CN115010733B - 香豆素修饰苯硼酸衍生物及其制备方法、姜黄素动态共价复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

香豆素修饰苯硼酸衍生物及其制备方法、姜黄素动态共价复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于有机合成技术领域，具体涉及香豆素修饰苯硼酸衍生物及其制备方法、姜黄素动态共价复合物及其制备方法和应用。本发明提供一种香豆素修饰苯硼酸衍生物，具有式I所示结构。本发明提供的香豆素修饰苯硼酸衍生物，将4‑羧基苯硼酸以三(2‑氨乙基)胺为连接臂和两个香豆素羧酸衍生物连接成香豆素修饰苯硼酸衍生物，其结构中的硼羟基能够与姜黄素中的烯醇结构形成稳定的动态共价复合物，从而稳定姜黄素的烯醇结构，提高姜黄素的稳定性；同时，本发明提供的香豆素修饰苯硼酸衍生物中的香豆素结构能够与姜黄素协同增强对肿瘤细胞生长的抑制作用。

Description

香豆素修饰苯硼酸衍生物及其制备方法、姜黄素动态共价复 合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于有机合成技术领域，具体涉及香豆素修饰苯硼酸衍生物及其制备方法、姜黄素动态共价复合物及其制备方法和应用。
背景技术
姜黄素(英文名Curcumin，结构式如图1所示)是由两个邻甲基化的酚以及一个β-二酮组成，其中β-二酮结构具有烯醇-酮互变异构。姜黄色素是从姜黄根茎中提取的一种黄色色素，主要成分为姜黄素，约为姜黄的3～6％，是植物界很稀少的具有二酮的色素，为二酮类化合物。姜黄素为橙黄色结晶粉末，味稍苦。姜黄素的药理作用包括抗炎、抗氧化、清除自由基、抗菌、抗病毒、抗肿瘤和护肝作用等。
但是姜黄素在中性到碱性环境下不稳定等特点，限制了其在临床上的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了香豆素修饰苯硼酸衍生物及其制备方法、姜黄素动态共价复合物及其制备方法和应用。本发明提供的香豆素修饰苯硼酸衍生物中的硼羟基不仅能够与姜黄素中的烯醇结构形成稳定的动态共价复合物，提高姜黄素的稳定性，同时能够与姜黄素协同增强对肿瘤细胞生长的抑制作用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种香豆素修饰苯硼酸衍生物，具有式I所示结构：
本发明提供上述技术方案所述的香豆素修饰苯硼酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：
将7-(羧甲氧基)香豆素、2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯、偶联剂、有机碱和有机溶剂混合发生缩合反应，得到式I-1所示结构的中间体1；
将所述中间体1和三氟乙酸混合进行氨基脱保护，得到式I-2所示结构的中间体2；
将所述中间体2、4-羧基苯硼酸、偶联剂、缩合剂和有机溶剂混合发生缩合反应，得到式I所示结构的香豆素修饰苯硼酸衍生物。
优选的，所述7-(羧甲氧基)香豆素的制备方法包括以下步骤：
将7-羟基香豆素、卤代乙酸、催化剂、缚酸剂和有机溶剂混合发生醚化反应，得到所述7-(羧甲氧基)香豆素。
优选的，所述2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯的制备方法包括以下步骤：
将三(2-氨乙基)胺、二碳酸二叔丁酯和有机溶剂混合进行氨基保护，得到2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯。
优选的，所述7-(羧甲氧基)香豆素和所述2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯的摩尔比为(2～3):1。
优选的，所述中间体2和4-羧基苯硼酸的摩尔比为(1～1.5):1。
优选的，所述7-羟基香豆素和所述卤代乙酸的摩尔比为1:(4.5～5.5)。
本发明提供一种姜黄素动态共价复合物，具有式II所示结构：
本发明提供上述技术方案所述的姜黄素动态共价复合物的制备方法，包括以下步骤：
将苯硼酸衍生物、姜黄素和缓冲溶液混合发生配位反应，得到式II所述结构的姜黄素动态共价复合物；所述苯硼酸衍生物为权利要求1所述的香豆素修饰苯硼酸衍生物。
