JPH03213102A - 物質分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は物質分離方法に係り、特に、抽出、分離の困難
な物質を分離する際の方法として好適な物質分離方法に
関する。

［従来の技術］ 近年、バイオテクノロジーの発達により、大腸菌や酵母
等の微生物菌体、あるいは培養細胞（本明細書では、適
当な培地により人為的に培養された、多細胞生物由来の
単細胞またはその集合体を総称して、培養細胞という）
に、人体に有用な物質（以下、有用物質という）、例え
ばコリスチン、プロナーゼ、カスガマイシン等の抗生物
質や、酵素、ビタミン、ホルモン等を生合成させること
が盛んに行なわれている。微生物菌体や培養細胞（以下
、生細胞という）を所定期間培養することにより、生細
胞に有用物質を生合成させた場合、有用物質は、生細胞
を培養するための培地あるいは生細胞内に蓄積される。

このような有用物質のうち、培地内に蓄積された有用物
質を単離精製するにあたっては、まず、生細胞を所定期
間培養した後の培養物（本明細書では、所定期間培養後
の生細胞、生細胞の代謝生産物、培地原料を総称して培
養物という）中から、有用物質を分離する操作が行なわ
れる。この分離操作は、培養物中に含まれる生細胞およ
び死細胞、培地原料等の固型分を除去して、有用物質を
含む清澄液を得るという形で一般に行なわれ、このとき
の操作の一法として、濾過法が広く用いられている。

濾過により清澄液を得るにあたっては、培養物をそのま
ま濾過する場合の他、濾材の目詰まりを抑制する目的で
、培養物中に沈澱物として含まれる培地原料、細胞断片
、微小浮遊物等をアルギン酸等により凝集させてから濾
過する場合もある。

また、生細胞の複数個をアルギン酸カルシウム等で包括
固定化して培養することにより、培養物中からの生細胞
（この場合は、包括固定化物）の濾過による分離除去を
簡易化する方法もある。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、培養物をそのまま濾過することにより有
用物質を含む清澄液を得る場合、培養物中に含まれる固
型分により濾材に目詰まりが生じ易い。また、培養物に
アルギン酸等を添加して培養物中の沈澱物を凝集させて
から濾過した場合でも、凝集した沈澱物は濾材表面に集
まるため、濾材の目詰まりは充分には抑制されない。

このため、有用物質を含む清澄液を得るにはかなりの労
力、設備が必要であり、複雑な濾過工程をとらなければ
ならないという問題があり、かつ得られる清澄液には、
有用物質以外に濾材を通過した浮遊物等の不要物が比較
的多量に含まれるという問題があった。特に、濃厚液体
培地を用いて生細胞に有用物質を生合成させた場合には
、培養物が油状あるいは泥漿状になるため、上述の問題
が顕著であった。

また、前述の生細胞を包括固定化する方法は、バイオリ
アクターにおいて広く利用されているが、この方法の場
合、培地（有用物質の原料）としては、アルギン酸カル
シウムのような固定化材の格子を通り抜けられるよう水
溶性物質を用いらなければならず、また有用物質はバイ
オリアクター外にスムーズに排出されなければならない
ため、技術的に限定された分野でのみしか適用できない
という問題があった。

したがって本発明の目的は、固型分を含む複数成分から
なる液状、・油状または泥漿状の物質から、特定物質を
溶液の形で容易にかつ高純度に分離することができる物
質分離方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、上記目的を達成するためになされたものであ
り、本発明の物質分離方法は、固型分を含む複数成分か
らなる液状、油状または泥漿状の物質をゲル化してゲル
体を得る工程と、前記ゲル体を水、有機溶剤、または水
と有機溶剤の混合液からなる溶剤と接触させることによ
り抽出処理して、前記物質を構成する成分の少なくとも
１種が溶解した溶液を得る工程と、抽出処理後のゲル体
を除去して、前記物質を構成する成分の少なくとも１種
を溶液の形で分離する工程とを含むことを特徴とするも
のである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の物質分離方法においては、上述したように、ま
ず、固型分を含む複数成分からなる液状、油状または泥
漿状の物質をゲル化してゲル体を得る工程を行う。

