CN115011590A - 利用磁珠法提取环境微生物细胞内外dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种利用磁珠法提取环境微生物细胞内外DNA的提取方法，包括：在固态样品内加入PBS缓冲液和蛋白酶K后水浴持续第一预设时间，震荡，离心；在混合溶液中添加PVPP崩解剂后震荡，离心，进行固液分离得到第一沉淀物和第一上清液；对第一上清液进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液；将第一滤膜剪碎与第一沉淀物进行混合得到混合物，通过磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒对混合物行进纯化获得胞内DNA；将第一滤液静置持续第二预设时间，在0～5℃环境下离心并弃上清后得到第二沉淀物；以及通过磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒对第二沉淀物进行纯化得到胞外DNA。
Description
技术领域
本公开涉及DNA提取技术领域，尤其是涉及一种适用于畜禽养殖和污水处理领域中的胞内外DNA的分离方法。
背景技术
抗生素耐药性的出现和传播给全球公众健康带来了极大的威胁，随着抗生素在医疗和畜禽养殖中的大量使用，越来越多的微生物出现了抗生素的耐药性，严重威胁了人类健康。抗生素抗性基因(ARGs)作为抗生素抗性的遗传工具，可以在微生物之间甚至是病原菌之间传播。抗性基因包括两种存在形式：存在于微生物细胞内的胞内抗性基因(iARGs)和裸露在环境中的胞外抗性基因(eARGs)。ARGs在环境中以细胞内DNA(iDNA)和细胞外DNA(eDNA)的形式存在。
目前关于胞内外ARGs的研究成为热点，因此从环境样品中分离纯化细胞内外DNA成为研究细胞内外ARGs的重要实验步骤。在很多研究中都有使用与提及。但是这些方法存在一些问题，例如：过程繁琐，所用沉淀核酸的有机溶剂具有挥发性毒性，对于较少的胞外DNA的获取具有杂质较多且不纯等缺陷，以及不能同时测定胞内、外DNA的缺陷。不能高效安全提取细胞中的iDNA和eDNA，从而限制了从基因水平研究ARGs的转归。
发明内容
为了解决上述技术问题，本公开提供了一种提取胞内外DNA的方法，该方法能够实现胞内外DNA的快速高效获取，并且通过预处理后的样品可分别进行胞内外DNA的提取，样品纯，杂质少，可直接用于下游实验。
根据本公开一个方面的实施例，提供一种利用磁珠法提取环境微生物细胞内外DNA的提取方法，包括：
在固态样品内加入PBS缓冲液和蛋白酶K后水浴持续第一预设时间，震荡，离心；
在混合溶液中添加PVPP崩解剂后震荡，离心，进行固液分离得到第一沉淀物和第一上清液；
对所述第一上清液进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液；
将所述第一滤膜剪碎与所述第一沉淀物进行混合得到混合物，通过磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒对所述混合物行进纯化获得胞内DNA；
将所述第一滤液静置持续第二预设时间，在0～5℃环境下离心并弃上清后得到第二沉淀物；以及
通过磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒对所述第二沉淀物进行纯化得到胞外DNA。
根据本公开的一些实施例，所述提取方法还包括：
对液态样品进行过滤得到第二滤膜和第二滤液；
将所述第二滤膜剪碎与所述第一沉淀物和剪碎的第一滤膜混合得到所述混合物；以及
将所述第二滤液与所述第一滤液混合后静置持续第二预设时间，离心并弃上清后得到所述第二沉淀物。
根据本公开的一些实施例，所述在固态样品内加入PBS缓冲液和蛋白酶K后水浴持续第一预设时间包括：
将固态样品与0.1mol/L的PBS缓冲液按照1：4混合，加入的蛋白酶K后在35～40℃的条件下水浴30～40min。
根据本公开的一些实施例，所述水浴过程中，每间隔10min进行摇匀重悬。
根据本公开的一些实施例，所述在混合溶液中添加PVPP崩解剂后震荡，离心，进行固液分离得到第一沉淀物和第一上清液包括：
在混合溶液中添加PVPP崩解剂后，在200～300rpm、20～30℃的条件下震荡10～15min，将混合溶液在0～5℃环境下离心25～30min得到第一沉淀物和第一上清液。
根据本公开的一些实施例，所述对所述第一上清液进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液包括：
对所述第一上清液采用0.22μm的滤膜进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液。
根据本公开的一些实施例，所述将所述第一滤液静置持续第二预设时间，在0～5℃环境下离心并弃上清后得到第二沉淀物包括：