本发明提供上述技术方案所述的姜黄素动态共价复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供一种香豆素修饰苯硼酸衍生物，具有式I所示结构：
本发明提供的香豆素修饰苯硼酸衍生物，将4-羧基苯硼酸以三(2-氨乙基)胺为连接臂和两个香豆素羧酸衍生物连接成香豆素修饰苯硼酸衍生物，其结构中的硼羟基能够与姜黄素中的烯醇结构形成稳定的动态共价复合物，从而稳定姜黄素的烯醇结构，提高姜黄素的稳定性；同时，本发明提供的香豆素修饰苯硼酸衍生物中的香豆素结构能够与姜黄素协同增强对肿瘤细胞生长的抑制作用。
本发明提供上述技术方案所述的香豆素修饰苯硼酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：将7-(羧甲氧基)香豆素、2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯、偶联剂和有机溶剂混合发生缩合反应，得到式I-1所示结构的中间体1；将所述中间体1和三氟乙酸混合进行氨基脱保护，得到式I-2所示结构的中间体2；将所述中间体2、4-羧基苯硼酸、偶联剂、缩合剂和有机溶剂混合发生缩合反应，得到式I所示结构的香豆素修饰苯硼酸衍生物。本发明提供的制备方法成功以三(2-氨乙基)胺为连接臂将苯硼酸和两个香豆素羧酸衍生物连接生成香豆素修饰苯硼酸衍生物，制备方法简单易行，适宜工业生产。
本发明提供一种姜黄素动态共价复合物，具有式II所述结构：
本发明提供的姜黄素动态共价复合物，由姜黄素的中的烯醇结构与香豆素修饰苯硼酸衍生物中的硼羟基结构形成六元环的动态共价键，能够在中性环境(pH值为7.4)中有效保护姜黄素中烯醇结构的稳定性，当作用于肿瘤细胞时，在肿瘤细胞中姜黄素动态共价复合物中的六元环的动态共价键裂解，重新变为姜黄素和香豆素修饰苯硼酸衍生物，通过香豆素修饰苯硼酸衍生物中的香豆素结构与姜黄素协同增强了体外肿瘤细胞毒活性，抗肿瘤效果高，且对正常细胞的毒性小，提高了正常细胞存活率。
附图说明
图1为姜黄素的化学结构示意图；
图2为本发明实施例提供的香豆素修饰苯硼酸衍生物的合成路线流程图；
图3为本发明香豆素修饰苯硼酸衍生物与姜黄素动态共价复合物形成的紫外光度分析图谱；
图4为本发明姜黄素及香豆素修饰苯硼酸衍生物与姜黄素动态共价复合物的稳定性紫外光分析图谱；
图5为本发明姜黄素及香豆素修饰苯硼酸衍生物与姜黄素动态共价复合物在430nm波长处At/A0随时间变化图；
图6为本发明实施例提供的姜黄素动态共价复合物的体外细胞毒性实验评价图；
图7为本发明香豆素修饰苯硼酸衍生物与姜黄素动态共价复合物形成的示意图。
具体实施方式
本发明提供一种香豆素修饰苯硼酸衍生物，具有式I所示结构：
本发明提供的香豆素修饰苯硼酸衍生物是一种将4-羧基苯硼酸以三(2-氨乙基)胺为连接臂和两个香豆素羧酸衍生物连接成香豆素修饰的苯硼酸衍生物。
本发明提供的具有式I所示结构的香豆素修饰苯硼酸衍生物的化学名称为：(4-((2-(双(2-(2-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)乙酰氨基)乙基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯基)硼酸。
本发明提供了上述技术方案所述的香豆素修饰苯硼酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：
将7-(羧甲氧基)香豆素、2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯、偶联剂和有机溶剂混合发生缩合反应，得到式I-1所示结构的中间体1；
将所述中间体1和三氟乙酸混合进行氨基脱保护，得到式I-2所示结构的中间体2；
将所述中间体2、4-羧基苯硼酸、偶联剂、缩合剂和有机溶剂混合发生缩合反应，得到式I所示结构的香豆素修饰苯硼酸衍生物。
在本发明中，若无特殊说明，所用原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。
本发明将7-(羧甲氧基)香豆素、2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯、偶联剂(以下称为第一偶联剂)和有机溶剂(以下称为第一有机溶剂)混合(以下称为第一混合)发生缩合反应(以下称为第一缩合反应)，得到式I-1所示结构的中间体1；