このとき用いる、固型分を含む複数成分からなる液状、
油状または泥漿状の物質は特に限定されるものではなく
、例えば以下のものを挙げることができる。

■　有用物質を産生ずる生細胞を所定期間培養した後の
培養物。

■　有用物質を産生ずる生細胞を所定期間培養した後の
培養物に、加熱処理、酸・アルカリ処理、酵素処理、ホ
モジナイズ処理等を施して、生細胞に変性あるいは細胞
崩壊を生じさせて得た処理物。

なお、これら■および■の培地は、液体培地、固形培地
、半固形培地のいずれでもよい。

これら固型分を含む複数成分からなる液状、油状または
泥漿状の物質（以下、被ゲル化物という）のゲル化は、
必要に応じてこれらの被ゲル化物に水、有機溶媒、水と
有機溶媒との混合物等を添加して流動性を高めた後、ア
ルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、カラギーナ
ン、アガロース等のゲル化物質と、塩化カルシウム等の
ゲル化イオン含有物質とを用いて行うことができる。ま
た、アクリルアミド、光架橋性樹脂プレポリマー、ウレ
タン・プレポリマー等を用いてもゲル化させることがで
きる。ゲル化方法は特に限定されるものではなく、ゲル
化させるために用いる物質の種類に応じて、包括法によ
る細胞の固定化と同様にして行うことができる。またゲ
ル体の表面積は、抽出処理を円滑に行ううえからできる
だけ大きいことが好ましく、大小様々な大きさのビーズ
状ゲル体や種々の太さの紐状ゲル体とすることが望まし
い。

例えば、ゲル化物質としてアルギン酸ナトリウムを用い
、ゲル化イオン含有物質として塩化カルシウムを用いて
ゲル化させる場合は、被ゲル化物にアルギン酸ナトリウ
ムを添加し、充分に撹拌した後、得られた混合物を塩化
カルシウム水溶液中に滴下することにより、ビーズ状の
ゲル体を得ることができる。また、被ゲル化物にアルギ
ン酸ナトリウムを添加し充分に撹拌して得られた混合物
を、塩化カルシウム水溶液中で紡糸することにより、紐
状のゲル体を得ることができる。

ゲル体の大きさや太さは、濾過の際に用いる濾材の目の
大きさ、作業性等に応じて適宜選択可能である。

本発明の物質分離方法においては、上述のようにしてゲ
ル体を得た後、このゲル体を水、有機溶剤、または水と
有機溶剤の混合液からなる溶剤と接触させることにより
抽出処理して、被ゲル化物を構成する成分の少なくとも
１種が溶解した溶液を得る工程を行う。

溶剤としては、上述のように水、有機溶剤、または水と
有機溶剤の混合液からなる溶剤を用い、有機溶剤として
は、例えばアセトン、ヘキサン、メチルアルコール、エ
チルアルコール、酢酸ブチル等を挙げることができる。

このとき用いる溶剤の種類は、分離しようとする物質の
性状に応じて適宜選択される。なお、本発明において溶
剤として用いる水は、塩化カルシウム等のゲル化イオン
含有物質の水溶液も含むものとする。

ゲル体と溶剤どの接触は、ゲル体と溶剤とを撹拌、振盪
、向流通水すること等により行うことができ、この接触
により、被ゲル化物中に含まれていた目的物質がゲル体
中から溶剤中に拡散移動して、被ゲル化物を構成する成
分の少なくとも１種（目的物質）が溶解した溶液が得ら
れる。なお、この溶液は回分方式、連続方式のいずれに
よっても得ることができる。

被ゲル化物を構成する成分の少な（とも１種が溶解した
溶液を得る工程は、後述する、ゲル体を除去して被ゲル
化物を構成する成分の少なくとも１種を溶液の形で分離
する工程と組み合わせて、必要に応じ複数回繰り返して
もよい。複数回行う場合、用いる溶剤の種類は同一であ
っても、また異なっていてもよい。

本発明の物質分離方法においては、上記溶液を得る工程
の後に、この溶液中に含まれるゲル体を除去して、被ゲ
ル化物を構成する成分の少なくとも１種（目的物質）を
溶液の形で分離する工程を行う。

