CN111494339A

CN111494339A - 癌细胞膜仿生纳米反应器agz@cm在制备抗癌药物中的应用

Info

Publication number: CN111494339A
Application number: CN202010335234.7A
Authority: CN
Inventors: 刘松琴; 吴亚锋; 邵凤英
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2020-04-24
Publication date: 2020-08-07

Abstract

本发明公开了癌细胞膜仿生纳米反应器AGZ@CM在制备抗癌药物中的应用，其对于肿瘤的高效协同治疗的方法如下：纳米反应器AQ4N/GOx@ZIF‑8通过氨基酸诱导的仿生方法一锅合成，实现了葡萄糖氧化酶的快速包封和超高负载效率，并保持了其天然的生物活性；通过在AGZ表面包覆靶向细胞膜涂层制备的仿生纳米反应器AGZ@CM具有同型靶向性和免疫逃逸功能；ZIF‑8载体遇酸分解释放药物、GOx介导葡萄糖氧化以及前药AQ4N被激活的级联反应，实现了饥饿疗法和化学疗法的协同治疗；体外和体内研究的结果表明，饥饿疗法和化学疗法的协同策略可以提高治疗效果，并且细胞膜涂层赋予纳米反应器强大的靶向能力；本发明公开的这种仿生智能的级联反应纳米反应器具有治疗肿瘤的临床潜力。

Description

癌细胞膜仿生纳米反应器AGZ@CM在制备抗癌药物中的应用

技术领域

本发明生物医学技术领域，具体涉及癌细胞膜仿生纳米反应器AGZ@CM在制备抗癌药物中的应用。

背景技术

与正常的组织细胞相比，肿瘤细胞由于代谢途径紊乱而需要大量的营养和能量来维持其生存和生长。葡萄糖是肿瘤增殖和代谢的主要能力来源，一旦葡萄糖供应被切断，肿瘤的生长将被优先抑制，因此饥饿疗法通过切断营养供应来抑制肿瘤细胞增殖而引起了人们的极大兴趣。葡萄糖氧化酶（GOx）消耗O₂和葡萄糖，催化产生过氧化氢（H₂O₂）对细胞造成氧化损伤并产生葡萄糖酸以降低pH值。然而，单一的饥饿疗法不能取得令人满意的治疗效果，因为葡萄糖供应的阻断只能减慢肿瘤的生长，而不是完全杀死癌细胞。因此，将这种饥饿疗法与其他治疗方法结合起来将是一个有吸引力的策略。缺氧激活的前药对缺氧细胞表现出选择性的较高毒性，而在正常氧含量的正常组织中则显示出较低的毒性，这归因于无毒前药通过肿瘤缺氧而转化为毒性药物。但是，由于渗漏和聚集，低载量和蛋白质递送中催化活性的损失，以及纳米载体的潜在安全性问题，都迫切需要解决。

pH敏感的MOF材料是载药平台的优选纳米材料之一，可以根据肿瘤微环境的pH智能释放药物，增强治疗效果，减小对周围组织的副作用。天然细胞膜涂层纳米技术作为一种新兴的仿生策略，获得的仿生平台继承了与源细胞相似的同源结合和免疫逃逸能力，这种特殊的同源结合方式可以在一定程度上降低肿瘤异质性引起的个体差异。更好的是，这种仿生策略可以最大程度地减少生物环境中的非特异性相互作用，从而有助于延长循环寿命并避免体内免疫系统的识别和消除。因此，肿瘤细胞膜包被的仿生纳米平台可以绕过生物屏障以实现有效的药物输送，从而通过EPR效应和同源靶向实现优先的肿瘤积累和特定的细胞摄取。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了癌细胞膜仿生纳米反应器AGZ@CM在制备抗癌药物中的应用。本发明不需要复杂的合成过程，细胞膜包裹过程简单，被细胞膜包裹的纳米颗粒具有同源结合和免疫逃逸的功能，有助于延长循环寿命并避免体内免疫系统的识别和消除。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：基于仿生纳米载体精确控制药物释放和激活的高剂量药物对于肿瘤的高效协同治疗，所述治疗方法包括以下步骤：仿生纳米反应器AGZ@CM具有同源靶向和免疫逃逸的功能，靶向细胞同源结合将其内化后，ZIF-8暴露在酸性溶酶体中被分解，GOx和前药AQ4N被智能释放，释放后的GOx氧化了内源性葡萄糖，切断了肿瘤的能量供给，并消耗了O₂使得肿瘤内环境乏氧加剧，将无毒前药AQ4N激活成具有毒性的AQ4，其对DNA具有强亲合力，引起DNA损伤。而且GOx介导的酶催化过程中生成了H₂O₂和葡萄糖酸，分别引起氧化性细胞毒性和酸性升高，这些都有助于肿瘤细胞的死亡。体外和体内的研究证明，该方法能够抑制肿瘤的生长。