在本发明中，所述7-(羧甲氧基)香豆素的制备方法优选包括以下步骤：
将7-羟基香豆素、卤代乙酸、催化剂、缚酸剂和有机溶剂(以下称为第二有机溶剂)混合(以下称为第二混合)发生醚化反应，得到所述7-(羧甲氧基)香豆素。
在本发明中，所述卤代乙酸具体优选为溴乙酸。
在本发明中，所述催化剂具体优选为碘化钾。
在本发明中，所述缚酸剂具体优选为碳酸钾。
在本发明中，所述第二有机溶剂具体优选为乙醇。
在本发明中，所述7-羟基香豆素和所述卤代乙酸的摩尔比优选为1:(4.5～5.5)，更优选为1:(4.8～5)。
在本发明中，所述7-羟基香豆素和所述催化剂剂的摩尔比优选为(15.2～15.8):1，更优选为15.48:1。
在本发明中，所述7-羟基香豆素和所述缚酸剂的摩尔比优选为1:(4.6～5.5)，更优选为1:(4.9～5)。
在本发明中，所述7-羟基香豆素的物质的量和所述第二有机溶剂的体积之比优选为6.5mmol:120mL。
在本发明中，所述第二混合的顺序优选为：将所述7-羟基香豆素、卤代乙酸和缚酸剂溶解于所述第二有机溶剂中得到混合溶液；将所述催化剂加入所述混合溶液中。
在本发明中，所述醚化反应优选为加热回流的条件下进行。
在本发明中，所述醚化反应优选在油浴条件下进行，所述油浴的温度优选为90～95℃，更优选为93℃。
在本发明中，所述醚化反应的保温时间优选为20～25h，更优选为22h。
在本发明中，所述醚化反应后得到醚化反应液，本发明优选对所述醚化反应液进行后处理，得到所述7-(羧甲氧基)香豆素。在本发明中，所述后处理优选为：稀释、调节pH值、去除第二有机溶剂、固液分离、洗涤和干燥。在本发明中，所述稀释优选为：将所述醚化反应液和水混合得到稀释反应液，在本发明中，所述水优选为蒸馏水，在本发明中，所述水和所述米花反应用第二有机溶剂的体积比优选为5:6。本发明优选采用pH调节剂调节所述稀释反应液的pH值至所述反应液的pH值优选为3，在本发明中，所述pH调节剂优选为1mol/L的盐酸。本发明优选将pH值优选为3的反应液去除第二有机溶剂，在本发明中，所述去除第二有机溶剂的具体方法优选为减压旋蒸，在本发明中，所述减压旋蒸的温度优选为室温。本发明优选将去除第二有机溶剂的反应液进行固液分离，在本发明中，所述固液分离的具体实施方式优选为过滤，所述过滤优选采用布氏漏斗进行。本发明优选对固液分离的固体产物进行洗涤，在本发明中，所述洗涤优选包括：依次进行水洗和乙烯醚洗，在本发明中，所述水洗优选为蒸馏水洗，在本发明中，所述水洗的次数优选为6次，所述乙醚洗的次数优选为4次。本发明对所述干燥的具体实施过程没有特殊要求。
在本发明中，所述2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯的制备方法优选包括以下步骤：
将三(2-氨乙基)胺、二碳酸二叔丁酯和有机溶剂(以下称为第三有机溶剂)混合(以下称为第三混合)进行氨基保护，得到2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯。
在本发明中，所述第三有机溶剂具体优选为1,4-二氧六环。
在本发明中，所述二碳酸二叔丁酯和三(2-氨乙基)胺的摩尔比优选为1:(6～6.5)，更优选为1:6.36。
在本发明中，所述二碳酸二叔丁酯的物质的量和所述第三有机溶剂的体积之比优选为5.5mmol:60mL。
在本发明中，所述第三混合优选为：将所述二碳酸二叔丁酯溶解于部分第三有机溶剂中，得到二碳酸二叔丁酯溶液；将三(2-氨乙基)胺溶解于剩余第三有机溶剂中，得到三(2-氨乙基)胺溶液，将所述三(2-氨乙基)胺溶液加入所述二碳酸二叔丁酯溶液中。在本发明中，所述部分第三有机溶剂和剩余第三有机溶剂的体积比优选为1:1。
在本发明中，所述氨基保护优选在保护气氛中进行。
在本发明中，所述保护气氛优选为氮气气氛。
在本发明中，所述氨基保护优选在室温条件下进行。
在本发明中，所述氨基保护的反应时间优选为15～20h，更优选为17h。