在所述第一滤液中加入等体积的异丙醇和1/10体积的乙酸钠，在-25℃～-15℃的环境下静置8～12h，在0～5℃环境中离心25～30min后弃上清后得到第二沉淀物。
根据本公开的一些实施例，所述通过磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒对所述混合物行进纯化获得胞内DNA包括：
将所述混合物放入第一离心管中，在所述第一离心管中加入缓冲液SA、缓冲液SC和研磨珠后涡旋振荡混匀，离心，将离心后的上清液转移至第二离心管中；
在所述第二离心管内加入裂解液SH混合均匀，在0～5℃的环境下静置一段时间，离心并将上清液转移至第三离心管；
在第三离心管内添加缓冲液GFA后摇匀，加入磁珠悬浮液，震荡混匀；
将第三离心管放置在磁力架上静置一段时间，利用磁力架吸附磁珠，去除液体，添加蛋白液RD后混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体；
在第三离心管内加入漂洗液混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体；
在第三离心管内加入洗脱缓冲液后混匀，水浴一段时间，利用磁力架吸附磁珠，去除磁珠后得到包含有胞内DNA的溶液，保存。
根据本公开的一些实施例，所述通过磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒对所述第二沉淀物进行纯化得到胞外DNA包括：
将所述第二沉淀物放入第四离心管内，加入裂解液CFL、蛋白酶K和磁珠后混匀；
将所述第四离心管放置在磁力架上，利用磁力架吸附磁珠，去除液体；
在所述第四离心管内添加去蛋白液PD混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体；
在所述第四离心管内加入漂洗液RW后混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体，重复执行该操作预设次数后获得待洗脱磁珠，晾干；
在所述待洗脱磁珠内加入洗脱缓冲液TBC，利用移液器吹打重悬磁珠，利用磁力架吸附磁珠，去除磁珠后得到包含有胞外DNA的溶液，保存。
根据本公开的一些实施例，所述固态样品包括动物粪便和/或活性污泥，所述液态样品包括污水处理厂退水口水样。
根据本公开实施例的提取方法，通过对样品进行预处理后分离出固态的沉淀物用于提取胞内DNA，以及液态的滤液用于提取胞外DNA，能够实现胞内、外DNA的快速高效获取，样品纯，杂质少，可直接用于下游实验。
附图说明
图1示意性示出了本公开实施例的利用磁珠法提取环境微生物细胞内外DNA的提取方法的流程图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开作进一步的详细说明。
但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本公开的范围。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本公开实施例的全面理解。然而，明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。此外，在以下说明中，省略了对公知技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。
在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施例，而并非意在限制本公开。在此使用的术语“包括”表明了特征、步骤、操作的存在，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征。
在使用类似于“A、B和C等中至少一个”这样的表述的情况下，一般来说应该按照本领域技术人员通常理解该表述的含义来予以解释(例如，“具有A、B和C中至少一个的系统”应包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C、和/或具有A、B、C的系统等)。在使用类似于“A、B或C等中至少一个”这样的表述的情况下，一般来说应该按照本领域技术人员通常理解该表述的含义来予以解释(例如，“具有A、B或C中至少一个的系统”应包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C、和/或具有A、B、C的系统等)。
在此使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本领域技术人员通常所理解的含义，除非另外定义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。