癌细胞膜仿生纳米反应器AGZ@CM在制备抗癌药物中的应用。

所述仿生纳米反应器是以ZIF-8为纳米载体，负载GOx以及AQ4N后，在其表面包覆细胞膜，即可得到仿生纳米反应器AGZ@CM。

其中，所述ZIF-8负载的GOx的负载量为50~150 μg mg^-1。

其中，所述ZIF-8负载的AQ4N的负载量为20~50 μg mg^-1。

其中，对pH敏感的纳米载体ZIF-8，能够智能释放货物GOx和AQ4N的pH为5.0。

其中，所述细胞培养条件为：含有10％胎牛血清（FBS）和1％抗生素（青霉素-链霉素，10000 U mL^-1）的培养基中培养。其中，正常条件的细胞培养是在含5％CO₂和20％O₂的湿润条件下37℃孵育。缺氧培养条件是在5％CO₂、1％O₂和94％N₂下37℃孵育。

其中，所述仿生纳米反应器AGZ@CM的合成步骤如下：

1）将GOx溶于去离子水，依次添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和L-半胱氨酸（Cys），搅拌。再将AQ4N加入到混合溶液中。最后，依次加入2-甲基咪唑（2-mIM）和乙酸锌溶液，并在室温下老化4 h，得到AGZ纳米颗粒；

2）将培养的靶向细胞提取细胞膜（CM），并与制备的AGZ纳米颗粒通过Avanti微型挤出机挤出仿生纳米反应器AGZ@CM。

其中，所述步骤1）中GOx的量为0.5~1 mg，聚乙烯吡咯烷酮的量为0.5~1 mg，L-半胱氨酸的量为0.1~0.5 mg，2-甲基咪唑的浓度为160 mmol L^-1，乙酸锌溶液的浓度为40mmol L^-1；AQ4N的量为0.2~1 mg。

其中，所述步骤1）中老化的反应时间为4 h，老化的反应温度为15-30℃。

其中，所述AGZ@CM溶液的浓度为5 µg mL^-1~50 µg mL^-1。

具体地，所述步骤1）中AGZ纳米颗粒的合成，步骤如下：将1 mg GOx溶于1 mL去离子水中，然后添加2 mg PVP（MW：8000）。搅拌30 s后，在搅拌下再引入1 mg Cys，再将AQ4N加入到混合溶液中。最后，分别加入2 mL mIM（160 mmol L^-1）和2 mL乙酸锌溶液（40 mmol L^-1），并在室温下老化4 h。离心，水洗，冷冻干燥得到AGZ纳米颗粒。

具体地，细胞膜（CM）包覆的纳米颗粒：首先，使用膜蛋白提取试剂盒获得癌细胞膜。简而言之，用细胞铲采集细胞并通过用PBS离心收集。此后，将收集的细胞分散在膜蛋白提取缓冲液和PMSF中。然后，将细胞分别在液氮和室温下快速冻融3次。将悬浮液在4℃下离心（700 g，10 min），并且将上清液在4℃下进一步离心（14000 g，30 min），弃上清液得到CM。其次，将细胞膜与纳米颗粒等体积混合，并超声处理30 s，使混合物均匀。随后使用Avanti微型挤出机（Avanti Polar Lipids）将混合物连续通过400 nm聚碳酸酯多孔膜挤出11次得到仿生纳米反应器AGZ@CM。通过离心弃去多余的细胞膜，并将最终的细胞膜包裹的纳米反应器溶于水中以备后用。