在本发明中，所述氨基保护反应后得到氨基保护反应液，本发明优选对所述氨基保护反应液进行后处理，得到所述2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯。在本发明中，所述后处理优选包括：依次进行去除第三有机溶剂、溶解、萃取、合并有机相、去除有机萃取剂和纯化。在本发明中，所述去除第三有机溶剂的具体方法优选为减压旋蒸，在本发明中，所述减压旋蒸的温度优选为室温。本发明优选将去除第二有机溶剂的粘性产物加水溶剂，所述水优选为蒸馏水，本发明优选对所述溶解后的浑浊液进行萃取，在本发明中，所述萃取用有机萃取剂优选为二氯甲烷。在本发明中，所述萃取的次数优选为6次。本发明合并萃取有机相得到萃取液，本发明优选采用减压蒸发去除萃取液中的有机萃取剂，在本发明中，所述减压蒸发的温度优选为室温。在本发明中，所述纯化优选为柱层析纯化。
在本发明中，所述第一偶联剂具体优选为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)。
在本发明中，所述有机碱具体优选为三乙胺。
在本发明中，所述第一有机溶剂具体优选为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
在本发明中，所述7-(羧甲氧基)香豆素和所述2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯的摩尔比优选为(2～3):1，更优选为(2.2～2.7):1。
在本发明中，所述7-(羧甲氧基)香豆素和所述第一偶联剂的摩尔比优选为4.5:4.1。
在本发明中，所述7-(羧甲氧基)香豆素和所述有机碱的摩尔比优选为4.5:4
在本发明中，所述7-(羧甲氧基)香豆素的物质的量和所述第一有机溶剂的体积之比优选为4.5mmol:14mL。
在本发明中，所述第一混合的顺序优选为：将所述7-(羧甲氧基)香豆素和偶联剂溶剂于部分第一有机溶剂中，得到混合溶液；将2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯溶解于剩余第一有机溶剂中，得到2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯溶液，将2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯溶液、有机碱加入所述混合溶液中。在本发明中，所述部分第一有机溶剂和剩余第一有机溶剂的体积比优选为5:2。
在本发明中，所述第一缩合反应优选在油浴条件下进行，所述油浴的温度优选为50℃。
在本发明中，所述第一缩合反应的保温时间优选为24h。
在本发明中，所述第一缩合反应优选在保护气氛中进行，所述保护气氛优选为氮气。
在本发明中，所述第一缩合反应得到第一缩合反应液，本发明优选对所述第一缩合反应液进行后处理，得到式I-1所示结构的中间体1。在本发明中，所述后处理优选包括依次进行：沉淀、固液分离、干燥和纯化。在本发明中，所述沉淀的具体实施方式优选为：将所述第一缩合反应液和饱和冰盐水混合，在本发明中，所述饱和冰盐水和所述第一有机溶剂的体积比优选为7:75。在本发明中，所述固液分离的固体实施方式优选为过滤。本发明优选对所述固液分离的固体产物进行干燥，本发明对所述干燥的具体实施过程没有特殊要求。在本发明中，所述纯化优选为柱层析纯化。
在本发明中，所述中间体1的化学名称为(2-(双(2-(2-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)乙酰氨基)乙基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
得到所述中间体1后，本发明将所述中间体1和三氟乙酸混合(以下称为第四混合)进行氨基脱保护，得到式I-2所示结构的中间体2；
在本发明中，所述中间体1和三氟乙酸的摩尔比优选为1:27。
在本发明中，所述第四混合具体优选为将所述中间体1溶解于所述三氟乙酸中。
在本发明中，所述氨基脱保护优选在室温条件下进行。
在本发明中，所述氨基脱保护优选在搅拌的条件下进行，本发明惰所述搅拌的具体实施过程没有特殊要求。
在本发明中，所述氨基脱保护的反应时间优选为4h。