图1示意性示出了本公开实施例的利用磁珠法提取环境微生物细胞内外DNA的提取方法的流程图。
为了解决上述技术问题，本公开提供了一种提取胞内外DNA的方法，该方法能够实现胞内外DNA的快速高效获取，并且通过预处理后的样品可分别进行胞内外DNA的提取，样品纯，杂质少，可直接用于下游实验。
根据本公开一个方面的实施例，提供一种利用磁珠法提取环境微生物细胞内外DNA的提取方法，如图1所示，包括操作S1～操作S7。
根据本公开的一些实施例，操作S1包括：在固态样品内加入PBS缓冲液(主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KC)和蛋白酶K(proteinase K)后水浴持续第一预设时间，震荡，离心。
根据本公开的一些实施例，操作S2包括：在混合溶液中添加PVPP(polyvinylpolypyrrolidone)崩解剂后震荡，离心，进行固液分离得到第一沉淀物和第一上清液。其中，PVPP崩解剂又称交联聚乙烯吡咯烷酮，是一种有机溶剂的交联聚合物，具有较好的溶胀和崩解作用。在本实施例中主要用于促使固态样品结构膨胀从而崩解释放内部物质。
根据本公开的一些实施例，操作S3包括：对第一上清液进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液。
根据本公开的一些实施例，操作S4包括：将第一滤膜剪碎与第一沉淀物进行混合得到混合物，通过磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒对混合物行进纯化获得胞内DNA。
根据本公开的一些实施例，操作S5包括：将第一滤液静置持续第二预设时间，在0～5℃环境下离心并弃上清后得到第二沉淀物。
根据本公开的一些实施例，操作S6包括：通过磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒对第二沉淀物进行纯化得到胞外DNA。
根据本公开另一个方面的实施例，提取方法还包括对两种样品进行处理，具体的，包括对物体样品和液体样品进行预处理，将两类样品进行预处理后再进行胞内、外DNA的提取。
在本实施例中，提取方法包括：对液态样品进行过滤得到第二滤膜和第二滤液；将第二滤膜剪碎与第一沉淀物和剪碎的第一滤膜混合得到混合物；以及将第二滤液与第一滤液混合后静置持续第二预设时间，离心并弃上清后得到第二沉淀物。
根据本公开的一些实施例，固态样品包括动物粪便和/或活性污泥，液态样品包括污水处理厂退水口水样。可选的，可以选择猪粪或畜禽粪便。
根据本公开的一些实施例，在固态样品内加入PBS缓冲液和蛋白酶K后水浴持续第一预设时间包括：将固态样品与0.1mol/L的PBS缓冲液按照1：4混合，加入的蛋白酶K后在35～40℃的条件下水浴30～40min。
根据本公开的一些实施例，水浴过程中，每间隔10min进行摇匀重悬。
根据本公开的一些实施例，在混合溶液中添加PVPP崩解剂后震荡，离心，进行固液分离得到第一沉淀物和第一上清液包括：在混合溶液中添加PVPP崩解剂后，在200～300rpm、20～30℃的条件下震荡10～15min，将混合溶液在0～5℃环境下离心25～30min得到第一沉淀物和第一上清液。
根据本公开的一些实施例，对第一上清液进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液包括：对第一上清液采用0.22μm的滤膜进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液。
根据本公开的一些实施例，将第一滤液静置持续第二预设时间，在0～5℃环境下离心并弃上清后得到第二沉淀物包括：在第一滤液中加入等体积的异丙醇和1/10体积的乙酸钠，在-25℃～-15℃的环境下静置8～12h，在0～5℃环境中离心25～30min后弃上清后得到第二沉淀物。
根据本公开的一些实施例，通过磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒对混合物行进纯化获得胞内DNA包括子操作S41～子操作S46。
根据本公开的一些实施例，子操作S41包括：将混合物放入第一离心管中，在第一离心管中加入缓冲液SA、缓冲液SC和研磨珠后涡旋振荡混匀，离心，将离心后的上清液转移至第二离心管中。其中，缓冲液SA为一种稀释缓冲液，5倍SA母液配方包括：巴比妥酸2.3g、氯化镁(MgCl2·6H2O)0.5g、氯化钙(CaCl2·2H2O)1.0g、氯化钠(NaCl)41.9g、碳酸氢钠(NaHCO3)1.26g、巴比妥钠1.5g按顺序依次在双蒸水中加热溶解，冷却后，双蒸水定容至1000mL，4℃备用，5倍稀释后使用；缓冲液SC为盐洗膜，主要成分为氯化钠。