具体地，仿生纳米反应器AGZ@CM中GOx和AQ4N的协同作用通过GOx和AQ4N释放测试：在37℃搅拌下，将含1 mg mL^-1的仿生纳米反应器AGZ@CM分别分散在pH 5.0和pH 7.4PBS中。在预定的时间间隔，收集500 µL上清液，并用等体积的新鲜溶液代替。使用标准校准曲线，根据UV-vis吸收强度计算GOx释放的累积量，根据荧光光谱计算AQ4N释放的累积量。此外，通过pH计定期地测量pH值，使用便携式溶解氧计监测AGZ@CM（100 µg mL^-1）溶液中的溶解氧。

其中，GOx的UV-vi吸光度在280 nm处，前药AQ4N的荧光光谱参数Ex=633，Em=650。

其中，所述GOx活性的检测方法具体包括以下步骤：采用酶联反应法测定了AGZ@CM的催化活性。将AGZ@CM（100 μg mL^-1，50 μL），HRP（50 μg mL^-1，50 μL），TMB（2 mmol mL^-1，50μL）和葡萄糖（2 mg mL^-1，100 μL）依次加入96微孔板中。将反应在室温下孵育15 min。然后，将2 mol L^-1 H₂SO₄（50 μL）添加到每个孔中以终止反应。最后，通过Safire2酶标仪在450nm处记录吸光度值。

AGZ@CM在肿瘤微环境中能够引起pH下降，葡萄糖浓度减小，并且氧气浓度被快速消耗。

所述体外细胞实验包括以下方面：将细胞在适宜的条件下培养，仿生纳米反应器AGZ@CM对细胞的毒性试验，死活双染实验，凋亡实验，细胞摄取实验，缺氧/氧化应激检测，细胞靶向和内化实验。

体内实验包括以下方面：纳米药物AGZ@CM在小鼠体内的荧光成像，治疗之后肿瘤的体积和重量，以及小鼠的体重变化。

本发明利用仿生纳米药物AGZ@CM中GOx和AQ4N的级联反应，协同治疗肿瘤，具体为：仿生纳米药物AGZ@CM的ZIF-8被癌细胞内化后在酸性溶酶体中分解，将GOx和前药AQ4N释放，GOx将内源性葡萄糖氧化成葡萄糖酸，切断了肿瘤的能量供给，降低了肿瘤细胞内的pH，并消耗了O₂使得肿瘤内环境乏氧加剧，将无毒前药AQ4N激活成具有毒性的AQ4。AQ4对DNA具有强亲合力，会引起DNA损伤。此外，在GOx介导的酶催化过程中生成H₂O₂，引起肿瘤细胞的氧化性毒性，这些都有助于肿瘤细胞的死亡。体外细胞实验和体内实验证明，该方法能够有效抑制肿瘤的生长，毒副作用小。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点：本发明原理简单、纳米材料制备简单，周期短，容易获得。这种仿生同源细胞膜包裹纳米粒子具有同源识别和免疫逃逸的功能，通过增强的通透性和保留效应（EPR）将纳米颗粒定位在靶向肿瘤组织，而且包裹细胞膜之后可以防止负载的药物泄露。包裹的细胞膜被靶细胞内化后，暴露的ZIF-8在弱酸性的肿瘤细胞中裂解，释放GOx和AQ4N到细胞质中。GOx催化葡萄糖的过程中消耗氧气，是细胞内乏氧加剧。进而引发AQ4N激活成有毒的AQ4，发生级联反应，协同治疗肿瘤。本发明纳米药物制备方法简单，治疗效果显著，毒副作用小。

附图说明

图1显示了癌细胞膜仿生纳米反应器AGZ@CM在制备抗癌药物中的应用的流程图。

图2显示了癌细胞膜仿生纳米反应器AGZ@CM在制备抗癌药物中的应用的材料表征图；图2A和图2B分别为ZIF-8和GZ的扫描电镜图（SEM），图2C和图2D分别为AGZ和AGZ@CM的透射电镜图（TEM），图2E为ZIF-8，GOx，AZ，GZ和AGZ的傅里叶红外光谱图谱，图2F为ZIF-8，GOx，GZ，AGZ和AGZ@CM的表面电势。

图3为加入具有相同GOx浓度的AGZ或游离GOx后，缓存液中图3A的pH值，图3B的葡萄糖浓度（2 mg mL^-1）和图3C的O₂浓度的变化；图3D在不同条件下从AGZ累积释放小分子药物AQ4N。