在本发明中，所述氨基脱保护得到脱保护液，本发明优选对所述脱保护液进行后处理，得到所述中间体2。在本发明中，所述后处理优选包括：依次中和、抽气和纯化。在本发明中，所述中和具体优选为：将所述脱保护反应和氨水混合，在本发明中，所述脱保护反应和氨水混合优选在冰水浴中进行，在本发明中，所述氨水的浓度优选为15mol/L，所述氨水和所述三氟乙酸的体积比具体优选为1:2。在本发明中，所述抽气优选采用水泵将中和产生的发亮抱怨抽除，在本发明中，所述抽气的时间优选为20min。本发明优选对中和得到的固体产物进行纯化，在本发明中，所述纯化优选为柱层析纯化。
在本发明中，所述中间体2的化学名称为：N,N'-(((2-氨基乙基)氮杂二基)双(乙烷-2,1-二基))双(2-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)乙酰胺)。
得到所述中间体2后，本发明将所述中间体2、4-羧基苯硼酸、偶联剂(以下称为第二偶联剂)、缩合剂和有机溶剂(以下称为第四有机溶剂)混合(以下称为第五混合)发生缩合反应(以下称为第二缩合反应)，得到式I所示结构的香豆素修饰苯硼酸衍生物。
在本发明中，所述第二偶联剂具体优选为HBTU。
在本发明中，所述缩合剂具体优选为N,N-二异丙基乙胺。
在本发明中，所述第四有机溶剂具体优选为DMF。
在本发明中，所述中间体2和4-羧基苯硼酸的摩尔比为(1～1.5):1，更优选为(1.2～1.45):1。
在本发明中，所述中间体2和所述第二偶联剂的摩尔比优选为1.2:1。
在本发明中，所述中间体2和所述缩合剂的摩尔比优选为1.2:1。
在本发明中，所述中间体2的物质的量和所述第四有机溶剂的体积之比优选为0.36mmol:5mL。
在本发明中，所述第五混合的顺序优选为：将所述中间体2和第二偶联剂溶剂于第四有机溶剂中，得到混合溶液；将缩合剂和4-羧基苯硼酸加入所述混合溶液中。
在本发明中，所述第二缩合反应优选在室温条件下进行。
在本发明中，所述第二缩合反应的时间优选为20h。
在本发明中，所述第二缩合反应优选搅拌的条件在进行。
在本发明中，所述第二缩合反应得到第二缩合反应液，本发明优选对所述第二缩合反应液进行后处理，得到式I所示结构的香豆素修饰苯硼酸衍生物。在本发明中，所述后处理优选包括：依次进行沉淀、固液分离、干燥和纯化。在本发明中，所述沉淀的具体实施方式优选为：将所述第二缩合反应液和饱和冰盐水混合，在本发明中，所述饱和冰盐水和所述第四有机溶剂的体积比优选为20:1。在本发明中，所述固液分离的固体实施方式优选为过滤。本发明优选对所述固液分离的固体产物进行干燥，本发明对所述干燥的具体实施过程没有特殊要求。在本发明中，所述纯化优选为柱色谱纯化，所述柱色谱纯化优选为氧化铝柱色谱纯化。
本发明提供一种姜黄素动态共价复合物，具有式II所述结构：
本发明提供上述技术方案所述的姜黄素动态共价复合物的制备方法，包括以下步骤：
将苯硼酸衍生物、姜黄素和有机缓冲溶液混合(以下称为第六混合)发生配位反应，得到式II所述结构的姜黄素动态共价复合物；所述苯硼酸衍生物为上述技术方案所述的香豆素修饰苯硼酸衍生物。
在本发明中，所述苯硼酸衍生物和姜黄素的摩尔比优选为(1～5):1，优选为1:1。
在本发明中，所述有机缓冲溶液具体优选为甲醇的磷酸盐缓冲溶液，或甲醇的磷酸盐缓冲溶液和二甲基亚砜(DMSO)的磷酸盐缓冲溶液的混合缓冲溶液。
在本发明中，所述第六混合的顺序优选为：将苯硼酸衍生物和部分有机缓冲溶液混合得到苯硼酸衍生物缓冲液，将姜黄素和剩余有机缓冲溶液混合，得到姜黄素缓冲溶液，将苯硼酸衍生物缓冲液和姜黄素缓冲溶液混合。
在本发明中，所述配位反应优选在室温条件下进行。
本发明提供了上述技术方案所述的姜黄素动态共价复合物或上述技术方案所述的制备方法制备得到的姜黄素动态共价复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
在本发明中，所述抗肿瘤药物优选为抗结肠癌药物、抗肺癌药物或抗乳腺癌药物。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
按照图2所示的流程图，将7-羟基香豆素(图2中的化合物1)(1.05g，6.5mmol)，溴乙酸(4.48g，32.2mmol)，碳酸钾(4.46g，32.3mmol)溶于乙醇(120mL)中，加入碘化钾(0.07g，0.42mmol)，溶液浑浊，有灰色、白色沉淀。在93℃的油浴下冷凝回流22h，溶液由灰色变为黄绿色，最后变为白色溶液。静置发现上层为黄绿色有荧光物质，下层为白色沉淀。之后加入蒸馏水(100mL)，用1mol/L盐酸将溶液pH调至3，室温下减压旋干乙醇，用布氏漏斗过滤，再用蒸馏水(7mL)洗涤固体6次和用乙醚(6mL)洗涤固体4次后干燥，形成灰白色固体为7-(羧甲氧基)香豆素(图2中的化合物2)，质量为1.31g，收率为92％。[M-H]-理论值219.17，实际测量值219.62。