根据本公开的一些实施例，子操作S42包括：在第二离心管内加入裂解液SH混合均匀，在0～5℃的环境下静置一段时间，离心并将上清液转移至第三离心管。其中，裂解液SH(SDS Lysis Buffer)是一种比较强烈的细胞组织裂解液，主要成分为50mM Tris(pH8.1)，1％SDS，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多种抑制剂。
根据本公开的一些实施例，子操作S43包括：在第三离心管内添加缓冲液GFA后摇匀，加入磁珠悬浮液，震荡混匀。其中，缓冲液GFA是主要成分为葡萄糖、EDTA和Tris-HCI和异丙醇，在本实施例中是为了悬浮细胞。
根据本公开的一些实施例，子操作S44包括：将第三离心管放置在磁力架上静置一段时间，利用磁力架吸附磁珠，去除液体，添加蛋白液RD后混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体。其中，蛋白液RD的主要成分为Hac-Kac缓冲对和无水乙醇，在本实施例中是为了沉淀蛋白质。
根据本公开的一些实施例，子操作S45包括：在第三离心管内加入漂洗液PWD混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体。其中，漂洗液PWD的主要成分为无水乙醇，在本实施例中是为了洗去小分子蛋白质和无机离子等成分。
根据本公开的一些实施例，子操作S46包括：在第三离心管内加入洗脱缓冲液后混匀，水浴一段时间，利用磁力架吸附磁珠，去除磁珠后得到包含有胞内DNA的溶液，保存。
根据本公开的一些实施例，通过磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒对第二沉淀物进行纯化得到胞外DNA包括子操作S61～S65。
根据本公开的一些实施例，子操作S61包括：将第二沉淀物放入第四离心管内，加入裂解液CFL、蛋白酶K和磁珠悬浮液后混匀。其中，裂解液CFL的主要成分是DS，NP-40，TritonX-100，在本实施例中是为了裂解细胞组织。
根据本公开的一些实施例，子操作S62包括：将第四离心管放置在磁力架上，利用磁力架吸附磁珠，去除液体。
根据本公开的一些实施例，子操作S63包括：在第四离心管内添加去蛋白液PD混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体。其中，蛋白液PD的主要成分为Hac-Kac缓冲对和无水乙醇，在本实施例中是为了沉淀蛋白质。
根据本公开的一些实施例，子操作S64包括：在第四离心管内加入漂洗液RW后混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体，重复执行该操作预设次数后获得待洗脱磁珠，晾干。
根据本公开的一些实施例，子操作S65包括：在待洗脱磁珠内加入洗脱缓冲液TBC，利用移液器吹打重悬磁珠，利用磁力架吸附磁珠，去除磁珠后得到包含有胞外DNA的溶液，保存。其中，洗脱缓冲液TBC的要成分为超纯水和Tris-HCI。
根据本公开实施例的提取方法，通过对样品进行预处理后分离出固态的沉淀物用于提取胞内DNA，以及液态的滤液用于提取胞外DNA，能够实现胞内外DNA的快速高效获取，样品纯，杂质少，可直接用于下游实验。
根据本公开实施例的提取方法，磁力架为拼插式磁力架，多组产品的拼接可一次性处理16个，24个和32个1.5mL离心管。可选的，磁力架采用“超钢”POM材质，轻巧耐磨。
下面结合具体实施例对本公开的技术方案进行进一步描述，应当理解的是，该具体实施例仅是为了更好的理解本公开的技术方案，而不应当作为对本公开的保护范围的限定。
样品的预处理：
1.1分别取1mL猪粪和活性污泥，在猪粪和活性污泥混合物中添加0.1M的PBS缓冲液，以及加入20μL proteinase K(蛋白酶K)，在37℃的条件下水浴30min，水浴期间每10min进行摇匀重悬，水浴完成后进行离心，震荡处理；
1.2在混合液中加入0.2g PVPP(polyvinyl polypyrrolidone)，然后在250rpm、25℃的条件下震荡10min，随后将混合液在4℃条件下，离心25min，离心后进行固液分离获得第一沉淀物和第一上清液；
1.3对于退水口的样品，取200mL水样，采用直径为50mm，孔径0.2nm的纤维膜进行过滤，获得第二滤膜和第二滤液；
1.4采用0.22μm滤膜对第一上清液进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液，将第一滤膜、第二滤膜剪碎和第一沉淀物混合得到用于提取胞内DNA的混合物，将第一滤液和第二滤液混合后加入等体积的异丙醇和1/10体积3M的乙酸钠，在-20℃放置8～12h，离心去上清后得到用于提取胞外DNA的沉淀物。
胞内DNA的提取：
2.1取0.5g的混合物放入2mL离心管中，加入缓冲液SA，SC和研磨珠，涡旋振荡混匀，离心后将上清液转移至新的2mL离心管中；
2.2加入裂解液SH混匀后，在4℃环境中放置10min，离心后将上清液转移至新的离心管，加入缓冲液GFA后，进行颠倒混匀，再加入磁珠悬浮液后震荡混匀；