图4中，在图4A的常氧条件和图4B的低氧条件下与不同浓度的纳米反应器孵育24h后，HepG2细胞的细胞活力（n=3，平均值±SD）；图4C用氧化应激/缺氧检测探针对HepG2细胞进行不同处理的CLSM图像；比例尺：20 µm。

图5中，图5A为在包括HepG2，Bel-7402和LO2细胞的不同细胞系中孵育4h后，CLSM观察AGZ@CM的细胞内化；（-CM）是用AGZ处理HepG2细胞的CLSM图像，（+CM）行是用AGZ@CM处理HepG2细胞的CLSM图像；比例尺：20 µm；图5B为用流式细胞仪对AGZ@CM处理后不同细胞中AQ4N的荧光定量分析；图5C为用PBS，ZIF-8@CM，AZ@CM，GZ@CM和AGZ@CM处理后的HepG2细胞的死活双染CLSM图；死细胞用PI染色为红色；活细胞用FDA染成绿色；比例尺：50μm；图5D为不同处理组孵育4 h后，基于膜联蛋白V-FITC和PI对HepG2细胞进行染色测定凋亡的流式细胞图。

图6中，图6A为静脉注射AGZ@CM后，带有HepG2肿瘤的小鼠在不同时间体内荧光图像；图6B为治疗结束后主要器官的离体荧光图像；图6C为治疗期间相对肿瘤体积的变化曲线；图6D为治疗后不同组的肿瘤照片；图6E为不同组中小鼠的平均肿瘤重量；图6F为治疗期间不同治疗组小鼠的体重变化。

具体实施方式

下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

本实验中用到的试剂和仪器：

葡萄糖氧化酶（GOx）和3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四氮唑（MTT）购自Sigma-Aldrich（中国上海）。2-甲基咪唑（2-mIM）购自Aladdin Biochemical TechnoloCo.，Ltd.（中国上海）。六水合乙酸锌和无水D-葡萄糖购自国药控股化学试剂有限公司（中国上海）。聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW：8000）购自Macklin Biochemical Co.，Ltd。Banoxantronedihydrochloride（AQ4N）购自Abcam（UK）。Hoechst33258，荧光素二乙酸酯（FDA）/碘化丙啶（PI）和膜联蛋白V-FITC/PI凋亡试剂均购自碧云天生物技术（China）。ROS-ID缺氧/氧化应激检测试剂盒由Enzo Life Science提供。所有其他化学试剂均为分析纯。

本发明实施例中的PBS缓冲溶液为：137 mmol L^-1 NaCl、10 mmol L^-1 NaH₂PO₄、2.7mmol L^-1 KCl、10 mmol L^-1 Na₂HPO₄，pH 5.0和pH 7.4。

本发明实施例中细胞实验的AGZ@CM是以纳米药物的溶液形式存在的，其浓度为5~50 μg mg^-1。

本发明实施例中的PB缓冲液为25 mmol L^-1 NaH₂PO₄和25 mmol L^-1 Na₂HPO₄，pH5.0和pH 7.4。

实施例1：ZIF-8 NPs的合成

将2-mIM（160 mmol L^-1，50 mL）和乙酸锌（40 mmol L^-1，50 mL）分别溶解在甲醇溶液中。在室温下搅拌下将乙酸锌加入2-mIM中。搅拌12 h后收集产物，并用甲醇洗涤3次。将沉淀物真空干燥过夜。

图2A显示合成的ZIF-8 NPs的SEM图像，从图2A中可以看出，ZIF-8表现出均匀的十二面体形态，平均直径为250 nm。表明成功合成ZIF-8 NPs。

实施例2：AZ，GZ和AGZ的合成

首先，将1 mg GOx溶于1 mL去离子水中，然后添加2 mg PVP（MW：8000）。搅拌30 s后，在搅拌下再引入1 mg Cys，再将AQ4N加入到混合溶液中。最后，分别加入2 mL mIM（160 mmolL^-1）和2 mL乙酸锌溶液（40 mmol L^-1），并在室温下老化4 h。离心，水洗，冷冻干燥得到AGZ纳米颗粒。相同方法合成AZ和GZ，除了未分别添加GOx和AQ4N。