将二碳酸二叔丁酯(1.20g，5.5mmol)溶于1，4-二氧六环(30mL)，缓慢加入溶于1，4-二氧六环(30mL)的三(2-氨乙基)胺(5.1g，35mmol)，溶液变浑浊，产生白色沉淀。之后利用水泵抽走空气，氮气袋使茄瓶充满氮气，重复三次，在室温下搅拌反应17h。反应结束后将反应液在室温下减压旋干，变成乳白色粘稠状液体，用蒸馏水(5mL)溶解，变为白色混浊状溶液。用二氯甲烷(30mL)萃取6次，上层水相为淡黄色澄清溶液，下层为无色澄清溶液。合并有机层，用旋转蒸发仪室温减压旋干二氯甲烷，形成淡黄色稠油，之后用柱层析进行纯化。最终形成淡黄色稠油0.80g，得到2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯(图2中的化合物3)，收率为59％。[M+H]+理论值247.21,实际测量值247.21。
将图2中的化合物2(0.98g，4.5mmol)与O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(1.54g，4.1mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(10mL)中，溶液呈橙黄色略有白色沉淀。加入三乙胺(560μL，4.0mmol)和溶于N，N-二甲基甲酰胺(4mL)的化合物3(0.50g，2.0mmol)。之后利用水泵抽走空气，氮气袋使茄瓶中充满氮气，重复三次，在油浴50℃下加热反应24h。反应结束后，用饱和冰盐水(150mL)沉淀，过滤，将滤渣干燥后进行柱层析纯化。最终形成白色固体0.75g，得到中间体1(化学名称2-(双(2-(2-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)乙酰氨基)乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯，图2中的化合物4)，收率为58％。[M+H]+理论值651.2661，实际测量值651.2678。
将图2中的化合物4(0.65g，1.0mmol)溶于三氟乙酸(2mL，27mmol)中，室温下搅拌反应4h，反应结束后在冰浴下加入氨水(1mL，15mol/L)，溶液产生大量白烟后变为黄色固体。之后用水泵进行抽气，抽气20min。之后进行柱层析纯化。最终形成白色固体0.50g，得到中间体2,(化学名称N,N'-(((2-氨基乙基)氮杂二基)双(乙烷-2,1-二基))双(2-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)乙酰胺，图2中的化合物5)，收率为92％。[M+H]+理论值为551.2136.，实际测量值551.2125。
将图2中的化合物5(0.20g，0.36mmol)和HBTU(0.039g，0.30mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中，之后加入N,N-二异丙基乙胺(50μL，0.30mmol)，加入4-羧基苯硼酸(0.05g，0.30mmol)，溶液呈淡黄色澄清溶液。室温下搅拌反应20h。之后用饱和冰盐水(100mL)沉淀，之后干燥，进行柱色谱(氧化铝)纯化。最终形成98mg白色粉末状固体，得到式I所示结构的香豆素修饰苯硼酸衍生物(化学名称为(4-((2-(双(2-(2-((2-氧代-2H-色烯-7-基)氧基)乙酰氨基)乙基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苯基)硼酸，图2中的化合物6)，收率为43％。[M+H]+理论值为698.24，实际测量值699.40。1HNMR(300MHz，DMSO-d6):δ/ppm＝8.619(s，1H)，8.299(s,2H),8.173(s,2H),7.942(d，J＝9.6Hz，2H)，7.808(s,4H),7.579(d，J＝8.4Hz，2H)，6.916(d，J＝8.1Hz，4H)，6.249(d，J＝9.6Hz，2H)，4.610(s，4H)，3.196(d，J＝5.7Hz，6H)，2.607(m，6H)。13CNMR(75MHz，DMSO-d6):δ/ppm＝167.131,166.873,161.147，160.610，155.566,144.614，136.237，134.327，129.898，126.413，113.275，113.048，102.144，67.643，63.260，53.603，38.062，37.282。
