQ@ZIF-8@CS纳米颗粒给药剂量为10mg·kg-1，给药量100μL。以治疗组肿瘤体积相对于对照组肿瘤体积减少量作为肿瘤抑制率。
进一步，于治疗结束后处死小鼠，剥离后剪碎肿瘤组织，并用胶原酶消化组织，之后细胞悬液用200目孔径尼龙网过滤，然后离心得单细胞悬液，PBS分散后，用小鼠调节性T细胞染色试剂盒(Multi-Sciences，70-KTR201-100)染色，然后用流式细胞术检测肿瘤组织中调节性T细胞(Foxp3+Treg)的数量。
如图7a和7b所示，D/B/CQ@ZIF-8@CS与anti-CTLA-4联合治疗组具有良好的协同抑瘤作用，对肿瘤生长的抑制作用最强。
如图7c所示，与单独给药的D/B/CQ@ZIF-8@CS组和anti-CTLA-4组相比，D/B/CQ@ZIF-8@CS+anti-CTLA-4组肿瘤组织内调节性T细胞数量明显下降。
以上结果表明，D/B/CQ@ZIF-8@CS联合anti-CTLA-4在所有治疗组中具有最强的抗肿瘤免疫治疗效果，表明其临床治疗潜力巨大。
本发明的有益效果：本发明通过构建负载多种药物分子的纳米颗粒制剂，从抑制糖酵解的角度对肿瘤进行饥饿治疗，同时逆转肿瘤高乳酸、低pH值的微环境，增强自噬抑制化合物的抗肿瘤效果，从而实现协同治疗；在此基础上，进一步联合免疫治疗生物制剂，减少肿瘤组织内免疫抑制性调节T细胞的含量，通过抑制糖酵解对肿瘤高乳酸、低pH值的微环境的逆转，增强免疫治疗的效果。这类新型制剂便于通过静脉给药，具有靶向分子修饰的纳米制剂能够有效靶向肿瘤细胞，使负载的药物在肿瘤组织内释放，体外和体内实验证明，多种药物分子相对于单种药物的纳米制剂，体现出协同治疗效果，与免疫治疗生物制剂联合给药，更加增强了抗肿瘤治疗效果，并且治疗剂量的纳米颗粒药物对血管内皮细胞毒性较小，具有临床应用的潜在前景。
最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种具有协同治疗作用的抗肿瘤纳米颗粒，其特征在于：包括载体，所述载体内负载有药物分子，所述药物分子由糖酵解抑制剂、葡萄糖转运蛋白抑制剂以及自噬抑制化合物组成，从而形成载药纳米颗粒，该载药纳米颗粒表面还修饰有肿瘤靶向分子；
所述糖酵解抑制剂以竞争性反应的方式抑制细胞内葡萄糖的糖酵解代谢；
药物分子以包载的方式负载于所述载体内，所述载体为沸石咪唑骨架-8（ZIF-8）；
所述糖酵解抑制剂为2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG），所述葡萄糖转运蛋白（GLUT1）抑制剂为BAY-876，所述自噬抑制化合物为氯喹（CQ）；
所述肿瘤靶向分子为硫酸软骨素（CS）；
所述纳米颗粒由2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）、BAY-876和氯喹（CQ）封装于ZIF-8内，并且在表面通过静电作用修饰硫酸软骨素（CS）后形成；
以重量分数计，三种药物分子的比例为BAY-876:CQ:2-DG=1:5:25。
2.权利要求1所述的抗肿瘤纳米颗粒的制备方法，其特征在于制备过程为：配置溶解有无机锌盐、2-DG和CQ的第一溶液，同时配置溶解有BAY-876和2-甲基咪唑的第二溶液，再将其中一种溶液逐滴滴加到另一种溶液中，充分反应得到含有颗粒物的悬浮液，经第一后处理收集所述颗粒物；
将所述颗粒物分散于含有CS的水溶液中，黑暗条件下搅拌反应，经第二后处理得到所述纳米颗粒。
3.权利要求1所述的纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.一种联合用药物，其特征在于：含有同时或者分别给药的权利要求1所述的纳米颗粒，以及anti-CTLA-4单克隆抗体。
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