如图2B的SEM和图2C的TEM所示，将GOx酶和前药AQ4N封装到ZIF-8纳米颗粒后，其形状和大小没有明显变化，表明该包装并未破坏ZIF-8的结构。

实施例3 ：CM包覆ZIF-8，AZ，GZ和AGZ纳米颗粒

首先，使用膜蛋白提取试剂盒获得人肝癌细胞（HepG2）膜。简而言之，用细胞铲采集细胞并通过用PBS离心收集。此后，将收集的细胞分散在膜蛋白提取缓冲液和PMSF中。然后，将细胞分别在液氮和室温下快速冻融3次。将悬浮液在4℃下离心（700 g，10 min），并且将上清液在4℃下进一步离心（14000 g，30 min）。其次，将HepG2细胞膜与纳米颗粒等体积混合，并超声处理30 s，使混合物均匀。随后使用Avanti微型挤出机（Avanti Polar Lipids）将混合物连续通过400 nm聚碳酸酯多孔膜挤出11次。通过离心弃去多余的细胞膜，并将最终的细胞膜包裹的纳米反应器溶于水中以备后用。

从图2D的TEM所示，AGZ@CM可以清楚地看到其表面有褶皱，说明CM已成功包裹在纳米颗粒上。

实施例4：GOx和AQ4N释放测试

在37℃搅拌下，将含1 mg mL^-1的AGZ纳米颗粒分别分散在pH 5.0和pH 7.4的PBS中。在预定的时间间隔，收集500 µL上清液，并用等体积的新鲜溶液代替。使用标准校准曲线，根据UV-vis吸收强度计算GOx和AQ4N释放的累积量。此外，通过pH计定期地测量pH值。另外，使用便携式溶解氧计监测AGZ（100 µg mL^-1）溶液中的溶解氧。基于上清液在280 nm处的UV-vis强度监测GOx，而基于上清液中的荧光强度监测前药AQ4N（Ex 633，Em 650）。采用双酶比色法测定了AGZ的催化活性。首先是AGZ（100 μg mL^-1，50 μL），HRP（50 μg mL^-1，50 μL），TMB（2 mmol mL^-1，50 μL）和葡萄糖（2 mg mL^-1，100 μL）将其依次加入96微孔板中。将反应在室温下孵育15 min。然后，将2 mol L^-1 H₂SO₄（50 μL）添加到每个孔中以终止反应。最后，通过Safire2酶标仪在450 nm处记录吸光度值。

如图3A所示，在葡萄糖氧化和药物释放过程中，检测pH的变化，来比较AGZ和游离GOx的活性。初始葡萄糖浓度为2 mg mL^-1时，pH值从7.4逐渐下降到3.1。因为葡萄糖被GOx连续氧化为葡萄糖酸，此过程导致pH下降并连续消耗葡萄糖（图3B），。同时，O₂被测量为在密封容器中迅速消耗掉（图3C）。AGZ和游离GOx的结果显示相似，表明GOx在AGZ中的活性得到了很好的保存。此外，由于pH下降，AQ4N随着ZIF-8的分裂而释放。如图3D所示，AGZ中的AQ4N在酸性环境中迅速释放，而在中性环境中缓慢释放。

实施例5：细胞活力测试

使用MTT测定法评估细胞活力。简言之，将HepG2细胞接种到96孔板中，密度为每孔5×10³。孵育24 h后，将细胞用各种浓度（5 µg mL^-1、10 µg mL^-1、20 µg mL^-1、35 µg mL^-1、50 µgmL^-1）的PBS，ZIF-8@CM，AZ@CM，GZ@CM和AGZ@CM处理，在常氧（20％氧气）或乏氧（1％氧气）条件下孵育。温育6 h，10 h，12 h，24 h，48 h和72 h后，除去培养基，并加入200 μL的MTT（0.5mg mL^-1）并再温育4 h。然后，放弃MTT溶液，并加入150 μL的DMSO。最后，使用酶标仪在490nm（OD490）处测量吸光度。计算相对细胞生存力为（OD490样品/OD490对照）×100％，所有实验一式三份进行。此外，可以用相同方法测量其他细胞的相对细胞生存力。