2.3将离心管放置在拼插式磁力架上静置30s，磁珠完全吸附后，吸取液体，然后将离心管从拼插式磁力架上取下，加入蛋白液RD，震荡混匀5min，置于拼插式磁力架上静置30s，吸去液体；
2.4将离心管从拼插式磁力架上取下，加入漂洗液PWD，振荡混匀3min，置于拼插式磁力架上静置30s，磁珠完全吸附后，吸去液体；
2.5重复执行2.4步骤，将离心管置于拼插式磁力架上，室温晾干5-10min；
2.6将离心管从拼插式磁力架上取下，加入洗脱缓冲液TB，振荡混匀，置于56℃，水浴5min，期间进行震荡混匀3回，每回3-5次；将离心管放置于拼插式磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移至一个新离心管中，并于合适条件保存。
胞外DNA提取
3.1将400μL的样品放入2mL的离心管中，加入600μL的裂解液CFL和40μL的蛋白酶K，再加入30μL的磁珠悬浮液。涡旋振荡混匀后室温水浴20min，期间每3-5min上下颠倒混匀10s，使磁珠和核酸充分结合，水浴结束后短暂离心，以避免管盖和内壁上附着液滴；
3.2将离心管置于拼插式磁力架上2min，待磁珠完全吸附后，去除液体，取下离心管；加入750μL去蛋白液PD，上下颠倒混匀30s，使磁珠充分悬浮，短暂离心，避免管盖和内壁上附着液滴；将离心管置于拼插式磁力架上1min，待磁珠完全吸附后，去除液体，取下离心管；
3.3加入750μL漂洗液RW，上下颠倒混匀30s，使磁珠充分悬浮，短暂离心，避免管盖和内壁上附着液滴；将离心管置于拼插式磁力架上1min，待磁珠完全吸附后，去除液体，取下离心管；
3.4重复步骤3.3后，将离心管置于拼插式磁力架上，吸出所有液体并弃去，室温晾干5-10min；
3.5加入30-65μL洗脱缓冲液TBC，用移液器吹打重悬磁珠，在56℃条件下水浴5min，水浴期间每隔2min轻轻晃动，使核酸被充分洗脱；将离心管放置于拼插式磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附后，将核酸溶液转移至新的离心管中，并于合适条件保存。
根据本公开另一个方面的实施例，可以采用多种固态样品，例如猪粪、鸡粪和活性污泥，然后分别对三种固态样品进行预处理分别得到三种第一沉淀物、第一滤膜和第二滤膜，将每种第一沉淀物、第一滤膜和第二滤膜进行混合分别提取胞内DNA。
根据本公开的实施例，胞内、外DNA的提取能够一次性提取完成，提取过程比较安全，能够集中在相对较短的时间内完成环境微生物胞内外DNA的分离纯化过程。采用拼插式磁力架，能够一次性处理16个，24个和32个1.5mL离心管，且磁场强度高，平均磁分离时间为10s，分离过程快速高效。整个过程安全、便捷、提取的游离DNA的率高，纯度高，质量稳定可靠，适合后续的下游实验。
至此，已经结合附图对本公开实施例进行了详细描述。需要说明的是，在附图或说明书正文中，未绘示或描述的实现方式，均为所属技术领域中普通技术人员所知的形式，并未进行详细说明。此外，上述对各零部件的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换。
还需要说明的是，在本公开的具体实施例中，除非有所知名为相反之意，本说明书及所附权利要求中的数值参数是近似值，能够根据通过本公开的内容所得的所需特性改变。具体而言，所有使用于说明书及权利要求中表示组成的尺寸、范围条件等等的数字，应理解为在所有情况中是受到“约”的用语所修饰。一般情况下，其表达的含义是指包含由特定数量在一些实施例中±10％的变化、在一些实施例中±5％的变化、在一些实施例中±1％的变化、在一些实施例中±0.5％的变化。
本领域技术人员可以理解，本公开的各个实施例和/或权利要求中记载的特征可以进行多种组合或/或结合，即使这样的组合或结合没有明确记载于本公开中。特别地，在不脱离本公开精神和教导的情况下，本公开的各个实施例和/或权利要求中记载的特征可以进行多种组合和/或结合。所有这些组合和/或结合均落入本公开的范围。
以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种利用磁珠法提取环境微生物细胞内外DNA的提取方法，其特征在于，包括：
在固态样品内加入PBS缓冲液和蛋白酶K后水浴持续第一预设时间，震荡，离心；
在混合溶液中添加PVPP崩解剂后震荡，离心，进行固液分离得到第一沉淀物和第一上清液；
对所述第一上清液进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液；
将所述第一滤膜剪碎与所述第一沉淀物进行混合得到混合物，通过磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒对所述混合物行进纯化获得胞内DNA；