实施例2
称取姜黄素溶于pH＝7.40的含40％(体积比)甲醇的磷酸盐缓冲溶液中，制成姜黄素溶液(姜黄素的摩尔浓度为2.0×10-5mol/L)，称取香豆素修饰苯硼酸衍生物溶于pH＝7.40的含2％(体积比)的二甲基亚砜(DMSO)的磷酸盐缓冲溶液中，制成香豆素修饰苯硼酸衍生物(香豆素修饰苯硼酸衍生物的摩尔浓度为2.0×10-5mol/L)，将姜黄素溶液和香豆素修饰苯硼酸衍生物在室温条件下混合，得到姜黄素动态共价复合物。
测试例1
对本发明实施例1制备的式I所示结构的香豆素修饰苯硼酸衍生物与姜黄素进行紫外光度分析。
实验方法为：称取姜黄素溶于pH＝7.40的含40％(体积比)甲醇的磷酸盐缓冲溶液中，制成储备液A1，称取香豆素修饰苯硼酸衍生物溶于pH＝7.40的含2％的DMSO(体积比)的磷酸盐缓冲溶液中，制成储备液A2，储备液A2中。
将储备液A1和A2混合后得到一系列的待测溶剂，其中待测溶液中，姜黄素的摩尔浓度均为为2.0×10-5mol/L，香豆素修饰苯硼酸衍生物的摩尔浓度分别为0、0.3×10-5mol/L、0.4×10-5mol/L、0.8×10-5mol/L、1.4×10-5mol/L、1.6×10-5mol/L、1.8×10-5mol/L和2.0×10-5mol/L，于常温下保存2h后测量紫外吸收强度。
测试结果可见图3，结果表明由图可以看出，在pH＝7.40时，随着香豆素修饰苯硼酸衍生物浓度的增加，姜黄素的紫外吸收强度也在逐渐增强，说明香豆素修饰苯硼酸衍生物与姜黄素通过结合作用形成了配合物。并且根据Benesi–Hildebrand公式可以计算出结合常数Ka，姜黄素与香豆素修饰苯硼酸衍生物的结合常数为Ka＝(2.7±1.0)×104M-1。
测试例2
考察香豆素修饰苯硼酸衍生物对姜黄素稳定性的影响
称取姜黄素溶于pH＝7.40的含50％(体积比)甲醇的磷酸盐缓冲溶液中，制成储备液B1。称取香豆素修饰苯硼酸衍生物溶于pH＝7.40的含50％(体积比)的甲醇的磷酸盐缓冲溶液中，制成储备液B2。称取香豆素修饰苯硼酸衍生物溶于pH＝7.40的含50％(体积比)甲醇的磷酸盐缓冲溶液中，制成储备液B3。将储备液分别按照规定量混合后，立即上机测量紫外吸收强度。
结果可见图4和图5所示，图4为姜黄素及香豆素修饰苯硼酸衍生物与姜黄素动态共价复合物随时间变化的紫外光谱，图5为姜黄素及香豆素修饰苯硼酸衍生物与姜黄素动态共价复合物在430nm波长处At/A0随时间变化图；由图4和图5的结果表明可以看出，香豆素修饰苯硼酸衍生物和姜黄素形成的姜黄素动态共价复合物在pH 7.40条件下的稳定性明显高于姜黄素，因此，香豆素修饰苯硼酸衍生物能够显著提高姜黄在pH 7.40条件下的稳定性。
测试例3
评价香豆素修饰苯硼酸衍生物与姜黄素形成的复合物体外细胞毒性(MTT法)
取处于对数生长期且生长状态良好的HCT116、A549、MCF-7细胞以2×104个/mL的浓度和NCM460细胞以3.5×104个/mL的浓度接种在96孔板中，边缘孔用100μL无菌PBS填充，剩下用排枪每孔接种100μL细胞悬液，接种每排细胞前摇匀细胞悬液，避免因重力沉降导致细胞密度不均。在5％CO2、37℃的孵箱中培养12h至60％左右细胞贴壁后，每孔加入25μL不同浓度含药培养基，共设置6个浓度(10×10-6mol/L、20×10-6mol/L、30×10-6mol/L、40×10-6mol/L、50×10-6mol/L和60×10-6mol/L)，每个浓度设置8个副孔。给药后轻拍96孔板使样品均匀分散，之后继续在5％CO2、37℃的孵箱中培养72h。之后每孔在避光情况下，加入25μLMTT溶液(2.5mg/mL用无菌PBS配制，pH＝7.4)，继续在5％CO2、37℃的孵箱中培养4h后终止培养，用排枪小心地吸去孔内培养基，每孔中加入DMSO(150μL)溶液放置37℃摇床中震荡15min，待每孔中甲臜完全溶解，用酶标仪检测每孔在570nm处的吸光度值(O.D.值)。采用Origin Pro 2018和SPSS 24.0软件进行数据处理和作图。计算公式为：细胞存活率(％)＝(实验组平均O.D.值–空白组平均O.D.值)/(对照组平均O.D.值-空白组平均O.D.值)×100％。