如图4A所示，在正常的氧气环境中，作为对照组的ZIF-8@CM对HepG2细胞的细胞毒性微不足道，证明ZIF-8与药物运输具有良好的生物相容性。肿瘤微环境中的缺氧导致AZ@CM中的前药AQ4N活化为细胞毒性AQ4，可作为肿瘤的化学疗法并降低细胞活力。GZ@CM处理的细胞活力明显低于对照组。如此高的毒性是通过消耗肿瘤中的葡萄糖使得肿瘤细胞饥饿，并产生了高浓度的H₂O₂，从而增强了肿瘤内部的氧化还原能力，从而具有强大的抗癌能力。与AGZ@CM一起孵育后观察到最高的细胞毒性，表明该策略饥饿疗法和化学疗法在体外抗肿瘤功效中起协同作用。在低氧条件下孵育后（图4B），细胞活力的趋势与正常氧条件相似，只是细胞活力比正常氧略有降低。事实证明，即使在缺氧条件下，GZ@CM的细胞活力也低于AZ@CM。可能是因为AQ4N不是一种高效的抗癌药物，不足以完全抑制癌细胞的存活。

实施例6：细胞内氧化应激/低氧检测

将HepG2细胞接种到6孔板中24 h。将细胞与ZIF-8@CM（50 µg mL^-1），游离GOx（6.15 µgmL^-1）和GZ@CM（GOx=6.15 µg mL^-1）孵育4 h，等体积的PBS作为对照。将缺氧/氧化应激检测混合物添加到细胞培养基中，并使用CLSM成像进行测量。（绿色：Ex/Em＝490/525 nm；红色：Ex/Em＝596/670 nm）。

如图4C的CLSM图像所示，在纯GOx组件中观察到绿色荧光（氧化应激探针），表明GOx介导的过氧化氢的产生导致了一定程度的细胞内氧化应激的增强。同时，与对照组和ZIF-8@CM组相比，红色荧光（缺氧探针）增强，说明细胞内环境处于缺氧状态。此外，用GZ@CM处理的细胞表现出最强的绿色和红色荧光，表明GOx可以在ZIF-8的协助下有效地在细胞内传递。主要原因是由于带负电的细胞膜的静电排斥作用（等电点=4.2），GOx本身不能被细胞很好地内在化。

实施例7：靶向识别和细胞内化

将HepG2，Bel-7402和LO2细胞分别以5×10⁵细胞的密度接种在玻璃底共聚焦培养皿中。温育24 h后，将细胞与AGZ @ CM（50 μg mL^-1）温育4 h。为了证实AGZ@CM通过CM受体介导的靶向识别内化，进行了竞争实验。HepG2细胞分别用AGZ @ CM和AGZ培养。温育4 h后，除去培养基，并用PBS洗涤细胞3次。最后，通过CLSM记录荧光图像。

如图5A所示，AQ4N优先在HepG2细胞中积累，而在LO2和Bel-7402细胞中表现出相对较弱的积累。而且AQ4N在未用HepG2细胞膜包裹的AGZ中积累也很少。这些结果表明表面抗原负责癌细胞靶向能力的同源粘附性质。类似地，流式细胞术提供的结果（图5B）再次证实了由于同源CM涂层效应而产生的免疫逃逸和同型靶向。

实施例8：活/死细胞染色测定

将HepG2细胞以每孔3×10⁵个细胞的密度接种到6孔板中，并在2 mL DMEM培养基中培养。第二天，分别用50 µg mL^-1 ZIF-8@CM，AZ@CM，GZ@CM和AGZ@CM处理细胞。此外，未处理的细胞用作对照。温育24 h后，除去培养基并用PBS洗涤。然后，所有细胞均通过FDA/PI染色，并在37℃下孵育10 min。最后，将细胞用PBS洗涤3次，并通过CLSM记录荧光图像（FDA：Ex /Em = 488/530 nm，PI：Ex / Em = 535/615 nm）。