将所述第一滤液静置持续第二预设时间，在0～5℃环境下离心并弃上清后得到第二沉淀物；以及
通过磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒对所述第二沉淀物进行纯化得到胞外DNA。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，还包括：
对液态样品进行过滤得到第二滤膜和第二滤液；
将所述第二滤膜剪碎与所述第一沉淀物和剪碎的第一滤膜混合得到所述混合物；以及
将所述第二滤液与所述第一滤液混合后静置持续第二预设时间，离心并弃上清后得到所述第二沉淀物。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述在固态样品内加入PBS缓冲液和蛋白酶K后水浴持续第一预设时间包括：
将固态样品与0.1mol/L的PBS缓冲液按照1：4混合，加入的蛋白酶K后在35～40℃的条件下水浴30～40min。
4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述水浴过程中，每间隔10min进行摇匀重悬。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述在混合溶液中添加PVPP崩解剂后震荡，离心，进行固液分离得到第一沉淀物和第一上清液包括：
在混合溶液中添加PVPP崩解剂后，在200～300rpm、20～30℃的条件下震荡10～15min，将混合溶液在0～5℃环境下离心25～30min得到第一沉淀物和第一上清液。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述对所述第一上清液进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液包括：
对所述第一上清液采用0.22μm的滤膜进行真空抽滤获得第一滤膜和第一滤液。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述将所述第一滤液静置持续第二预设时间，在0～5℃环境下离心并弃上清后得到第二沉淀物包括：
在所述第一滤液中加入等体积的异丙醇和1/10体积的乙酸钠，在-25℃～-15℃的环境下静置8～12h，在0～5℃环境中离心25～30min后弃上清后得到第二沉淀物。
8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述通过磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒对所述混合物行进纯化获得胞内DNA包括：
将所述混合物放入第一离心管中，在所述第一离心管中加入缓冲液SA、缓冲液SC和研磨珠后涡旋振荡混匀，离心，将离心后的上清液转移至第二离心管中；
在所述第二离心管内加入裂解液SH混合均匀，在0～5℃的环境下静置一段时间，离心并将上清液转移至第三离心管；
在第三离心管内添加缓冲液GFA后摇匀，加入磁珠悬浮液，震荡混匀；
将第三离心管放置在磁力架上静置一段时间，利用磁力架吸附磁珠，去除液体，添加蛋白液RD后混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体；
在第三离心管内加入漂洗液混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体；
在第三离心管内加入洗脱缓冲液后混匀，水浴一段时间，利用磁力架吸附磁珠，去除磁珠后得到包含有胞内DNA的溶液，保存。
9.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述通过磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒对所述第二沉淀物进行纯化得到胞外DNA包括：
将所述第二沉淀物放入第四离心管内，加入裂解液CFL、蛋白酶K和磁珠悬浮液后混匀；
将所述第四离心管放置在磁力架上，利用磁力架吸附磁珠，去除液体；
在所述第四离心管内添加去蛋白液PD混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体；
在所述第四离心管内加入漂洗液RW后混匀，利用磁力架吸附磁珠，去除液体，重复执行该操作预设次数后获得待洗脱磁珠，晾干；
在所述待洗脱磁珠内加入洗脱缓冲液TBC，利用移液器吹打重悬磁珠，利用磁力架吸附磁珠，去除磁珠后得到包含有胞外DNA的溶液，保存。
10.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述固态样品包括动物粪便和/或活性污泥，所述液态样品包括污水处理厂退水口水样。
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