结果可见图6，图6为不同浓度条件下香豆素修饰苯硼酸衍生物(记为化合物6)、姜黄素和香豆素修饰苯硼酸衍生物与姜黄素形成的复合物处理的A549、MCF-7、HCT116、NCM460细胞72h后细胞生存率情况。
由图6可以看出在实验浓度下姜黄素、姜黄素动态共价复合物(姜黄素：香豆素修饰苯硼酸衍生物摩尔比为1:1)处理MCF-7，A549及HCT116肿瘤细胞72h后均对肿瘤细胞有一定生长抑制作用。相同浓度下，经过统计学检验，P<0.05，姜黄素动态共价复合物组与姜黄素组之间差异具有统计学意义，且姜黄素动态共价复合物对肿瘤细胞生长抑制能力优于单独姜黄素。说明本发明提供的姜黄素动态共价复合物具有更强的体外抑制肿瘤生长的活性。此外，姜黄素动态共价复合物(姜黄素：姜黄素动态共价复合物摩尔比为1:1)在给定的实验浓度范围(10×10-6～60×10-6mol/L)内对正常结肠上皮细胞NCM460表现出比姜黄素更低的毒性。
本发明合成的香豆素修饰苯硼酸衍生物不仅可以通过硼羟基与姜黄素形成动态共价复合物提高姜黄素的稳定性，而且通过香豆素与姜黄素协同增强体外肿瘤细胞毒活性，提高正常细胞存活率。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种香豆素修饰苯硼酸衍生物，其特征在于，具有式I所示结构：
2.权利要求1所述的香豆素修饰苯硼酸衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将7-(羧甲氧基)香豆素、2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯、偶联剂、有机碱和有机溶剂混合发生缩合反应，得到式I-1所示结构的中间体1；
将所述中间体1和三氟乙酸混合进行氨基脱保护，得到式I-2所示结构的中间体2；
将所述中间体2、4-羧基苯硼酸、偶联剂、缩合剂和有机溶剂混合发生缩合反应，得到式I所示结构的香豆素修饰苯硼酸衍生物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述7-(羧甲氧基)香豆素的制备方法包括以下步骤：
将7-羟基香豆素、卤代乙酸、催化剂、缚酸剂和有机溶剂混合发生醚化反应，得到所述7-(羧甲氧基)香豆素。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯的制备方法包括以下步骤：
将三(2-氨乙基)胺、二碳酸二叔丁酯和有机溶剂混合进行氨基保护，得到2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述7-(羧甲氧基)香豆素和所述2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯的摩尔比为(2～3):1。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述中间体2和4-羧基苯硼酸的摩尔比为(1～1.5):1。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述7-羟基香豆素和所述卤代乙酸的摩尔比为1:(4.5～5.5)。
8.一种姜黄素动态共价复合物，其特征在于，具有式II所示结构：
9.权利要求8所述的姜黄素动态共价复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将苯硼酸衍生物、姜黄素和缓冲溶液混合发生配位反应，得到式II所述结构的姜黄素动态共价复合物；所述苯硼酸衍生物为权利要求1所述的香豆素修饰苯硼酸衍生物。
10.权利要求8所述的姜黄素动态共价复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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