图5C所示，与所有其他治疗方法相比，AGZ @ CM表现出最有效的癌细胞杀伤能力。说明协同作用效果最佳。

实施例9：凋亡测定

使用膜联蛋白V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（BD Biosciences）通过流式细胞术检查HepG2细胞的凋亡。将细胞以每孔3×10⁵个细胞的密度接种在六孔板中，并在2 mL的DMEM培养基中培养24 h。然后，将细胞与PBS，ZIF-8 @ CM，AZ @ CM，GZ @ CM和AGZ @ CM一起孵育。温育24 h后，将这些处理过的细胞用胰蛋白酶消化，以2000 rpm离心收集，按照说明用膜联蛋白V-FITC /PI细胞测定试剂盒（Invitrogen）染色。使用BD FACS Calibur流式细胞仪确定每个样品中的细胞凋亡和坏死。

如图5D所示，分别在Q1，Q2，Q3和Q4中记录了坏死细胞，晚期凋亡细胞，早期凋亡细胞和活细胞的比例。用AGZ @ CM处理后，观察到HepG2细胞的最低存活率和最高凋亡率，这与细胞存活率测定一致。此外，ZIF-8@CM的致死率可忽略不计，对周围细胞的毒副作用小。

实施例10：体内抗肿瘤试验

通过HepG2荷瘤小鼠模型进一步评估体内肿瘤蓄积的抗癌作用。体内实时荧光成像系统主要用于测量荷瘤小鼠静脉注射AGZ@CM后的生物分布。如图6A所示，在注射后6 h发现红色荧光在癌部位聚集，然后逐渐增加，在12 h达到峰值，这可能归因于纳米粒子的EPR效应。之后，荧光积累逐渐减弱。然而，它仍然保持了48 h以上，这可能是由于增强的免疫逃逸和仿生CM涂层所赋予的特异性靶向作用所致。在如此长的时间内，这种有效的保留将大大改善治疗效果。此外，收获的分离器官和肿瘤的成像结果（图6B）也证明AGZ@CM在肿瘤蓄积方面具有优先优势。为了评估体内治疗效果，将HepG2荷瘤小鼠随机分为5组，分别静脉注射PBS（对照），ZIF-8@CM，AZ@CM（前药治疗），GZ@CM（饥饿疗法），和AGZ@CM（协同疗法）。之后，每隔一天测量每组小鼠的肿瘤体积并持续21天。如图6C所示，PBS和ZIF-8@CM几乎不影响肿瘤生长，并且肿瘤快速生长。在治疗结束时AGZ@CM组的肿瘤大小比其他组小得多。分离每组小鼠的肿瘤拍照（图6D）和称重（图6E）。如预期的那样，通过协同治疗显着抑制了肿瘤的生长，而单一前药和饥饿疗法则表现出了中等的肿瘤生长抑制作用。此外，在治疗过程中，所有组的相对体重均略有上升（图6F），表明这些治疗剂的全身毒性可忽略不计。

上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。

Claims

1.癌细胞膜仿生纳米反应器AGZ@CM在制备抗癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述仿生纳米反应器AGZ@CM是以ZIF-8为纳米载体，负载GOx以及AQ4N后，在其表面包覆细胞膜，即可得到。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述GOx的负载率为50~150 μg mg^-1。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述AQ4N的负载率为20~50 μg mg^-1。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述纳米载体ZIF-8的pH为5.0~7.4。

6.根据权利要求1-5所述的应用，其特征在于，所述仿生纳米反应器AGZ@CM的合成步骤如下：

1）将GOx溶于去离子水，加入聚乙烯吡咯烷酮、L-半胱氨酸进行搅拌后，加入AQ4N进行搅拌，再加入2-甲基咪唑、乙酸锌溶液，并进行老化反应，得到AGZ纳米颗粒；

2）将培养的靶向细胞提取细胞膜，与步骤1）制备的AGZ纳米颗粒通过微型挤出机挤出，即可得到仿生纳米反应器AGZ@CM。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤1）中GOx的量为0.5~1 mg，聚乙烯吡咯烷酮的量为0.5~1 mg，L-半胱氨酸的量为0.1~0.5 mg，2-甲基咪唑的浓度为160 mmolL^-1，乙酸锌溶液的浓度为40 mmol L^-1；AQ4N的量为0.2~1 mg。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤1）中老化的反应时间为4 h，老化的反应温度为15-30℃。

9.根据权利要求6述的应用，其特征在于，所述仿生纳米反应器AGZ@CM的溶液浓度为5μg mL^-1~50 μg mL^-1。