この工程は、ゲル体と前記溶液との混合物に、金網や布
等を濾材とする濾過、遠心分離、デカント等の操作を施
すことにより行うことができる。

以上説明した３つの工程を含む本発明の物質分離方法で
は、目的物質を拡散によりゲル体中から溶剤中に移動さ
せることにより、目的物質以外の物質の多くをゲル体中
に残存させた状態で目的物質が溶解した溶液を得ること
ができ、このとき用いたゲル体は濾過等により容易に除
去することができるため、目的物質を溶液の形で高純度
に、かつ容易に分離することができる。

［実施例］ 以下、本発明の実施例について説明する。

実施例 被ゲル化物として、コリスチン生産菌を所定期間培養し
た後の培養物（以下、コリスチンＦＢという）を用い、
ゲル化物質としてアルギン酸ナトリウムを用い、ゲル化
イオン含有物質として塩化カルシウムを用いて、以下の
要領でコリスチンを溶液の形で分離した。なお、コリス
チンＦＢは泥漿状の物質であり、・このコリスチンＦＢ
には、固型分としてコリスチン産生菌、培地残渣等が含
まれている。

まず、コリスチンＦＢに０．５％の濃度となるようにア
ルギン酸ナトリウム水溶液を加え、充分に撹拌し、その
１００ｃｃを同容量の１％塩化カルシウム水溶液中に滴
下して、１％塩化カルシウム水溶液中にビーズ状のゲル
体を形成させた。

次いで、ビーズ状のゲル体を含んだままの１％塩化カル
シウム水溶液を１時間撹拌することにより、ゲル体と１
％塩化カルシウム水溶液とを充分に接触させて、ゲル体
中に含まれるコリスチンを拡散により１％塩化カルシウ
ム水溶液中に移動させた。

この後、コリスチンが移動した１％塩化カルシウム水溶
液中に含まれるゲル体を、金網を濾材とする濾過により
除去して、１％塩化カルシウム水溶液を溶媒とする溶液
の形でコリスチンを分離した。なお、得られた溶液（以
下、分離液という）の量は１４０ｃｃであった。

さらに、除去したゲル体に溶剤として１００ｃｃの水を
加えて１時間撹拌することにより、ゲル体中に含まれる
コリスチンを拡散により水中に移動させた後、ゲル体を
金網を濾材とする濾過により除去して、水を溶媒とする
コリスチンの分離液を得た。この、水を溶剤とするコリ
スチンの分離操作を、計４回繰り返した。

このようにして得られたコリスチンの各分離液中には、
肉眼的にはほとんど異物が認められず、透明であった。

また、各分離液中のコリスチンの力価を生物検定法によ
り求め、これらの力価の合計とコリスチン産生菌のコリ
スチンの力価とを比較することにより、コリスチンの収
率を求めたところ、表−１に示す結果が得られた。

（以下余白） 表−１ ＊１：単位量とは、分離液ｌｅｅを意味する。

＊２：コリスチンＦＢの量を示す。

表−１から明らかなように、本実施例におけるコリスチ
ンの収率は９７．３％と高く、他の方法と比較しても遜
色のない良好なものであった。

なお、被ゲル化物としてプロナーゼ生産菌を所定期間培
養した後の培養物や、カスガマイシン生産菌を所定期間
培養した後の培養物を用いても、略同様の結果が得られ
た。

［発明の効果］ 以上説明したように、本発明の物質分離方法によれば、
目的物質を拡散によりゲル体中から溶剤中に移動させる
ことにより、目的物質以外の物質の多くをゲル体中に残
存させた状態で目的物質が溶解した溶液を得ることがで
き、目的物質が抽出された後のゲル体は濾過等により容
易に除去することができるため、目的物質を溶液の形で
高純度に、かつ容易に分離することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）固型分を含む複数成分からなる液状、油状または
   泥漿状の物質をゲル化してゲル体を得る工程と、 前記ゲル体を水、有機溶剤、または水と有機溶剤の混合
   液からなる溶剤と接触させることにより抽出処理して、
   前記物質を構成する成分の少なくとも１種が溶解した溶
   液を得る工程と、抽出処理後のゲル体を除去して、前記
   物質を構成する成分の少なくとも１種を溶液の形で分離
   する工程と を含むことを特徴とする物質分離方法。